Articolo metodologico

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

DOI:

10.3791/55450

⸱

31 maggio 2017

 ,  ,  , 
1Department of Translational Skin Cancer Research, University of Duisburg/Essen, 2Institute for Experimental Immunology and Imaging, University of Duisburg/Essen, 3Imaging Center Essen, Electron Microscopy Unit, University Hospital of Essen

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo un approccio microscopico a foglio leggero per visualizzare l'infiltrato cardiovascolare CD45 + in un modello murino di miocardite fulminante asettica, che è indotto dal trattamento tossicolare intracellulare di tenebre di topi CD11c.DTR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia a fluorescenza a foglio leggero (LSFM), in combinazione con i protocolli chimici di compensazione, è diventata la norma d'oro per l'analisi di strutture a marchio fluorescente in grandi campioni biologici e si riduce alla risoluzione cellulare. Nel frattempo, la costante raffinazione dei protocolli sottostanti e la maggiore disponibilità di sistemi commerciali specializzati ci permettono di indagare sulla microstruttura di interi organi del mouse e permetterebbe anche la caratterizzazione del comportamento cellulare in vari approcci di immagini a cellule vive. Qui descriviamo un protocollo per la visualizzazione spaziale spaziale e la quantificazione della popolazione leucocitaria CD45 + nei cuori infiammati del topo. Il metodo utilizza un ceppo di topi transgenici (CD11c.DTR) che è stato recentemente dimostrato di essere un modello robusto e indicibile per lo studio dello sviluppo di miocardite fatale fulminante caratterizzato da aritmie cardiache letali. Questo protocollo comprende l'induzione del miocardite, intravitColorazione delle cellule mediate dall'anticorpo, preparazione dell'organo e LSFM con successiva elaborazione post-elaborazione di immagini assistite da computer. Anche se presentato come metodo altamente adattato per la nostra particolare questione scientifica, il protocollo rappresenta il progetto di un sistema facilmente regolabile che può anche orientare completamente differenti strutture fluorescenti in altri organi e anche in altre specie.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durante l'evoluzione della microscopia leggera, sono apparse molte forme specializzate, tutte sviluppate per minimizzare le limitazioni nel processo di visualizzazione di particolari campioni. Uno di questi è la microscopia a fluorescenza a foglio leggero (LSFM). In primo luogo sviluppato nel 1903 da Siedentopf e Zsigmondy 1 e trovando le prime applicazioni biologiche fondamentali nei primi anni 1990 2 , LSFM è divenuto lo strumento microscopico più potente fino ad oggi per la visualizzazione di grandi esemplari, come gli organi del topo intasati, con una risoluzione del segnale di fluorescenza Fino al livello cellulare. A causa di questi vantaggi, in combinazione con il suo potenziale per l'imaging a cellule vive, i metodi di natura denominati LSFM sono "il metodo dell'anno 2014 3 ".

Come suggerisce il nome, l'illuminazione del campione in un LSFM è condotta da fogli leggeri, orientati perpendicolarmente all'asse dell'obiettivo utilizzatoO la raccolta di emissioni e la formazione di immagini successive. Il foglio leggero viene generalmente generato sia concentrandosi su ampie fasce laser collimate con una lente cilindrica o con il rapido movimento laterale di fasci laser concentrati e concentrati in un solo piano orizzontale o verticale 4 , 5 . In questo modo, solo il piano focale delle ottiche di imaging viene illuminato, tipicamente con uno spessore di 1-4 μm. Di conseguenza, per un campione fluorescente posizionato nel piano di illuminazione, sia la generazione di luce sparsa che gli effetti della fotolibrazione dalle regioni superiori o inferiori al piano focale vengono eliminati o soppressi in modo significativo 6 , 7 . Poiché tutti i piani fuori fuoco non sono illuminati, in questi settori vengono omessi effetti di fotocolorazione. In contrasto con la microscopia standard confocale o multi-fotonica, i percorsi della luce illuminata e emessa sono separati l'uno dall'altro, quindi l'immagine finale di qual La funzione non dipende dalla messa a fuoco perfetta del fascio luminoso di eccitazione attraverso gli obiettivi. A seconda della questione sottostante, è quindi possibile utilizzare obiettivi con un campo di visibilità enorme (FOV) in modo che la più grande area possibile del piano illuminato possa essere ripresa senza che parte dei componenti si muovano nella direzione xy.

Nei moderni sistemi LSFM, un'immagine fluorescente della sezione ottica generata viene catturata su un dispositivo di accoppiamento altamente sensibile (CCD) o da telecamere a semiconduttore metallico-ossidi metallici (CMOS) complementari che sono in grado di acquisire l'intero campo di visualizzazione (FOV) In microsecondi. Pertanto, spostando il campione attraverso il foglio di luce e acquisendo immagini a z-step definite, è possibile ottenere le informazioni 3D complete di un esemplare in una ragionevole quantità di tempo 8 , 9 , rendendo questa tecnica applicabile a cellule vive Studi 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .

Tuttavia, anche se LSFM offre un metodo rapido, sensibile e fluorescente, la trasmissione della luce attraverso il campione è ancora un problema importante, specialmente quando i grandi campioni biologici sono l'obiettivo di un'analisi 3D. La trasmissione della luce è criticamente modificata dagli aspetti fisici dell'assorbimento e dalla dispersione della luce nelle interfacce di strutture con differenti indici di rifrazione 13 . Pertanto, quando si esegue l'esame di campioni diversi millimetri di dimensioni, LSFM è per lo più combinato con protocolli di compensazione per rendere i campioni otticamente trasparenti. Queste tecniche si basano sull'idea di rimuovere l'acqua dal rispettivo tessuto biologico e scambiandola con mezzi di immersione a base di solventi a base di acqua o (organica), scelti per adattarsi strettamente agli indici di rifrazione dei particolari componenti del tessuto bersaglio. Di conseguenza, la dispersione della luce laterale viene minimizzata e tutte le lunghezze d'ondaDella luce può passare molto più efficacemente attraverso il tessuto 13 . In molti casi, i campioni biologici trattati in questo modo appaiono macroscopicamente cristallini, che consentono di condurre LSFM, anche su interi organi del mouse, utilizzando lunghi obiettivi di ingrandimento a distanza di lavoro e di basso livello.

Qui presentiamo un protocollo di preparazione per l'imaging di grandi dimensioni in un microscopio a foglio leggero (vedi tabella dei materiali), che abbiamo stabilito per indagare l'infiltrato cardiaco cellulare in un modello murino di miocardite 15 . I topi CD11c.DTR esprimono il recettore della tossina della difterite primata (DTR) sotto il controllo del promotore CD11c 16 . Di conseguenza, le cellule in questi topi, che esprimono CD11c insieme al DTR, sono rese sensibili all'esotossina della difterite di Corynebacterium (tossina della difterite, DTX); Il trattamento sistemico di questi animali con DTX comporta un esaurimento di tutti i CD11c + ceLLS. CD11c è un integrin e, come ricettore di superficie cellulare per una varietà di diversi fattori solubili, è coinvolto nei processi di attivazione e di maturazione principalmente nelle cellule del linfociti monocitico 17 . Di conseguenza, il modello del mouse del CD11c.DTR è stato intensamente utilizzato per studiare il ruolo delle cellule dendritiche e dei sottosettori di macrofagi nel contesto di molte domande immunologiche diverse. Nel tempo, è stato riportato che i topi CD11c.DTR trattati sistematicamente con DTX possono sviluppare effetti collaterali avversi e possono mostrare elevati tassi di mortalità 18 , 19 . Recentemente siamo stati in grado di identificare la causa di morte 15 che descrive lo sviluppo della miocardite fulminante dopo l'applicazione intratracheale di DTX in questi animali. La sfida della tossina ha causato la distruzione cellulare, anche nelle parti centrali del sistema di trasmissione dello stimolo nel cuore. Questo è stato accompagnato da un massiccio CD45+ Leucociti infiltrano, portando finalmente ad aritmie cardiache letali. In questo caso, non solo era importante l'aspetto della popolazione leucocitaria, ma anche la sua distribuzione spaziale all'interno del cuore. Questa domanda sperimentale è una sfida per la moderna imaging microscopica, che abbiamo risolto con un approccio microscopico a fogliame leggero, supportato da una colorazione anticorpale intravitale e da un protocollo di depurazione ottica a base solvente.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità agli orientamenti dell'UE e sono stati approvati dalle autorità locali competenti di Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Germania). Gli animali sono stati utilizzati e alloggiati in condizioni specifiche senza patogeni (SPF).

1. Induzione della Myocardite da Tossina Difteria (DTX)

  1. Preparare la soluzione DTX per l'induzione della miocardite diluendo la soluzione di base DTX con soluzione salina fosfatizzata (PBS) a una soluzione di lavoro di 1 μg / mL.
  2. Applicare 100 μL di questa soluzione intratrachealmente in topi CD11c.DTR da 8 a 10 settimane ( circa 5 ng / g di peso corporeo), come mostrato da Hasenberg et al. Per l'applicazione di una sospensione spore fungina 20 .
    NOTA: L'applicazione intraperitoneale della tossina potrebbe determinare una simile induzione diMiocardite fatale. Tuttavia, questo approccio dovrebbe prima essere convalidato.
    1. Per questa applicazione, anestetizzano gli animali con un'iniezione intraperitoneale (ip) di 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg di xilazina bw.
    2. Dopo aver raggiunto la narcosi profonda (intestino gli animali utilizzando un catetere venoso indotto da 22 G attraverso la cavità orale. Controllare il corretto posizionamento del tubo dell'obiettivo ventilando gli animali con un respiratore di piccole animali a una velocità di 250 breath per min e un volume di inalazione di 250 μl per respiro, anche mostrato da Hasenberg et. al. 20 .
      NOTA: quando viene posizionato correttamente, la frequenza di respirazione degli animali cambia in base alle impostazioni di ventilazione applicate.
    3. Scollegare il sistema di ventilazione e infondere 100 μL di soluzione DTX o uguale quantità di PBS come un controllo attraverso il catetere nel polmone e continuare a ventilare gli animali per un ulteriore min.
  3. Lasciate che gli animali si riprendano da anestesia e controllino lo stato di salute generale e il cambiamento di peso corporeo per 4 giorni.
    NOTA: A seconda dello sfondo genetico, del ceppo del mouse o del peso iniziale, la gravità e l'insorgenza della miocardite potrebbero variare e dovrebbero essere determinati in primo luogo.

2. Preparazione del campione per la microscopia a foglio leggero

  1. 4 giorni dopo l'applicazione della tossina, anestetizzano i topi sciacquando una camera di induzione con una miscela al 2% di isoflurano / ossigeno vaporizzato. Iniettare 15 μg di un anticorpo anti-CD45 direttamente etichettato (clone 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) in 50 μL di PBS per via endovenosa (iv) utilizzando il percorso di applicazione retro-orbitale, che assicura un'applicazione molto veloce ed altamente precisa Corretta quantità di anticorpi.
    NOTA: La profondità desiderata di narcosi è stata raggiunta quando i topi sono recanti e non reagiscono al test di pizzicamento del piede.
  2. Dopo 2 ore di incubazione, sacrifica i topi con dislocazione cervicaleD perfora i cuori in situ con 5 ml di PBS / EDTA (5 mM).
    1. Esporre il cuore e iniettare la soluzione di perfusione nel ventricolo destro usando un catetere 21 G. Perfuso con pressione lenta e costante e assicurarsi che il sangue possa essere scaricato dopo aver tagliato l'aorta aperta.
      NOTA: Questa perfusione transcardica potrebbe causare manufatti di preparazione minori, che potrebbero disturbare la visualizzazione 3D finale dell'organo. Pertanto, sperimentatori animali avanzati potrebbero effettuare la perfusione attraverso la vena cava inferiore, escciando l'aorta addominale.
  3. Per la fissazione chimica, perfezionare il cuore attraverso lo stesso incavo con 5 ml di 4% di paraformaldeide (PFA). Tenere il catetere in posizione e collegare semplicemente una nuova siringa riempita con PFA. Perfuso con pressione lenta e costante.
    NOTA: Paraformaldeide altamente tossico; Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e altre mucose.
    1. Procuratevi delicatamente il cuore con le pinze dentate; puSarà lievemente in alto; E tagliare tutti i collegamenti tissutali, tra cui le arterie in entrata e in uscita e le vene. Conservare l'organo per altri 4 h nel 4% di PFA per ulteriori fissazioni.
  4. Per disidratare l'organo, incubare il cuore in una serie ascendente di etanolo a 50%, 70% e due volte al 100%, ognuno per 12 h, a 4 ° C al buio. Qui usate i tubi di reazione di polipropilene da 5 mL, permettendo loro di ruotare costantemente in un rotatore di tubi usando una velocità di rotazione lenta per evitare la formazione di bolle d'aria.
  5. Preparazione completa del campione mediante compensazione chimica. Per rendere trasparenti i cuori, incubarli nel 98% di etere dibenzilico (DBE) continuando a ruotare durante la notte.
    NOTA: DBE è irritante per gli occhi, la pelle e il sistema respiratorio.

3. Microscopia a foglio chiaro

  1. Eseguire LSFM utilizzando il microscopio a foglio leggero (vedere la tabella dei materiali). Posizionare il campione sul supporto campione standard del microscopio nel sacchetto riempito DBEVette, adatto per campioni fino a 30 mm x 30 mm x 15 mm.
  2. Tenere il campione saldamente in posizione durante l'acquisizione di immagini utilizzando blocchi di agarosio disidratati e smaltiti.
    1. Per preparare i blocchi di agarosio, versare il 2% di agarosio fuso in uno stampo (15 mm x 15 mm x 5 mm). Lasciare raffreddare l'agarosio fino a che non si solidifichi.
    2. Dehidrarlo in una serie ascendente di etanolo (50%, 70% e due volte al 100%). Incubare i blocchi di agarosio durante la notte in 98% di DBE. Conservare l'agarosio in DBE finché non viene utilizzato.
      NOTA: poiché l'agarosio è costituito prevalentemente da acqua, i tempi di incubazione per ogni fase di disidratazione possono essere estesi, a seconda della dimensione del blocco.
      NOTA: DBE è irritante per gli occhi, la pelle e il sistema respiratorio.
    3. Se necessario, tagliare il blocco agarosio preparato alla forma desiderata utilizzando un bisturi tagliente. In genere, tagliare forme prismatiche o cunei a posizionarsi ai bordi dell'adattatore di esempio.
      NOTA: Poiché i blocchi di agarosio sono elastici,Il campione rimane in posizione quando viene spinto con poca forza.
  3. Rileva i segnali di fluorescenza di interesse (qui, l'autofluorescenza e la colorazione degli anticorpi anti-CD45) con le appropriate impostazioni di eccitazione e filtro di emissione.
    1. Per la rilevazione del segnale di autofluorescenza derivato dal tessuto connettivo, utilizzare un filtro a banda da 525/50 nm a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm (OPSL: 50 mW); La colorazione CD45 con un anticorpo AF647-accoppiato viene rilevata a 668 nm (filtro a banda passante: 680/30 nm) e ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 647 nm (laser diodo: 50 mW).
    2. Scegliere 4 μm come la distanza tra i due singoli z-piani.

4. Immagine post-elaborazione

NOTA: I dati digitali acquisiti sono stati ulteriormente elaborati con un software scientifico di elaborazione e analisi 3D 3D / 4D (vedere la tabella dei materiali).

  1. Apertura e pre-regolazione dei file di dati.
    1. Dopo aver avviato il software di analisi, selezionare il pulsante "Superpass" nell'angolo superiore sinistro. Per aprire gli stack di immagini, scegli "File", "Apri" e seleziona una cartella contenente i dati dal primo canale acquisito. Scegli "Modifica" e "Aggiungi canali" per aggiungere altri canali acquisiti.
      NOTA: a seconda della dimensione dei dati e del sistema informatico, questo processo può richiedere alcuni minuti. Il protocollo presentato mostra tutte le fasi per 2 canali di acquisizione (autofluorescenza e AF647).
    2. Correggere le dimensioni x, y e z voxel facendo clic su "Modifica" e selezionando "Proprietà immagine". Quando si apre la nuova finestra, regolare i parametri.
      NOTA: questa fase dipende dal sistema microscopico impiegato e dal particolare formato dati. I valori xyz corretti sono fondamentali per le dimensioni successive e le misurazioni remote. Nella maggior parte dei casi, questi parametri vengono memorizzati come metadati nei file micrograph. Tuttavia, se il file foRmat non può essere interpretato correttamente dal software di analisi, è importante immettere manualmente le dimensioni dei pixel. La dimensione dei pixel nelle dimensioni x e y dipende dalla dimensione del pixel della fotocamera, dal potenziamento della cartella potenzialmente applicata e dall'obiettivo e dall'aumento dell'obiettivo. La dimensione dei pixel in z equivale alla dimensione del passo z definita automaticamente ( ad esempio, 4 μm).
  2. Regolazioni del canale
    1. Prima trasformare il segnale di autofluorescenza in scala di grigi aprendo "Regolazione schermo" ("Modifica" e "Mostra regolazione schermo"). Una nuova finestra elenca tutti i canali aperti e le impostazioni di visualizzazione per tutti; Per modificare il colore predefinito, selezionare il canale di autofluorescenza e scegliere lo stile di visualizzazione "bianco". Fai clic su "ok" per applicare.
    2. Per la regolazione del livello nero, tornare a "Regolazione della visualizzazione" e regolare il valore del livello nero per escludere i segnali di sfondo indesiderati che non rappresentano la struttura del campioneS.
      1. A tal fine, utilizzare il triangolo superiore sinistro della barra di canale e trascinarlo da sinistra a destra.
        NOTA: le modifiche verranno visualizzate immediatamente. Assicurarsi di sopprimere solo i segnali che non derivano dal campione. I valori minimi in background non devono mai essere "0" per evitare i pixel di pitch-black, in quanto potrebbero essere necessari i segnali acustici per ulteriori calcoli. Assicurarsi che tutte le modifiche di livello nero siano eseguite dopo l'acquisizione di immagini. Altrimenti, potrebbero essere perse informazioni preziose sul campione. L'aggiustamento del livello nero serve solo a scopi rappresentativi. Per utilizzare le stesse impostazioni di visualizzazione su campioni diversi, i valori precisi possono essere inseriti nel campo numerico "min" sotto l'elenco dei canali. Questo è molto utile per analisi quantitative.
    3. Eseguire la regolazione dell'intensità, usando il triangolo superiore destro per regolare la rispettiva intensità del canale oppure immettendo valori precisi nel campo numerico "max" sotto la cassaL elenco.
    4. Eseguire la regolazione del contrasto trascinando il triangolo inferiore al centro della barra del canale per aumentare o diminuire il valore della gamma o immettendo i valori precisi.
    5. Regolare il canale AF647 in base al canale di autofluorescenza. Come differenza, impostare la visualizzazione del segnale AF647 su una tabella di ricerca a colori del calore. Fai questo scegliendo il modo canale "fuoco" in un approccio simile a quello descritto nel passaggio 4.2.1.
      NOTA: Poiché le intensità complessive del segnale sono significativamente inferiori rispetto al canale di autofluorescenza, i livelli neri vengono normalmente regolati a valori molto inferiori. Per quanto riguarda il canale di autofluorescenza, la luminosità di questo canale è solitamente aumentata.
    6. Selezionare la "modalità di miscelazione" per visualizzare dettagliatamente le strutture dei tessuti. Analizzare tutti i campioni di una serie con gli stessi valori dei parametri.
  3. Clipping virtuale
    1. Per praticamente tagliare aprire l'organo prima dell'esposizione scena 3DRt, applicare un piano di ritaglio sull'oggetto 3D reso.
      1. Fai clic sull'icona "Clipping Plane" (forbici) nell'elenco degli oggetti. All'interno della vista dell'immagine apparirà un telaio giallo e un manipolatore (mandrino bianco). Ruotare il mandrino all'estremità più sottile con il mouse, modificando così l'orientamento del piano di ritaglio e spostare la parte più spessa del mandrino per selezionare la profondità di taglio desiderata.
      2. Nascondere il fotogramma e il manipolatore deselezionando le rispettive caselle di controllo sotto l'elenco degli oggetti e creando gli snapshot desiderati.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'approccio presentato LSFM analizza la distribuzione e la quantità di leucociti nei cuori murini dopo l'induzione di una mieloma grave. La figura 1A spiega il protocollo di pre-trattamento per i topi transgenici CD11c.DTR per l'induzione di miocardite. Questo passo rappresenta il trigger necessario per l'assunzione di leucociti nel miocardio. Dopo un'applicazione DTX di successo, gli animali sviluppano gravi sintomi di malattia, come la debolezza generale, l'anoressia e...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nella scienza della vita moderna, la visualizzazione microscopica dei processi biologici svolge un ruolo sempre più importante. In questo contesto, negli ultimi due secoli sono stati raggiunti molti sviluppi che aiutano a rispondere a domande indesiderabili fino a questo punto,. In primo luogo, c'è stata una chiara tendenza ad aumentare fondamentalmente la capacità di risoluzione dei microscopi leggeri. Con microscopia strutturata microscopia (SIM) 21 , 22 ,...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ricerca nel laboratorio di Gunzer è stata sostenuta dal Ministero federale tedesco per l'istruzione e la ricerca (sovvenzione n. 0315590 AD) e dalla Fondazione tedesca di ricerca (donazione GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Ringraziamo inoltre l'IMCES per il supporto tecnico e Sebastian Kubat per l'aiuto con la modellazione 3D dei cartoni animati.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
tossina diftericaSigma AldrichD0564
soluzione salina tamponata con fosfatoBiochromL182-10
ketamina [50 mg/mL]InresaPZN 4089014
xilazina [2 %]Siringa Ceva
BraunREF 9161502Braun Omincan F 
catetere venoso abitato Respiratore per piccoli animali Becton DickinsonREF 381923BD Insyte Autoguard
Harvard Apparatus73-0044Anticorpo MiniVent
anit-CD45 (AF647)BioLegend103124
acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) sale disodico diidratoCarl Roth8043.2
(21 G)BD BiosciencesREF 387455BD valu-set
paraformaldeideSigma AldrichP6148
Tubo PE (5 mL)Carl RothEKY9.1Rotilabo
etanoloCarl Roth9065.4
dibenzil etereSigma-Aldrich108014
rotatore per tubiMiltenyi Biotec130-090-753MACSmix
agarosio (bassa gelificazione)Sigma AldrichStampo A4018
(15 x 15 x 5 mm)Tissue Tek4566Cryomold 
sistema di microscopio a foglio luminosoLaVision BiotecUltramicroscope 
corpo delmicroscopio OlympusMVX10 
obiettivoOlimpo0,5  NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5  mm 
Fotocamera sCMOS 5.5MPAndor Technology
488 nm Laser OPSL (50mW)Laser a
647 nm  (50mW)Software coerente
di elaborazione e analisi delle immagini 3DBitplaneIMARIS Ver. 8.3
ceppo di topo transgenicoSteffen Jung et al.CD11c.DTR
wt ceppo di topoEnvigoBalb/c Ola Hsd J
Modulo laserLaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Obiettivo
diodi coerente

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
  2. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
  3. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
  4. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705(2007).
  5. Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).
  6. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  7. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  8. Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
  9. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
  10. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  11. Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207(2013).
  12. Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
  15. Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
  16. Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
  17. Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
  18. Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
  19. Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
  20. Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
  21. Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
  22. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
  23. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  27. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
  28. Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
  29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  30. Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , in press (2016).
  31. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  32. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  33. Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014(2005).
  34. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  35. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  36. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).
  37. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  38. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  39. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  40. Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
  41. Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
  42. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Light Sheet MicroscopyLeukocyte InfiltrateMurine MyocarditisFluorescence ImagingOrgan ClearingAntibody StainingImage ProcessingCardiac InflammationWhole Organ VisualizationCD45 Positive Cells

Articoli correlati