Nuovi modelli e saggi che migliorerebbero il processo di sviluppo precoce dei farmaci antitubercolari di prossima generazione sono altamente auspicabili. Qui, descriviamo un test rapido, economico e compatibile con BSL-2 per valutare l'efficacia del farmaco contro il Mycobacterium tuberculosis che può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.
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Articolo metodologico
Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il processo iniziale di sviluppo di farmaci antitubercolari è ostacolato dalla traduzione inefficiente di composti con attività in vitro in efficacia in ambito clinico. Ciò è probabilmente dovuto alla mancanza di considerazione per le barriere di penetrazione cellulare fisiologicamente rilevanti che esistono nell'ospite infetto. Di recente abbiamo messo a punto un modello di infezione alternativo che genera grandi strutture aggregate di macrofagi contenenti M. tuberculosis (Mtb) densamente impacchettato al suo interno, adatto per i test di suscettibilità ai farmaci. Questo modello di infezione è economico, rapido e, soprattutto, compatibile con BSL-2. Qui, descriviamo le procedure sperimentali per generare strutture aggregate di Mtb/macrofagi che produrrebbero Mtb attraversata da macrofagi per test di suscettibilità ai farmaci. In particolare, dimostriamo come questo sistema di infezione possa essere direttamente adattato al formato di piastra a 96 pozzetti mostrando capacità di throughput per lo screening di librerie di composti contro Mtb. Nel complesso, questo test è un'aggiunta preziosa alla cassetta degli attrezzi per la scoperta di farmaci Mtb attualmente disponibile grazie alla sua semplicità, economicità e scalabilità.
Introduzione
La tubercolosi (TB) rimane una grave minaccia globale la salute nonostante la disponibilità di regimi chemioterapici anti-TB per oltre 40 anni 1. Ciò è dovuto in parte al requisito per periodi lunghi di trattamento di più di 6 mesi utilizzando più combinazioni di farmaci, che porta al paziente non conformità 2. L'emergere di TBC resistente ai farmaci negli ultimi anni ha ulteriormente aggravato i problemi in un campo in cui il successo dello sviluppo di farmaci clinicamente approvati è praticamente inesistente 3. Infatti, nonostante esaustivo anti-TB sviluppo di farmaci, solo un singolo....
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Protocollo
NOTA: Come M. tuberculosis mc 2 6206 è un ceppo non virulento 17, 18, tutti i lavori in questo protocollo può essere eseguita in un impianto di 2 livello di biosicurezza (BSL-2).
1. condizioni di coltura per la proteina fluorescente verde Esprimere M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb-GFP)
NOTA: il M. tuberculosis H37Rv deriva auxotroph ceppo mc 2 6206 (Δ panCD, Δ Leucò) trasformato con la GFP esprimere plasmide pMN437 è utilizzato in tutto questo protocollo
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Risultati
Per confermare la robustezza di adattare questo modello infezione per 96 pozzetti formato piatto, abbiamo qui esaminato la sensibilità ai farmaci di Mtb derivato dal nostro 96-ben adattata modello di infezione alla rifampicina (RIF) e moxifloxacina (Moxi) secondo il modello di data nella figura 1A. Abbiamo dimostrato che la generazione di Mtb / macrofagi strutture aggregate chiave per questa analisi può essere prodotto in maniera affidabile in un format.......
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Discussione
Qui, abbiamo descritto in dettaglio un modello di infezione Mtb alternativo adatto per test efficacia del farmaco. Questo modello tiene conto di due fattori chiave che dovrebbe essere dato più considerazione durante il processo di sviluppo TB farmaci precoce: la presenza di barriere fisiologicamente rilevanti alla penetrazione di droga e cambiamenti metabolici di Mtb durante l'infezione. Mentre abbiamo già dimostrato i vantaggi del nostro modello di infezione e ha proposto la possibilità di scalare.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Frank Wolschendorf per l'accesso al lettore automatico di lastre di imaging Cytation 3. Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla sovvenzione NIH R01-AI104499 a OK. Parti del lavoro sono state eseguite nelle strutture UAB CFAR e dal nucleo di citometria a flusso UAB CFAR/nucleo di citometria a flusso UAB articolare, che sono finanziati da NIH/NIAID P30 AI027767 e da NIH 5P30 AR048311.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Seguire le raccomandazioni del produttore |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Preparare una soluzione madre al 20% in H2O; sterilizzare |
| sale emicalcico dell'acido D-pantotenico | Sigma | P5710 | Preparare una soluzione madre da 24 mg/mL in H2O; filtro sterilizzare |
| L-leucina | MP Biomedicals | 194694 | Preparare 50 mg/mL di soluzione madre in H2O; filtro sterilizzare |
| Igromicina B | EMD Millipore | 400051 | Preparare 200 mg/mL di soluzione madre in H2O |
| Nalgene Square PETG media Thermo | Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Siero fetale bovino | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutammina | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 lettore | di piastre Biotek | Intercambiabile con qualsiasi lettore di piastre fluorescenti e microscopio | |
| Software | Gen5 Biotek | Registrazione e analisi di coversione della rezasurina | |
| Rifampicina | Fisher Scientific | BP2679250 | Preparare una soluzione madre da 10 mg/mL in H2O |
| Moxifloxacina cloridrato | Acros Organics | 457960010 | Preparare una soluzione madre da 10 mg/mL in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Preparare 800 μ g/mL soluzione madre in H2O; filtro sterilizzare |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Preparare una soluzione madre al 20% in H2O; filtro sterilizzare |
Riferimenti
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and t....
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Ristampe e permessi
