Qui riportiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura che produce peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza, in grado di formare oligomeri. L'amiloide-beta è un peptide idrofobico altamente incline all'aggregazione implicato nella malattia di Alzheimer. La natura amiloidogenica del peptide rende la sua purificazione una sfida.
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Articolo metodologico
Un Tailored HPLC purificazione protocollo che i rendimenti di elevata purezza beta-amiloide 42 e beta amiloide 40 peptidi, in grado di Oligomer Formazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
I peptidi amiloidogenici come l'amiloide-beta (Aβ) implicata nel morbo di Alzheimer, possono rappresentare una sfida significativa quando si cerca di ottenere materiale di elevata purezza. Qui presentiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura per produrre peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza. Abbiamo scoperto che la combinazione di poli(stirene/divinilbenzene) in fase stazionaria idrofobica disponibile in commercio, polimeri in laboratorio in fase inversa - stirenedivinilbenzene (PLRP-S) in condizioni di pH elevato, consente il raggiungimento di un'elevata purezza (>95%) Aβ42 in un singolo ciclo cromatografico. La purificazione è altamente riproducibile e può essere modificata sia in condizioni semi-preparative che analitiche a seconda della quantità di materiale che si desidera purificare. Il protocollo può essere applicato anche al peptide Aβ40 con identico successo e senza la necessità di modificare il metodo.
Introduzione
La malattia di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa che colpisce oltre 35 milioni di persone in tutto il mondo. 1 Fortemente implicato nell'insorgenza e nello sviluppo della malattia, è il peptide idrofobico altamente incline all'aggregazione, l'amiloide-beta (Aβ). 2 Aβ varia da 36 a 43 amminoacidi in lunghezza, tuttavia, si pensa che la variante di 42 aminoacidi, l'amiloide-beta 42 (Aβ42), sia la forma più tossica della proteina. 3 Ciò è dovuto in gran parte alla capacità di Aβ42 di formare facilmente specie oligomeriche diffusibili che si ritiene siano entità particolarmente neurotossiche.....
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Protocollo
1. Purificazione mediante HPLC preparativa del peptide Aβ40 o Aβ42
- Preparare i seguenti tamponi per la purificazione tramite HPLC.
- Preparare il tampone A (20 mM NH4OH) aggiungendo 1,3 mL di NH4OH (soluzione al 28%) a 1.000 mL di acqua ultrapura.
- Preparare il tampone B (acetonitrile all'80% con 20 mM NH4OH) aggiungendo 1,3 mL di NH4OH (soluzione al 28%) a una soluzione di 800 mL di acetonitrile di grado HPLC e 200 mL di acqua ultrapura.
- Preparare il tampone per la dissoluzione del campione (0,1% NH4OH) aggiungendo 100 µL di NH4OH (soluzione a....
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Risultati
La purificazione del peptide Aβ42 mediante l'uso combinato della fase stazionaria PLRP-S e di una fase mobile ad alto pH determina la formazione di un picco nitido e ben risolto per il peptide Aβ con un tempo di ritenzione compreso tra 72 e 74 minuti (Figura 2C). La conferma dell'identità del picco avviene mediante spettrometria di massa con iniezione diretta dell'eluito raccolto. L'eluito può essere conservato a -20 °C in soluzione per un massimo di 12 h. Periodi di cons.......
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Discussione
La purificazione HPLC del peptide Aβ dipende fortemente dalla scelta sia della fase stazionaria impiegata nella purificazione che della fase mobile scelta per eluire il peptide. Il basso punto isoelettrico del peptide e l'elevata propensione all'aggregazione rendono difficili le condizioni cromatografiche tradizionali per la separazione delle proteine idrofobiche (fase stazionaria C4 o C8 accoppiata a un eluente mobile acido), con l'eluizione del peptide Aβ come un picco ampio prolungato e non risolto (Figura 2A<.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Agilent per la loro assistenza tecnica. Kate Markham e Rafael Palomino sono accreditati per il loro aiuto iniziale nella sintesi e purificazione del peptide Aβ e il dottor Hsiau-Wei Lee è ringraziato per il suo aiuto nella preparazione della Figura 1 del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pompa trimestrale Agilent 1260 Infinity II | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Rivelatore a doppia lunghezza d'onda variabile | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Iniettore manuale Agilent 1260 Infinity II dotato di ansa per campioni in acciaio inossidabile da 10 mL | Iniettore manuale Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Iniettore manuale Agilent 1260 Infinity II dotato di 20 µ L anello di campionamento in acciaio inox | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Staffa di montaggio per supporto ad anello | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 Å 5 µ m 4,6 x 250 mm (analitico) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ 42 o Aβ 40 peptide | Sintetizzato internamente utilizzando un sintetizzatore di peptidi automatizzato CEM liberty. | ||
| Idrossido di ammonio (NH4OH, soluzione al 28%) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Acqua di grado HPLC | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 mL provetta da centrifuga conica | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Raccordo Supelco PEEK Giunto monopezzo a serramanico, confezione da 5 cad | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5 siringa sterile cc | Fisher Scientific 1481729 | ||
| ago SS calibro 16 | Rheodyne | 3725-086 |
Riferimenti
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer's disease....
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Ristampe e permessi
