Articolo metodologico

Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

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DOI:

10.3791/55456

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22 marzo 2017

 , 
1Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto descrive un protocollo passo-passo per la generazione e la quantificazione di diversi sottotipi cardiaci riprogrammati utilizzando una somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Abstract

La riprogrammazione diretta di un tipo di cellula in un altro è recentemente emersa come un potente paradigma per la medicina rigenerativa, la modellazione delle malattie e la specificazione del lignaggio. In particolare, la conversione di fibroblasti in miociti indotti simili ai cardiomiociti (iCLM) da parte di Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5 (GHMT) rappresenta un'importante via per la generazione de novo di miociti cardiaci in vitro e in vivo. Prove recenti suggeriscono che il GHMT genera una maggiore diversità di sottotipi cardiaci rispetto a quanto precedentemente apprezzato, sottolineando così la necessità di un approccio sistematico alla conduzione di ulteriori studi. Prima che la riprogrammazione diretta possa essere utilizzata come strategia terapeutica, tuttavia, le basi meccanicistiche della conversione del lignaggio devono essere comprese in dettaglio per generare specifici sottotipi cardiaci. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di iCLM mediante riprogrammazione mediata da GHMT di fibroblasti embrionali di topo (MEF).

Descriviamo metodi per l'isolamento del MEF, la produzione retrovirale e l'infezione da MEF per realizzare una riprogrammazione efficiente. Per determinare l'identità del sottotipo delle cellule riprogrammate, descriviamo in dettaglio un approccio passo-passo per l'esecuzione dell'immunocitochimica sulle iCLM utilizzando un set definito di anticorpi compatibili. Vengono inoltre presentati i metodi per la microscopia confocale, l'identificazione e la quantificazione delle iCLM e dei sottotipi individuali atriali (iAM), ventricolari (iVM) e pacemaker (iPM). Infine, discutiamo i risultati rappresentativi degli esperimenti di riprogrammazione diretta prototipici e sottolineiamo importanti aspetti tecnici del nostro protocollo per garantire un'efficiente conversione del lignaggio. Nel complesso, il nostro protocollo ottimizzato dovrebbe fornire un approccio graduale per consentire agli investigatori di condurre esperimenti di riprogrammazione cardiaca significativi che richiedono l'identificazione di singoli sottotipi di CM.

Introduzione

Il cuore è il primo organo funzionale a sviluppare nell'embrione 1, 2. In combinazione con il sistema circolatorio, fornisce l'ossigeno, nutrienti, e un meccanismo di smaltimento durante lo sviluppo. Tre settimane dopo la fecondazione, il cuore umano batte per la prima volta e la sua regolamentazione adeguata è mantenuta da cardiomiociti (CMS). La perdita irreversibile di queste cellule specializzate è quindi la questione fondamentale sottostante insufficienza cardiaca progressiva. Mentre alcuni organismi come zebrafish e Xenopus hanno il potenziale per la rigenerazione cardiaca, cuore adulto dei mammiferi è più limitata 3, 5, 6. Così, data la funzione critica del cuore, non è sorprendente che la malattia di cuore è la principale causa di morte nel mondo, che rappresentano 600.000 morti nel solo 7 negli Stati Uniti. Ilto, è terapie a base di cellule per riparare o sostituire il miocardio danneggiato in modo efficiente sono di grande interesse clinico.

Lo studio fondamentale di Yamanaka e colleghi hanno mostrato che 8 espressione forzata di quattro fattori di trascrizione è sufficiente per convertire i fibroblasti completamente differenziate di cellule staminali pluripotenti. Tuttavia, la capacità tumorigenico di tutte le strategie di cellule staminali pluripotenti è stata una preoccupazione fondamentale per il loro uso per scopi terapeutici. Questo ha motivato il campo scientifico per la ricerca di metodi alternativi per transdifferenziare cellule, evitando uno stadio di pluripotenza. Recentemente, diversi gruppi hanno dimostrato la fattibilità di questa strategia per la visualizzazione di conversione diretta dei fibroblasti di topo a cellule cardiomiociti come indotte (iCLMs) con l'espressione ectopica di fattori di trascrizione Gata4, MEF2C, Tbx5, e più tardi, Hand2 (GMT e GHMT rispettivamente) 9, 10. Furthermore, la stessa strategia può essere eseguita in vivo e in tessuti umani di derivazione 9, 11, 12. Recenti studi hanno evidenziato fattori complementari o vie di segnalazione che possono essere modulati per migliorare ulteriormente l'efficienza riprogrammazione cardiaco 13, 14, 15. Presi insieme, questi studi dimostrano il potenziale di transdifferenziazione diretta per terapie rigenerative. Tuttavia, la scarsa efficienza della riprogrammazione CM, i meccanismi molecolari sconosciuti, riproducibilità incoerente a causa delle differenze metodologiche 16, e la natura eterogenea del iCLMs rimangono senza indirizzo.

Al fine di valutare direttamente iCLM eterogeneità, abbiamo progettato un saggio unicellulare discreto e robusto per l'individuazione di sviluppo sarcomere e cardiaco specificatio lignaggion-due necessarie caratteristiche di cardiomiociti funzionali. Ci sono almeno tre tipi principali di CM nel cuore come definite dalla loro posizione e uniche proprietà elettriche: atriale (AM), ventricolare (VM) e pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. In una combinazione orchestrato, permettono il corretto pompaggio di sangue. Durante la ferita del cuore, uno o tutti i sottotipi potrebbero essere interessati, e il tipo di terapia cellulare dovrebbero essere affrontate caso per caso. Attualmente, la maggior parte delle strategie si concentrano sulla generazione complessiva di cardiomiociti, mentre poco lavoro è stato fatto per studiare i meccanismi molecolari che regola specifica sottotipo.

Il seguente studio dettagli come quantificare correttamente sarcomeri ben organizzati e identificare un insieme diversificato di sottotipi di cardiomiociti. Utilizzando un pacemaker (PM) topo giornalista SPECIFICI, siamo in grado di applicare un iapproccio mmunocytochemical distinguere miociti atriali indotte-like (IAM), miociti ventricolari come indotta (IVM), e indotti miociti PM-like (IPMS) 21. Sulla base delle nostre osservazioni, solo le cellule che presentano l'organizzazione sarcomere sono in grado di battere spontanea. Questa piattaforma unica riprogrammazione permette di valutare il ruolo di alcuni parametri nell'organizzazione sarcomere, specifica sottotipo, e l'efficienza della riprogrammazione CM ad una risoluzione di singola cellula.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono le pratiche degli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal cura e l'uso a UT Southwestern Medical Center.

1. Isolamento di HCN4-GFP E12.5 embrionali di topo fibroblasti (MEF)

  1. Impostare accoppiamenti cronometrati tra omozigoti maschi HCN4-GFP e CD-1 femmine.
  2. Sacrifica femmina incinta a E12.5 dal biossido di carbonio l'eutanasia e la successiva dislocazione cervicale.
    1. Rimuovere corna uterine con dissettore come descritto in precedenza 22, 23, e metterli in una capsula di Petri sul ghiaccio con soluzione salina 1x tampone fosfato (PBS) senza Ca 2+ e Mg 2+.
  3. Eseguire tutti i passaggi successivi nella cappa di coltura utilizzando la tecnica sterile.
    1. Rimuovere gli embrioni dall'utero e amniotico sac con le forbici e pinze dissezione. Mantenere la placenta allegata per una migliore maneggevolezza. pregnant CD-1 le femmine in genere partoriscono tra 10 e 14 cuccioli.
    2. Utilizzando dissezione pinze, prendere gli embrioni isolate e rapidamente sciacquare due volte in 70% (v / v) EtOH.
      NOTA: I lavaggi devono essere veloci per ridurre al minimo la morte delle cellule.
    3. Togliere la testa, gli arti, la coda, e gli organi interni, compreso il cuore dagli embrioni isolate.
    4. Posizionare il tessuto rimanente in un 10 cm Piatto con 1 ml di PBS 1x e tritare finemente usando una lama di rasoio sterile a circa 1 mm 3 dimensioni.
    5. Trasferire il tessuto tritato in una provetta da 50 ml con PBS.
    6. Spin a 300 xg per 3 min. Con attenzione aspirare l'eccesso di PBS.
    7. Aggiungere 1 ml di sterile 0,25% tripsina-EDTA per ogni embrione. Incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C per 15 min. Mescolare delicatamente il tubo ogni 4 min. Over-digestione del tessuto abbasserà notevolmente la resa.
    8. miscela di cellule Vortex a velocità massima (3.200 rpm) per 4 s.
    9. Aggiungere 2 ml di media fibroblasti per embrioni e mescolare. Filtro tttraverso un colino cella di 100 micron con una pipetta per aiutare le cellule attraverso il filtro. Fare riferimento alla Tabella 1 per la formulazione di tutti i mezzi successive.
    10. Spin a 300 xg per 4 minuti. Con attenzione aspirare il surnatante.
    11. Aggiungere 10 ml di mezzi di fibroblasti fresca per 3 embrioni e triturare 6-10 volte.
    12. Piastra le cellule in 1 15 cm piatto di coltura di tessuti per ogni 3 embrioni preparati. Cultura overnight a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
    13. Dopo l'incubazione durante la notte, sostituire il supporto con freschi 30 ml di supporti per piastra. Mettere le cellule di nuovo nel incubatore durante la notte.
      NOTA: Verificare la presenza di contaminazione delle cellule HCN4-GFP + sotto un microscopio a fluorescenza. La cultura dovrebbe essere GFP - e diventare solo GFP + sulla riprogrammazione.
    14. Il giorno dopo, le cellule raccolto con 3 ml di fresca pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA. Contare e congelare le cellule. Tipicamente, congelare cellule a 3 x 10 6 cellule per ml. Il Yie previstold dovrebbe essere di 3 x 10 6 cellule per dell'embrione.

2. Retrovirus Produzione e riprogrammazione

Attenzione: il seguente protocollo richiede la produzione e la gestione dei retrovirus infettive. Effettuare le seguenti operazioni in un armadio biosicurezza di livello 2 sotto BSL-2 linee guida e tecnica sterile. Utilizzare il 10% di candeggina per smaltire tutti i materiali esposti a retrovirus.

  1. La produzione Retrovirus e preparazione MEF
    NOTA: Il seguente protocollo è per la produzione di retrovirale in 6 pozzetti e infezioni MEF in piastre da 24 pozzetti. Per gli altri formati, fare riferimento alla Tabella 2. MEF sono placcati in occasione della Giornata -1, così dovrà essere coordinata in modo appropriato per ogni esperimento (fare riferimento alla sezione 2.3 e Figura 2) la tempistica.
    1. Mantenere le cellule secondo le raccomandazioni del produttore Plat-E (PE). In breve, le cellule cultura PE in DMEM supplementato con 10% FBS, 1 mg / ml puromycin, 10 mg / ml blasticidin, la penicillina, e streptomicina. cellule Passage 1: 4 ogni due giorni in cui la cultura raggiunge il 70-90% di confluenza.
    2. Giorno -2: Il giorno prima trasfezione, le cellule seme Plat-E a cellule 1 x 10 6 / bene su un 6-pozzetti nei media trasfezione. Le cellule devono essere 70-80% confluenti al momento della transfezione.
  2. Trasfezione utilizzando un agente trasfezione commerciale.
    NOTA: I reagenti commerciali devono essere a temperatura ambiente (RT) prima di trasfezione. Per la trasfezione del DNA, aggiungere ogni DNA plasmide retrovirale singolarmente (G, H, M e T) per formare un cocktail GHMT 9.
    1. Giorno -1: In una provetta di polistirene da 15 ml conica, mescolare 60 ml di mezzi siero ridotti con 6 ml di trasfezione reagente per la reazione per un formato 6-pozzetti. Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Dal momento che il reagente di trasfezione usato qui si lega alla plastica, undd direttamente ai media siero ridotta per evitare qualsiasi diminuzione di efficienza di trasfezione.
    2. Aggiungere un totale di 2 mg di GHMT cocktail a reazione e delicatamente toccare per mescolare. Non farlo vortice. Incubare la reazione per 15 minuti a RT.
    3. Aggiungere il composto dal punto 2.2.3 alle cellule PE in maniera saggia goccia.
    4. Incubare le cellule trasfettate Plat-E durante la notte in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Registrare il tempo di trasfezione.
  3. Semina di HCN4-GFP fibroblasti embrionali di topo.
    1. 1 h prima della placcatura MEF, preparare un 24-pozzetti per immunocitochimica.
      1. Aggiungere un fibronectina coprioggetto 12 millimetri per pozzetto.
      2. Pozzi cappotto con 300 ml di soluzione di collagene bovino (ad esempio, SureCoat) e incubare in un incubatore a 37 ° per 1 ora.
      3. soluzione di rivestimento Aspirare immediatamente prima placcatura MEF.
    2. Scongelare una fiala congelata di HCN4-GFP MEF e lavare x1 con fibrobl pre-riscaldatosupporti AST a 500 xg per 5 min.
    3. Determinare la vitalità delle cellule utilizzando trypan esclusione blu o coloranti simili. Calcolare il numero di cellule vitali per ml di coltura utilizzando la seguente formula:
      % cellule vitali = [1.00 - (Numero di celle blu / numero di cellule totali)] x 100
      1. Calcolare il numero totale di cellule vitali utilizzando la seguente formula:
        Le cellule vitali =% cellule vitali x fattore di diluizione x 10.000 x volume totale della sospensione cellulare
    4. Seed 3 x 10 4 cellule per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti con collagene bovino coprioggetto soluzione fibronectina precedentemente preparato.
  4. La trasduzione e riprogrammazione di MEF
    NOTA: Secondo le note del produttore, corretta manutenzione cellule Plat-E producono un titolo medio di 1 x 10 7 unità di infezione / mL. Anche se il titolo non viene misurato direttamente per ogni esperimento, un controllo GFP è sempre inclusa come un surrogato per l'efficienza infezione.Espressione alta GFP e l'intensità (GFP +> 95%) correla generalmente con successo generazione GHMT-mediata di iCLMs.
    1. Giorno 0: 24 ore dopo la trasfezione, filtrare il medium retrovirale PE attraverso una dimensione del filtro di acetato 0,45 micron-pori senza tensioattivi di cellulosa e trasferimento in un tubo da 15 ml. Aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 8 mg / mL. ricostituire con attenzione le cellule con 2 ml di terreno fresco trasfezione.
      NOTA: Le cellule facilmente staccano dalla piastra se il supporto è cambiato troppo rapidamente.
    2. Aspirare il mezzo di coltura delle MEF e aggiungere il supporto retrovirale appena raccolti; esso dovrebbe produrre 1,7 ml di mezzi per pozzetto di un 6-pozzetti. Aggiungere ~ 800 ml per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Rientro piatto MEF per l'incubatore e incubare una notte.
    3. Giorno 1: ripetere le fasi 2.4.1 e 2.4.2. Eliminare le celle dopo la collezione di virus 2 °. Rientro MEF infetti per l'incubatore e lasciarli riposare durante la notte.
    4. 2 ° giorno: 48 ore dopo l'induzione, aspirare il cellulare condizionata media e lavare x1 con PBS 1x. Aggiungere i media iCLM 500 ml di pre-riscaldato per pozzetto di una piastra ben 24.
    5. Sostituire i media iCLM ogni 2 - 3 giorni. Placca di 14 giorni dopo l'induzione virale per immunocitochimica (ICC) analisi della riprogrammazione cardiaco.

3. Immunocolorazione di MEF riprogrammato

  1. 14 giorni post-induzione, aspirare accuratamente la media.
  2. Lavare ogni pozzetto con 300 ml di 1x PBS ghiacciato. Aspirare la soluzione in eccesso.
  3. Fissare le cellule con 250 ml di paraformaldeide soluzione al 4% (PFA) per pozzetto di una piastra ben 24. Incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: fisso cellule possono essere conservate in PBS a 4 ° C per 1 - 2 settimane prima colorazione.
  4. cellule permeabilize da Wells lavaggio x3 con 300 microlitri di 0.1% PBS-TritonX 100 (PBST). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Aspirare la soluzione in eccesso dopo l'ultimo lavaggio.
  5. Blocco per 10minuti a temperatura ambiente con 1x universale blocchetto a 300 ml / pozzetto.
  6. Preparare buffer di colorazione (ICC): Aggiungere 1: 1 di PBS 1x e 1x universale tampone di bloccaggio. Diluire gli anticorpi primari nel buffer di colorazione ICC e incubare anticorpi notte a 4 ° C. Fare riferimento alla sezione materiale per diluizioni raccomandate.
    1. Macchia un paio di diapositive con il mouse α-actinina, αGFP pollo e coniglio NPPA per iPM e l'identificazione iAM.
    2. Macchia un paio di diapositive con il mouse α-actinina, αGFP pollo e di coniglio per MYL2 iPM e IVM identificazione.
  7. Il giorno seguente, lavare i pozzetti x3 con 300 microlitri di 0.1% PBST. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Aspirare la soluzione in eccesso dopo l'ultimo lavaggio.
  8. Preparare le diluizioni degli anticorpi secondari nel buffer ICC colorazione. Fare riferimento alla sezione materiale per diluizioni raccomandate. Incubare anticorpi secondari 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
    1. Macchia tutte le diapositive con il seguente antibodie secondarias: il mouse Alexa-555, pollo Alexa-488, e coniglio Alexa-647.
  9. Lavare pozzi x3 con 300 microlitri di 0.1% PBST. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Proteggere dalla luce.
  10. Aggiungere 2,4 ml di mezzo di montaggio contenenti 1,5 mg / mL di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) su un vetrino per microscopio. Rimuovere con attenzione il vetrino dal pozzo della piastra 24 pozzetti, rimuovere la soluzione in eccesso, e trasferire al vetrino con mezzi di montaggio. Premere delicatamente il vetrino per rimuovere l'eccesso di volume e l'aria.
  11. diapositive Seal con smalto preferito o sigillante di plastica. Conservare diapositive montate a 4 ° C al riparo dalla luce.

4. Identificazione di cardiache sottotipi Utilizzando Microscopia confocale

NOTA: Per l'imaging, un microscopio confocale dotato di almeno 2 rivelatori fluorescenti capaci di rilevazione spettrale a 405, 488, 555 e 639 nm lunghezza d'onda necessaria per identificare IPM, Iams, e IVMS. imagcellule e utilizzando un piano-Apochromat 20X / 0.75 obiettivo o migliore. Utilizzando il software di analisi di immagine del produttore, la digitalizzazione delle immagini dello zoom può ottenere immagini di qualità ad immersione 40X-petrolio.

  1. libreria Immagine: prendere immagini a 8 bit con DAPI, Alexa-488, Alexa-555, e Alexa-647 canali (cap.). Pixel tempo di sosta di 6 s, 1024 dimensione del frame, passo la linea a 2, e la media dei 2 è sufficiente per immagini ad alta risoluzione.
  2. Per ogni diapositiva, iniziare da un bordo e iniziare la scansione su e giù nel canale rosso fluorescente (ch.) Per le cellule sarcomere + α-actinina + (Fare riferimento alla Figura 3 e Figura 5A per gli esempi). striature sarcomere sono più facili da identificare visivamente nella lunghezza d'onda 555 nm.
    1. Una volta che un α-actinina + cellule sarcomere + è stato identificato, passare alla ch verde. e di tenere nota se è positivo (IPM). Passare al computer per valutare il far-rosso 647 ch. (IAM o IVM).
      Nota: le celle che sonoα-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 - sono designati come IPMS. Espressione GFP sarà visto in tutta la cella (Figura 4A).
    2. diapositive macchia con α-actinina (mouse Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), NPPA (coniglio-Alexa647) e DAPI. Le cellule che sono α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / NPPA + sono iAM. NPPA colorazione apparirà perinucleare e puntiformi (Figura 4B).
    3. diapositive macchia con α-actinina (mouse Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), MYL2 (coniglio-Alexa647). Cellule positive per la α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / + MYL2 sono IVMS. MYL2 colorazione esporrà una forma striato lungo il filamento sarcomero. A causa di variazioni nella qualità della colorazione e Z-plane, striature non sono sempre facilmente visibili (Figura 4C).

5. quantificazione

NOTA: Per valutare il numero effettivo di MEF potenzialmente riprogrammati, 2 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti vengono seminate in parallelo ai pozzetti sperimentali sono raccolte un giorno dopo la placcatura. Il numero totale di cellule piastrate è quindi determinata dalla media dei due pozzetti. Questo diventa le cellule totali effettivi cromato (atotal).

  1. sarcomere +
    1. Visivamente ogni cella su un vetrino per la corretta α-actinina + / sarcomero + (pannelli di destra Figura 3) e registrare (Figura 5B-i).
    2. Tabulare il numero totale di α-actinina + / + sarcomere su ogni vetrino e dividere per le cellule totali effettivi cromato (atotal) (Figura 5B-III). Ad esempio, se atotal = 12.500 cellule, e 100 cellule sono state alfa-actinina + / + sarcomere poi, 0,8% dei MEF placcati stati riprogrammato. Una mediareprograming esperimento produrrà cellule 1% alfa-actinina + / sarcomero + (Figura 5C).
  2. sottotipo +
    NOTA: Per le seguenti operazioni, fare riferimento alla Figura 5B / C per un flusso di lavoro rappresentante iCLM quantificazione. In breve, per ogni sarcomero + cellulare, tabulare se è unica sia per il sottotipo (Figura 5B-i). Calcolare% sottotipo (Figura 5B-iii) dividendo il numero di cellule sottotipo + sul sarcomere media + cellule x 100 (Figura 5B-i). Per calcolare l'assoluta efficienza% sottotipo (Figura 5B-IV), dividere il numero sottotipo + cellulare da figura 5B-i per il numero totale di cellule seminate x 100 (Figura 5B-ii).
    1. Per le celle ciascuno di α-actinina + / + sarcomere, valutare se sono GFP +, NPPA +, o MYL2 +.
    2. Tabulare numero totale di α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 -, actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / NPPA +, e α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - + cellule / MYL2 (Figura 5B-i).
    3. Per calcolare la percentuale di ciascun sottotipo, dividere il numero di cellule Sottotip + per il numero totale di α-actinina + / + cellule sarcomere in che pure e moltiplicare per 100. GHMT genera IPMS, Iams, e IVMS più o meno uguali rapporti (Figura 5B-III).
    4. Per calcolare il numero assoluto di sottotipo + cellule, dividere il numero totale di sottotipo + cellule per la condizione sperimentale atotal e moltiplicare per 100 (Figura 5B-ii). Su IPMS media rappresentano lo 0,3% della popolazione cellulare infettata totale, Iams 0,3%, eIVMS 0,25% (Figura 5B-iv).

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Risultati

Approfittando della PM-specifica del mouse giornalista, abbiamo sviluppato una strategia immunocolorazione multiplex per identificare i diversi miociti endogeni come illustrato nella figura 1. Seguendo la procedura di riprogrammazione mostrati nella Figura 2, l'induzione di CM specifici del sottotipo può essere rilevato fin dal giorno 4 21, anche se ad un basso tasso. Entro il giorno 14, l'esperimento può essere fermato e ...

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Discussione

Il presente studio fornisce una strategia a riprogrammazione diretta per la conversione di MEF in un insieme diversificato di sottotipi cardiaci tramite espressione retrovirus-mediata della trascrizione cardiaco fattori Gata4, MEF2C, Tbx5, e Hand2 (GHMT). Utilizzando un approccio immunocolorazione multiplex in combinazione con un PM-specifica del mouse giornalista, siamo in grado di identificare iAM, IVMS, e IPMS ad una risoluzione di singola cellula. Tale test permette una sperimentazione in vitro sistema in g...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

A.F.-P. è stato supportato dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship con sovvenzione n. 2015165336. N.V.M è stato sostenuto da sovvenzioni del NIH (HL094699), del Burroughs Wellcome Fund (1009838) e della March of Dimes (#5-FY14-203). Ringraziamo Young-Jae Nam, Christina Lubczyk e Minoti Bhakta per i loro importanti contributi allo sviluppo del protocollo e all'analisi dei dati. Ringraziamo anche John Shelton per il prezioso contributo tecnico e i membri del laboratorio Munshi per la discussione scientifica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMSigmaD5796Componente di terreni iCLM, terreni Plat-E, fibroblasti e terreni di trasfezione
Terreno 199Thermo Fisher Scientific11150059Componente di terreni iCLM
Siero fetale bovino (FBS)SigmaF2442Componente di terreni iCLM, terreni Plat-E, fibroblasti e terreni di trasfezione
Insulina-Transferrina-Selenio GThermo Fisher Scientific41400-045Componente dei terreni iCLM
Soluzione vitaminica MEMThermo Fisher Scientific11120-052Componente dei terreni iCLM
Aminoacidi MEMThermo Fisher Scientific1601149Componente dei terreni iCLM
Aminoacidi non essenzialiThermo Fisher Scientific11140-050Componente dei terreni iCLM
Antibiotici-AntimicoticiThermo Fisher Scientific15240062Componente dell'integratore B-27 iCLM media
Thermo Fisher Scientific17504044Componente dei terreni iCLM
Siero di cavallo inattivato termicamenteThermo Fisher Scientific26050-088Componente dei terreni iCLM
NaPyruvatoThermo Fisher Scientific11360-70Componente dei terreni iCLM
Penicillina/StreptomicinaThermo Fisher Scientific1514022Componente dei terreni Plat-E e dei terreni per fibroblasti
Puromicina Thermo Fisher ScientificA11139-03Componente del terreno Plat-E
Blasticidin   Gemini Bio-Products400-128PComponente del terreno Plat-E
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Componente del terreno per fibroblasti
Scansione laser confocale LSM700ZeissPer analisi confocale
Reagente di trasfezione FuGENE 6 ReagentePromegaE2692Reagente di trasfezione 
Opti-MEM Siero Ridotto MediumThermo Fisher Scientific31985-070Reagente di trasfezione 
PolybreneMilliporeTR-1003-GReagente di induzione. Utilizzare ad una concentrazione finale di 8 μ M/mL
Platinium-E (PE) Linea cellulare di packagin retroviralecellula ecotropicaBiolabsRV-101Linea cellulare di pacatura retrovirale
Tripsina 0,25% EDTAThermo Fisher ScientificPer MEFs e dissociazione Plat-E
Topo anti &alfa;-actinina (clone EA-53)Anticorpo SigmaA7811per analisi confocale. Utilizzare in 1:200
Pollo anti-GFP IgY ThermoFisher ScientificA10262Anticorpo per analisi confocale. Utilizzare in scala 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA Anticorpo AbgentAP8534Aper analisi confocale. Utilizzare a 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG ProteinTech10906-1-APAnticorpo per analisi confocale. Utilizzare in soluzione 1:200
Vectashield con DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)Vector LabsH-1500Colorante per analisi confocale
Superfrost Plus Vetrini per microscopioThermo Fisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1,0 mm
BioCoat Fibronectina 12 mm Vetrini coprioggettiNeuVitro CorpGG-12-1.5Vetrini coprioggetti per analisi confocali
100 μ filtro cellulare mThermo Fisher Scientific08-771-19
0.45 μ m Siringhe filtri SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106Per filtrazione virus
6 mL SiringheCovidien8881516937Per filtrazione virus
Capra anti-Pollo IgY (H& L) A488AbcamAB150169Anticorpo secondario per analisi confocale. Utilizzare a 1:400
Asino anti-coniglio A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573Anticorpo secondario per analisi confocale. Utilizzare in 1:400
IgG(H+L) anti-topo di capra A555Thermo Fisher ScientificA21422Anticorpo secondario per analisi confocale. Utilizzare a 1:400
Triton X-100Sigma93443-100mlPer permeabilizzazione cellulare 
PBS di Dulbecco senza CaCl2 e MgCl2 (D-PBS)SigmaD8537
Power Block 10x Reagente bloccante universaleThermo Fisher ScientificNC9495720Diluire a 1x in H2O
16% Soluzione acquosa di paraformaldeide (PFA)Scienze dell'elettromicroscopia 15710Utilizzare al 4% diluito in dH2O
piastre da 6 cm Piastre Olympus25-260
6 pozzettiGenesee Scientific25-105
Piastre a 24 pozzettiGenesee Scientific25-107
Piastre per coltura tissutale da 10 cmCorning4239
15 cm  Piastre per coltura tissutaleThermo Fisher Scientific5442
Provette coniche da 15 mLCorning4308
Provette coniche da 50 mLCorning4249
Soluzione di blu di tripano allo 0,4%SigmaT8154Per la vitalità
Alcool etilico a prova 200Thermo Fisher Scientific7005
CandegginaThermo Fisher Scientifico6009
, a

Riferimenti

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