Method Article

Analisi trascrittomica di C. elegans RNA Sequencing dati attraverso la suite Tuxedo sul Progetto Galaxy

DOI:

10.3791/55473

April 8th, 2017

In This Article

Summary

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Galaxy e David sono emersi come strumenti popolari che permettono ai ricercatori senza formazione bioinformatica per analizzare e interpretare i dati di RNA-Seq. Descriviamo un protocollo per la C. elegans ai ricercatori di effettuare RNA-Seq esperimenti, l'accesso ed elaborare il set di dati utilizzando Galaxy e ottenere informazioni biologiche significative dalle liste di geni con David.

Abstract

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Next generation sequencing (NGS) tecnologie hanno rivoluzionato la natura della ricerca biologica. Di questi, RNA Sequencing (RNA-Seq) è emersa come un potente strumento per l'analisi di espressione genica e la mappatura del trascrittoma. Tuttavia, la manipolazione serie di dati di RNA-Seq richiede sofisticate competenze computazionali e pone sfide insite per i ricercatori di biologia. Questo collo di bottiglia è stato mitigato dal progetto open access Galaxy che permette agli utenti senza competenze di bioinformatica per l'analisi dei dati di RNA-Seq, e la base di dati per l'annotazione, la visualizzazione e integrato Discovery (David), un Gene Ontology (GO) Suite analisi termine che aiuta derivare significato biologico da grandi insiemi di dati. Tuttavia, per gli utenti prima volta e dilettanti bioinformatica, auto-apprendimento e la familiarizzazione con queste piattaforme può richiedere molto tempo e scoraggiante. Descriviamo un flusso di lavoro semplice che vi aiuterà a C. elegans ai ricercatori di isolare l'RNA a vite senza fine, condurre un esperimento di RNA-Seqe analizzare i dati utilizzando piattaforme Galaxy e David. Questo protocollo fornisce istruzioni graduali per l'utilizzo dei vari moduli Galaxy per l'accesso ai dati grezzi NGS, alcun controllo di qualità, l'allineamento e analisi differenziale espressione genica, guidando l'utente con i parametri ad ogni passo di generare un elenco gene che può essere proiettato per l'arricchimento di classi di geni o processi biologici con David. Nel complesso, prevediamo che questo articolo vi fornirà le informazioni di C. elegans ricercatori che effettuano esperimenti di RNA-Seq per la prima volta così come gli utenti che eseguono frequenti un piccolo numero di campioni.

Introduction

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Il primo sequenziamento del genoma umano, effettuata con il metodo dideoxynucleotide-sequenziamento di Fred Sanger, sono voluti 10 anni, con un costo stimato US $ 3 miliardi di 1, 2. Tuttavia, in poco più di un decennio, sin dal suo inizio, Next-Generation Sequencing Technology (NGS) ha reso possibile sequenziare l'intero genoma umano entro due settimane e per US $ 1.000. Nuovi strumenti che permettono di NGS sempre crescente velocità di raccolta sequenziamento-dati con incredibile efficienza, con una riduzione dei costi vivi, stanno rivoluzionando la biologia moderna in modi inimmaginabili, come i proget....

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Protocol

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Isolamento 1. RNA

  1. Misure precauzionali
    1. Pulire l'intera superficie di lavoro, strumenti e pipette usando uno spray RNase disponibile in commercio per eliminare eventuali RNasi presenti.
    2. Indossare guanti in ogni momento, cambiarle regolarmente con quelli freschi durante le diverse fasi del protocollo.
    3. Utilizzare solo puntali con filtro e conservare tutti i campioni in ghiaccio il più possibile per evitare la degradazione dell'RNA.
      NOTA: Al fine di ottenere i migliori dati da piattaforme NGS, è fondamentale per iniziare con l'RNA di alta qualità. isolamento dell'RNA e preparazione metodi variano a seconda del....

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Results

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In C. elegans, eliminazione delle cellule staminali germinali (GSC) si estende durata, aumenta lo stress resilienza, ed eleva il grasso corporeo 24, 28. Perdita di GSCs, sia causata da laser ablazione o da mutazioni come GLP-1, provoca estensione durata attraverso l'attivazione di una rete di fattori di trascrizione 29. Uno di questi fattori, tCER-1, codifica l'omologo verme della trascri.......

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Discussion

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Significato della Sequencing Platform Galaxy in Biologia moderna

Il progetto Galaxy è diventato determinante per aiutare i biologi senza l'addestramento bioinformatica per elaborare e analizzare high-throughput di dati di sequenziamento in maniera veloce ed efficiente. Una volta considerato un compito erculeo, questa piattaforma pubblicamente disponibile ha fatto in esecuzione di algoritmi di bioinformatica complessi per analizzare i dati NGS un processo semplice, affidabile e facile. Oltre.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Gli autori desiderano esprimere la loro gratitudine ai laboratori, gruppi e gli individui che hanno sviluppato Galaxy e David, e quindi fatte NGS ampiamente accessibile per la comunità scientifica. L'aiuto e consulenza fornita dai colleghi presso l'Università di Pittsburgh durante il nostro allenamento bioinformatica è riconosciuto. Questo lavoro è stato supportato da un Ellison Medical Foundation di New Scholar in Aging premio (AG-NS-0879-12) e di una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (R01AG051659) per AG.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RNasi spray Fisher Scientific21-402-178
Trizol Ambion15596026
SonicatorSonics Vibra Cell Centrifuga VCX130
Cloroformio Eppendorf5415C
Sigma Aldrich288306
2-propanolo Fisher ScientificA416P-4
EthanolDecon Labs2705HC
Acqua priva di RNasi ScientificBP561-1
Bioanalizzatore AgilentG2940CA
Mac/PC
Fisher

References

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  1. Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
  2. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  3. Afgan, E., et al.

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C elegans RNA SequencingRNA Seq AnalysisGalaxy Project WorkflowDAVID Functional AnnotationNGS Data AnalysisDifferential Gene ExpressionTranscriptome MappingGene Ontology AnalysisQuality Control ChecksCufflinks Tool

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