Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Summary

Qui descriviamo un approccio microscopico a foglio leggero per visualizzare l'infiltrato cardiovascolare CD45 ⁺ in un modello murino di miocardite fulminante asettica, che è indotto dal trattamento tossicolare intracellulare di tenebre di topi CD11c.DTR.

Abstract

La microscopia a fluorescenza a foglio leggero (LSFM), in combinazione con i protocolli chimici di compensazione, è diventata la norma d'oro per l'analisi di strutture a marchio fluorescente in grandi campioni biologici e si riduce alla risoluzione cellulare. Nel frattempo, la costante raffinazione dei protocolli sottostanti e la maggiore disponibilità di sistemi commerciali specializzati ci permettono di indagare sulla microstruttura di interi organi del mouse e permetterebbe anche la caratterizzazione del comportamento cellulare in vari approcci di immagini a cellule vive. Qui descriviamo un protocollo per la visualizzazione spaziale spaziale e la quantificazione della popolazione leucocitaria CD45 ⁺ nei cuori infiammati del topo. Il metodo utilizza un ceppo di topi transgenici (CD11c.DTR) che è stato recentemente dimostrato di essere un modello robusto e indicibile per lo studio dello sviluppo di miocardite fatale fulminante caratterizzato da aritmie cardiache letali. Questo protocollo comprende l'induzione del miocardite, intravitColorazione delle cellule mediate dall'anticorpo, preparazione dell'organo e LSFM con successiva elaborazione post-elaborazione di immagini assistite da computer. Anche se presentato come metodo altamente adattato per la nostra particolare questione scientifica, il protocollo rappresenta il progetto di un sistema facilmente regolabile che può anche orientare completamente differenti strutture fluorescenti in altri organi e anche in altre specie.

Introduction

Durante l'evoluzione della microscopia leggera, sono apparse molte forme specializzate, tutte sviluppate per minimizzare le limitazioni nel processo di visualizzazione di particolari campioni. Uno di questi è la microscopia a fluorescenza a foglio leggero (LSFM). In primo luogo sviluppato nel 1903 da Siedentopf e Zsigmondy ¹ e trovando le prime applicazioni biologiche fondamentali nei primi anni 1990 ² , LSFM è divenuto lo strumento microscopico più potente fino ad oggi per la visualizzazione di grandi esemplari, come gli organi del topo intasati, con una risoluzione del segnale di fluorescenza Fino al livello cellu....

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità agli orientamenti dell'UE e sono stati approvati dalle autorità locali competenti di Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Germania). Gli animali sono stati utilizzati e alloggiati in condizioni specifiche senza patogeni (SPF).

1. Induzione della Myocardite da Tossina Difteria (DTX)

1. Preparare la soluzione DTX per l'induzione della miocardite diluendo la soluzione di base DTX con soluzione salina fosfatizzata (PBS) a una soluzione di lavoro di 1 μg / mL.
2. Applicare ....

Results

L'approccio presentato LSFM analizza la distribuzione e la quantità di leucociti nei cuori murini dopo l'induzione di una mieloma grave. La figura 1A spiega il protocollo di pre-trattamento per i topi transgenici CD11c.DTR per l'induzione di miocardite. Questo passo rappresenta il trigger necessario per l'assunzione di leucociti nel miocardio. Dopo un'applicazione DTX di successo, gli animali sviluppano gravi sintomi di malattia, come la debolezza generale, l'anoressia e.......

Discussion

Nella scienza della vita moderna, la visualizzazione microscopica dei processi biologici svolge un ruolo sempre più importante. In questo contesto, negli ultimi due secoli sono stati raggiunti molti sviluppi che aiutano a rispondere a domande indesiderabili fino a questo punto,. In primo luogo, c'è stata una chiara tendenza ad aumentare fondamentalmente la capacità di risoluzione dei microscopi leggeri. Con microscopia strutturata microscopia (SIM) ^{21 , 22} ,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
tossina difterica	Sigma Aldrich	D0564
soluzione salina tamponata con fosfato	Biochrom	L182-10
ketamina [50 mg/mL]	Inresa	PZN 4089014
xilazina [2 %]	Siringa Ceva
	Braun	REF 9161502	Braun Omincan F
catetere venoso abitato	Respiratore per piccoli animali Becton Dickinson	REF 381923	BD Insyte Autoguard
	Harvard Apparatus	73-0044	Anticorpo MiniVent
anit-CD45 (AF647)	BioLegend	103124
acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) sale disodico diidrato	Carl Roth	8043.2
(21 G)	BD Biosciences	REF 387455	BD valu-set
paraformaldeide	Sigma Aldrich	P6148
Tubo PE (5 mL)	Carl Roth	EKY9.1	Rotilabo
etanolo	Carl Roth	9065.4
dibenzil etere	Sigma-Aldrich	108014
rotatore per tubi	Miltenyi Biotec	130-090-753	MACSmix
agarosio (bassa gelificazione)	Sigma Aldrich	Stampo A4018
(15 x 15 x 5 mm)	Tissue Tek	4566	Cryomold
sistema di microscopio a foglio luminoso	LaVision Biotec		Ultramicroscope
corpo del	microscopio Olympus		MVX10
obiettivo	Olimpo		0,5  NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5  mm
Fotocamera sCMOS 5.5MP	Andor Technology
488 nm Laser OPSL (50mW)	Laser a
647 nm  (50mW)	Software coerente
di elaborazione e analisi delle immagini 3D	Bitplane		IMARIS Ver. 8.3
ceppo di topo transgenico	Steffen Jung et al.		CD11c.DTR
wt ceppo di topo	Envigo		Balb/c Ola Hsd J
Modulo laser	LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Obiettivo