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Articolo metodologico

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi

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DOI:

10.3791/55453

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24 marzo 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

In questo articolo

Sommario

Nuovi modelli e saggi che migliorerebbero il processo di sviluppo precoce dei farmaci antitubercolari di prossima generazione sono altamente auspicabili. Qui, descriviamo un test rapido, economico e compatibile con BSL-2 per valutare l'efficacia del farmaco contro il Mycobacterium tuberculosis che può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.

Abstract

Il processo iniziale di sviluppo di farmaci antitubercolari è ostacolato dalla traduzione inefficiente di composti con attività in vitro in efficacia in ambito clinico. Ciò è probabilmente dovuto alla mancanza di considerazione per le barriere di penetrazione cellulare fisiologicamente rilevanti che esistono nell'ospite infetto. Di recente abbiamo messo a punto un modello di infezione alternativo che genera grandi strutture aggregate di macrofagi contenenti M. tuberculosis (Mtb) densamente impacchettato al suo interno, adatto per i test di suscettibilità ai farmaci. Questo modello di infezione è economico, rapido e, soprattutto, compatibile con BSL-2. Qui, descriviamo le procedure sperimentali per generare strutture aggregate di Mtb/macrofagi che produrrebbero Mtb attraversata da macrofagi per test di suscettibilità ai farmaci. In particolare, dimostriamo come questo sistema di infezione possa essere direttamente adattato al formato di piastra a 96 pozzetti mostrando capacità di throughput per lo screening di librerie di composti contro Mtb. Nel complesso, questo test è un'aggiunta preziosa alla cassetta degli attrezzi per la scoperta di farmaci Mtb attualmente disponibile grazie alla sua semplicità, economicità e scalabilità.

Introduzione

La tubercolosi (TB) rimane una grave minaccia globale la salute nonostante la disponibilità di regimi chemioterapici anti-TB per oltre 40 anni 1. Ciò è dovuto in parte al requisito per periodi lunghi di trattamento di più di 6 mesi utilizzando più combinazioni di farmaci, che porta al paziente non conformità 2. L'emergere di TBC resistente ai farmaci negli ultimi anni ha ulteriormente aggravato i problemi in un campo in cui il successo dello sviluppo di farmaci clinicamente approvati è praticamente inesistente 3. Infatti, nonostante esaustivo anti-TB sviluppo di farmaci, solo un singolo farmaco è stato approvato dalla FDA per l'uso clinico negli ultimi 40 anni 4. Così, le nuove generazioni di farmaci anti-TB sono urgentemente necessari per affrontare questo problema.

Un problema fondamentale nella scoperta TB farmaco è la mancanza di trasferimento di successo da composti con attività in vitro all'efficacia in ambito clinico= "xref"> 5, 6, 7. Inizialmente, gli approcci target basati sono stati usati per lo screening per anti-Mtb farmaci 5, che non è riuscito a tradurre in cellule batteriche intere. Anche quando si usano le cellule Mtb, è spesso eseguita utilizzando brodo cresciuto culture, che non calcolano accuratamente l'efficacia dei farmaci in vivo 8, 9. Questi problemi sono stati riconosciuti e test di screening di droga nei confronti di macrofagi contenenti Mtb o latente Mtb sono state stabilite con successo 8, 10, 11, 12. Tuttavia, anche questi test più avanzati non danno sufficiente attenzione alle barriere di penetrazione che i farmaci incontrano nelle lesioni polmonari non vascolarizzati, e di foci necrotici al sito di infezione. Infatti, Anche per la prima linea TB rifampicina farmaco, il dosaggio sub-ottimale è stata messa in discussione a causa di inadeguata nel tessuto vivo e liquido cerebrospinale (CSF) penetrazione 13, 14, 15, così come è diminuito l'efficacia contro intracellulare Mtb 8, 9. Come tali, i nuovi modelli e le analisi che tengano conto di questi parametri durante il processo di sviluppo del cavo in anticipo sarebbe senza dubbio migliorare TB sforzi scoperta di nuovi farmaci.

Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente istituito un poco costoso, rapido, e BSL 2-modello di infezione compatibile alternativo per Mtb droga prove di efficacia 16. Questo modello di infezione prodotta densamente Mtb all'interno di grandi strutture aggregate macrofagi, che ricapitolava fisiologicamente rilevanti barriere di penetrazione cellulare e ha generato macrofagi diversi passaggi Mtb con uno stato fisiologico alterato simile latente Mtb. Mtb derivato da questo modello di infezione è stato combinato con il test resazurina microtitolazione (REMA) per valutare l'efficacia della droga, che ha prodotto risultati coerenti con altri modelli di infezione intracellulare e correlato bene con la capacità riportato comuni farmaci TB di raggiungere alte concentrazioni di CSF relative alle concentrazioni sieriche 16.

Qui si descrive in dettaglio la generazione di Mtb / macrofagi strutture aggregate per produrre macrofagi diversi passaggi Mtb adatto per i test di sensibilità ai farmaci utilizzando REMA. In particolare, si mostra come questo sistema di infezione potrebbe essere adattato in un formato a 96 pozzetti per la compatibilità con throughput screening di candidati farmaci anti-TB.

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Protocollo

NOTA: Come M. tuberculosis mc 2 6206 è un ceppo non virulento 17, 18, tutti i lavori in questo protocollo può essere eseguita in un impianto di 2 livello di biosicurezza (BSL-2).

1. condizioni di coltura per la proteina fluorescente verde Esprimere M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb-GFP)

NOTA: il M. tuberculosis H37Rv deriva auxotroph ceppo mc 2 6206 (Δ panCD, Δ Leucò) trasformato con la GFP esprimere plasmide pMN437 è utilizzato in tutto questo protocollo 16. E 'possibile sostituire il ceppo di Mtb-GFP con non GFP che esprimono ceppo selvatico per consentire una più agevole accessibilità del ceppo per i ricercatori. Tuttavia, l'espressione GFP è opportuno attivare la conferma visiva della fagocitosi e la formazione di aggregati Mtb / macrofagi. per long conservazione a lungo termine, Mtb-GFP sono stati congelati a -80 ° C in piena 7H9 media (descritti al punto 1.1) integrato con il 20% di glicerolo.

  1. Preparare completo supporto Mtb-GFP (7H9-C), completandola 7H9 media con il 10% Middlebrook OADC, 0,02% tyloxapol, 24 mg / ml D-acido pantotenico, 50 mg / ml di L-leucina e 50 mg / ml Hygromycin B.
  2. Scongelare una fiala di Mtb-GFP e aggiungere 10 ml di 7H9-C in un pallone a fondo quadro PETG 30 ml.
  3. Incubare a 37 ° C su shaker rotativo (50 rpm). Prendere le misure della densità ottica (OD 600) ogni pochi giorni fino a OD 600 raggiunge 1,0 (circa 5-8 giorni).
  4. Diluire e cultura passaggio come necessario per mantenere un OD 600 tra 0,2-1,0.
  5. Per l'infezione, utilizzare una cultura consolidata di Mtb-GFP all'interno della fase di crescita logaritmica (OD 600 di 0,6-1). Per evitare le culture clumpy, sonicare il pallone di coltura Mtb in un bagno d'acqua (130 W; 3 x 5 s impulsi) ONCe o due volte alla settimana

2. Condizioni di coltura per Cellule THP-1

  1. Preparare completa THP-1 mezzi di cella (RPMI-C) completandolo terreno RPMI 1640 con 10% di siero fetale inattivato al calore bovini, 2 mM L-glutammina e 10 mM HEPES.
  2. Incubare le cellule in un pallone T-75 a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2.
  3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o citometria a flusso ogni altro giorno e mantenere le cellule THP-1 ad una densità tra ,1-0.600.000 per ml.

3. Infezione protocollo per generare strutture Mtb / macrofagi di aggregazione

  1. THP-1 preparazione cellulare (per piastra a 96 pozzetti)
    1. Centrifuga 7 x 10 6 cellule THP-1 a 250 xg per 5 min. Risospendere in 7 mL RPMI-C.
  2. Preparazione Mtb-GFP
    1. Centrifuga 2,8 x 10 8 Mtb-GFP a 3.200 xg per 5 minuti in una centrifuga oscillante bucket ucantare una conversione di OD 600 = 1.0 3 x 10 8 batteri / mL.
    2. Risciacquare una volta con RPMI-C e centrifugare come al punto 3.2.1.
    3. Risospendere in 7 mL RPMI-C e vortex per 10 s.
  3. Infezione
    NOTA: Vedere la Figura 1 per il modello.
    1. Preparare una piastra a 96 pozzetti aggiungendo 200 ml di acqua sterile in righe A e H e colonne 1 e 12 per un cerchione di acqua per evitare l'evaporazione del terreno di coltura.
    2. Aggiungere 200 ml RPMI-C a colonna 2 (B2 per G2) per il controllo di sfondo (vuoto).
    3. Per infettare, aggiungere sospensione Mtb-GFP (punto 3.2) per sospensione cellulare THP-1 (passo 3.1) e mescolare bene pipettando. La densità delle cellule THP-1 finale è 5 x 10 5 per ml e la corrispondente molteplicità di infezione è 40.
    4. Versare il THP-1 sospensione / Mtb-GFP in un serbatoio di 25 mL.
    5. Aggiungere 200 ml di THP-1 / Mtb-GFP sospensione per tutti i restanti 96-pozzetti (B3 tramite G11) usinga multicanale pipetta.
      NOTA: Se si lavora con più lastre da 96 pozzetti, risospendere regolarmente il restante THP-1 sospensione / Mtb nel serbatoio per assicurare una miscela viene aggiunta a ciascun pozzetto.
    6. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 7-10 giorni.
    7. Cambiare i media ogni 2 giorni, eliminando lentamente 100 ml trascorso supporto dalla parte superiore di ogni bene e delicatamente aggiungendo 100 ml di pre-riscaldato RPMI-C usando una pipetta multicanale. Non risospendere pozzi e disturbare gli aggregati Mtb / macrofagi sul fondo dei pozzetti.
    8. Visivamente esaminare i pozzi di microscopia a fluorescenza (obiettivo 4-10X) tutti i giorni, prendendo atto della dimensione di Mtb aggregati / macrofagi. Di giorno 7-10, Mtb aggregati / macrofagi devono essere sufficientemente grande (fare riferimento alla Figura 2 per riferimento) di procedere per prove di efficacia della droga (sezione 4).
    9. Se lo si desidera, catturare le immagini dei 96-pozzetti usando un sistema di imaging cellulare automatizzato montaticon campo chiaro e filtro GFP imposta per documentare Mtb / macrofagi formazione di aggregati.
      NOTA: Se gli utenti non hanno accesso ad un sistema di imaging automatizzato, immagini di pozzi rappresentative possono essere scattate con qualsiasi microscopio adeguato con funzionalità di GFP e di campo luminoso.

4. inibizione della crescita Assay per valutare Drug efficacia contro Mtb Derivato da Mtb / macrofagi Aggregati

  1. Preparazione della droga (condizioni triplicato per due farmaci)
    Nota: vedere Figura 1A per il modello.
    1. In una piastra da 96 pozzetti separati, aggiungere 125 ml di mezzi 7H9-C di B2 fino al G10.
    2. Preparare due farmaci a doppia più alta concentrazione finale desiderata in 1 mL di 7H9-C per spiegare la diluizione nel passaggio 4.2.4.
    3. Aggiungere 250 ml di ogni farmaco per pozzi B11-C11-D11 e E11-F11-G11, rispettivamente, per i trattamenti in triplicato.
    4. Utilizzando una pipetta multicanale, in serie dilute i farmaci di prova duplice spostando 125 microlitri da B11-B10-G11 in G10. Mescolare pipettando 5 volte ad ogni passo.
    5. Continuare a muoversi 125 microlitri da una colonna all'altra (da destra a sinistra) attraverso la piastra, e fermarsi dopo colonna 4.
    6. Dopo la miscelazione colonna 4, scartare 125 microlitri in un contenitore per rifiuti. Le colonne 2 e 3 non devono contenere tutte le droghe per consentire l'uso come sfondo (vuoto) ei controlli di crescita positivi.
      NOTA: In alternativa, seguire modello in figura 1B per le librerie di prova della droga. Ciascuna piastra da 96 pozzetti può ospitare 58 farmaci ad un'unica concentrazione. Preparare questa piastra farmaco utilizzando il doppio della concentrazione finale desiderata poiché sarà diluito a metà in fase 4.2.4.
  2. Trattamento farmacologico:
    1. Recuperare la piastra a 96 pozzetti contenente la Mtb con infezione macrofagi (aggregati Mtb / macrofagi).
    2. decantare con attenzione tutti i pozzi rilevanti (B2 attraverso G11) con una pipetta multicanale.Eseguire questo in un modo a due fasi: dapprima rimuovere 150 microlitri senza inclinare il piatto, e quindi rimuovere rimanenti mezzi (~ 50 microlitri) inclinando la piastra e inserire la punta della pipetta al bordo inferiore del pozzo. Come Mtb / macrofagi aggregati sono aderenti al fondo del pozzo, nessun materiale dovrebbe essere perso.
    3. Delicatamente aggiungere 100 ml di 7H9-C media per tutti i pozzetti rilevanti (B2 attraverso G11) della piastra contenente gli aggregati / macrofagi Mtb.
    4. Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri dal farmaco contenente 96 pozzetti (passo 4.1) ai corrispondenti pozzetti della piastra infezione.
    5. Mettere in busta sigillata e incubare per 3 giorni a 37 ° C.

5. Quantificazione del farmaco efficacia usando il saggio resazurina microtitolazione

  1. Preparare resazurina soluzione madre ad una concentrazione finale di 0,8 mg / ml in H 2 O. filtro attraverso 0,22 micron dimensione dei pori della membrana PVDF per la sterilizzazione.
  2. Preparare resazurin soluzione di lavoro miscelando resazurina soluzione madre, H 2 O e Tween-80 (soluzione al 20% in H 2 O) in un rapporto 2: 1: 1. Le concentrazioni finali sono 0,4 mg / mL resazurina e il 5% di Tween-80.
  3. Utilizzando un lettore di piastre, impostare un programma per leggere la fluorescenza a 530 nm di eccitazione e di emissione 590 nm ogni 30 min per 24 ore a 37 ° C. lettore di piastre pre-riscaldare a 37 ° C.
  4. Aggiungere 20 ml di soluzione di lavoro resazurina a tutti i pozzetti rilevanti (B2 tramite G11) della piastra droga trattata (passo 4.11) usando una pipetta multicanale.
  5. Mettere piatto sul lettore di piastre e avviare il programma creato nel passo 5.3.
    NOTA: Per facilitare il trattamento di elevati volumi di piastre di dosaggio, è sufficiente per sviluppare il saggio in un incubatore a 37 ° ed eseguire singola fluorescenza legge ogni 24 h. Questo vale anche per gli utenti che non hanno accesso a un lettore di piastre con funzionalità cinetici e di incubazione.

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Risultati

Per confermare la robustezza di adattare questo modello infezione per 96 pozzetti formato piatto, abbiamo qui esaminato la sensibilità ai farmaci di Mtb derivato dal nostro 96-ben adattata modello di infezione alla rifampicina (RIF) e moxifloxacina (Moxi) secondo il modello di data nella figura 1A. Abbiamo dimostrato che la generazione di Mtb / macrofagi strutture aggregate chiave per questa analisi può essere prodotto in maniera affidabile in un format...

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Discussione

Qui, abbiamo descritto in dettaglio un modello di infezione Mtb alternativo adatto per test efficacia del farmaco. Questo modello tiene conto di due fattori chiave che dovrebbe essere dato più considerazione durante il processo di sviluppo TB farmaci precoce: la presenza di barriere fisiologicamente rilevanti alla penetrazione di droga e cambiamenti metabolici di Mtb durante l'infezione. Mentre abbiamo già dimostrato i vantaggi del nostro modello di infezione e ha proposto la possibilità di scalare...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. Frank Wolschendorf per l'accesso al lettore automatico di lastre di imaging Cytation 3. Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla sovvenzione NIH R01-AI104499 a OK. Parti del lavoro sono state eseguite nelle strutture UAB CFAR e dal nucleo di citometria a flusso UAB CFAR/nucleo di citometria a flusso UAB articolare, che sono finanziati da NIH/NIAID P30 AI027767 e da NIH 5P30 AR048311.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
7H9BD Difco271310Seguire le raccomandazioni del produttore
Middlebrook OADCBD Biosciences212351
TyloxapolSigmaT8761Preparare una soluzione madre al 20% in H2O; sterilizzare
sale emicalcico dell'acido D-pantotenicoSigmaP5710Preparare una soluzione madre da 24 mg/mL in H2O; filtro sterilizzare
L-leucinaMP Biomedicals194694Preparare 50 mg/mL di soluzione madre in H2O; filtro sterilizzare
Igromicina BEMD Millipore400051Preparare 200 mg/mL di soluzione madre in H2O
Nalgene Square PETG media ThermoFisher2019-0030
RPMI 1640 mediaHycloneSH30027.01
Siero fetale bovinoAtlanta BiologicalsS12450H
L-glutamminaCorningMT25005CI
HEPESHycloneSH30237.01
Cytation 3 lettoredi piastre BiotekIntercambiabile con qualsiasi lettore di piastre fluorescenti e microscopio
SoftwareGen5 BiotekRegistrazione e analisi di coversione della rezasurina
Rifampicina Fisher ScientificBP2679250Preparare una soluzione madre da 10 mg/mL in H2O
Moxifloxacina cloridratoAcros Organics457960010Preparare una soluzione madre da 10 mg/mL in H2O
Resazurin Sodium SaltSigmaR7017Preparare 800 μ g/mL soluzione madre in H2O; filtro sterilizzare
Tween-80Fisher ScientificT164500Preparare una soluzione madre al 20% in H2O; filtro sterilizzare
il

Riferimenti

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