Qui riportiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura che produce peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza, in grado di formare oligomeri. L'amiloide-beta è un peptide idrofobico altamente incline all'aggregazione implicato nella malattia di Alzheimer. La natura amiloidogenica del peptide rende la sua purificazione una sfida.
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Articolo metodologico
Un Tailored HPLC purificazione protocollo che i rendimenti di elevata purezza beta-amiloide 42 e beta amiloide 40 peptidi, in grado di Oligomer Formazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
I peptidi amiloidogenici come l'amiloide-beta (Aβ) implicata nel morbo di Alzheimer, possono rappresentare una sfida significativa quando si cerca di ottenere materiale di elevata purezza. Qui presentiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura per produrre peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza. Abbiamo scoperto che la combinazione di poli(stirene/divinilbenzene) in fase stazionaria idrofobica disponibile in commercio, polimeri in laboratorio in fase inversa - stirenedivinilbenzene (PLRP-S) in condizioni di pH elevato, consente il raggiungimento di un'elevata purezza (>95%) Aβ42 in un singolo ciclo cromatografico. La purificazione è altamente riproducibile e può essere modificata sia in condizioni semi-preparative che analitiche a seconda della quantità di materiale che si desidera purificare. Il protocollo può essere applicato anche al peptide Aβ40 con identico successo e senza la necessità di modificare il metodo.
Introduzione
La malattia di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa che colpisce oltre 35 milioni di persone in tutto il mondo. 1 Fortemente implicato nell'insorgenza e nello sviluppo della malattia, è il peptide idrofobico altamente incline all'aggregazione, l'amiloide-beta (Aβ). 2 Aβ varia da 36 a 43 amminoacidi in lunghezza, tuttavia, si pensa che la variante di 42 aminoacidi, l'amiloide-beta 42 (Aβ42), sia la forma più tossica della proteina. 3 Ciò è dovuto in gran parte alla capacità di Aβ42 di formare facilmente specie oligomeriche diffusibili che si ritiene siano entità particolarmente neurotossiche. 4 Per approfondire la nostra comprensione del peptide Aβ, è essenziale ottenere regolarmente materiale ad alta purezza. È stato dimostrato che la presenza di tracce di impurità altera drasticamente le proprietà di propensione all'aggregazione del peptide. 5
Tradizionalmente, la separazione con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) di peptidi idrofobici come l'Aβ è stata effettuata attraverso l'uso di una combinazione di fasi stazionarie a base di silice C4 oC 8 e una fase mobile acida. 6 Tuttavia, tali condizioni possono rappresentare una sfida per la purificazione del peptide. Il basso punto isoelettrico del peptide Aβ (pI circa 5,5)7 significa che in condizioni acide, l'aggregazione peptidica è aumentata e di conseguenza si producono picchi HPLC ampi e non risolti, spesso difficili da isolare (Figura 2A). Inoltre, tali picchi ampi spesso contengono impurità che possono influire sul profilo di aggregazione del peptide e richiedono comunemente cicli successivi di purificazione che possono avere un impatto drammatico sulla quantità di peptide prodotto.
La fase stazionaria di poli(stirene/divinilbenzene), PLRP-S, rappresenta un mezzo alternativo per purificare i peptidi idrofobici. La fase stazionaria è stata impiegata nella purificazione di un certo numero di diverse proteine e acidi ribonucleici messaggeri (mRNA). 8,9 La fase stazionaria PLRP-S non richiede alcun ligando alchilico aggiuntivo per la separazione della fase inversa e, cosa più importante, è chimicamente stabile ad un pH elevato, il che porta alla deaggregazione del peptide. 7 Qui, riportiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura che produce peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza.
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Protocollo
1. Purificazione mediante HPLC preparativa del peptide Aβ40 o Aβ42
- Preparare i seguenti tamponi per la purificazione tramite HPLC.
- Preparare il tampone A (20 mM NH4OH) aggiungendo 1,3 mL di NH4OH (soluzione al 28%) a 1.000 mL di acqua ultrapura.
- Preparare il tampone B (acetonitrile all'80% con 20 mM NH4OH) aggiungendo 1,3 mL di NH4OH (soluzione al 28%) a una soluzione di 800 mL di acetonitrile di grado HPLC e 200 mL di acqua ultrapura.
- Preparare il tampone per la dissoluzione del campione (0,1% NH4OH) aggiungendo 100 µL di NH4OH (soluzione al 28%) a 100 mL di acqua ultrapura.
- Configurare lo strumento HPLC come mostrato nella Figura 1.
- Collegare le bottiglie dei solventi contenenti il tampone A e il tampone B agli ingressi della pompa HPLC utilizzando tubi in polimero. Fissare i tubi in polimero alla pompa HPLC con un raccordo monopezzo. Assicurarsi che ciascun tubo in polimero sia collegato all'ingresso corretto dello strumento. Equipaggiare la pompa HPLC con un degasatore.
- Collegare la pompa HPLC all'ingresso della colonna preparativa da 300 Å 8 µm 25 mm х 300 mm (Figura 1B, colonna più a sinistra, vedere Elenco Materiali) utilizzando tubi in polimero.
- Fissare il tubo in polimero alla colonna preparativa con un raccordo monopezzo avvitato a mano. Verificare che il tubo in polimero sia orientato correttamente.
NOTA: La fase stazionaria della colonna preparativa è composta da particelle di poli(stirene-divinilbenzene). L'orientamento corretto del tubo in polimero è indicato sull'involucro esterno con una singola freccia direzionale.
- Fissare il tubo in polimero alla colonna preparativa con un raccordo monopezzo avvitato a mano. Verificare che il tubo in polimero sia orientato correttamente.
- Collegare l'uscita della colonna al detector a doppia lunghezza d'onda utilizzando tubi in polimero e impostare il detector alle lunghezze d'onda di 214 nm e 280 nm.
- Modificare la lunghezza d'onda modificando i parametri di lunghezza d'onda di rilevamento nell'opzione del metodo strumento della configurazione del software HPLC integrato.
- Collegare il tubo in polimero all'ingresso del detector di lunghezza d'onda con un raccordo monopezzo avvitato a mano. Collegare un tubo in polimero alla valvola di uscita del detector di lunghezza d'onda. Collegare il tubo in polimero alla valvola di uscita del detector HPLC con un raccordo monopezzo avvitato a mano. Questo sarà il tubo per la raccolta del campione.
NOTA: L'assenza di un cromoforo forte sul peptide Aβ impone l'utilizzo di 214 nm come lunghezza d'onda ultravioletta (UV) principale per la raccolta dei picchi.
Figura 1: Impostazione sperimentale dello strumento HPLC utilizzato per la purificazione dei peptidi beta-amiloide. (A) La pompa HPLC quaternaria dotata di degassatore e rivelatore a lunghezza d'onda variabile impostato a 214 nm e 280 nm; (B) Colonne HPLC utilizzate per la purificazione dei peptidi beta-amiloide, da sinistra a destra: colonna preparativa 25 x 300 mm2, colonna semipreparativa 7.5 x 300 mm2 e colonna analitica 4.6 x 250 mm2; (C) Iniettore manuale con loop d'iniezione in acciaio inossidabile da 20 µL utilizzato per l'HPLC analitica; (D) Iniettore manuale con loop d'iniezione in acciaio inossidabile da 10 mL utilizzato per la purificazione preparativa e semipreparativa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
- Programmare il software dell'HPLC per eseguire il metodo di purificazione riportato nella Tabella 1. Inserire il metodo di purificazione modificando il parametro della tabella dei solventi (nell'opzione di configurazione del metodo dello strumento presente nel software dell'HPLC). Accendere la pompa dell'HPLC cliccando sul pulsante "on" nel software dell'HPLC.
NOTA: La pompa inizierà a fornire il rapporto iniziale tra tampone A e tampone B attraverso la colonna preparativa e lo strumento HPLC.- Lasciare il sistema in equilibrio per 30 min.
| Tempo / min | % del Buffer Aa | % del Buffer Bb | Portatad / mL min-1 |
| 0 | 80 | 20 | 6 |
| 45 | 75,5 | 24,5 | 6 |
| 45,01 | 80 | 20 | 6 |
| 52,01 | 80 | 20 | 6 |
| 52,02 | 73 | 27 | 6 |
| 85 | 73 | 27 | 6 |
| 92 | 5 | 95c | 6 |
Tabella 1: Cronogramma per la purificazione dei peptidi Aβ42 e Aβ40 mediante la colonna polimerica 25 × 300 mm. aBuffer A - H2O con 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O con 20 mM NH4OH; cEseguito per 15 min per lavare la colonna prima della successiva iniezione del campione; dPer eseguire una portata di 6 mL/min sugli strumenti HPLC, il limite di pressione deve essere ridotto a 200 bar.
- Purificazione del campione di peptidi Aβ
Nota: Il peptido grezzo è stato ottenuto mediante sintesi peptidica automatizzata in fase solida.10- Sciogliere 3 mg di peptido Aβ grezzo in 4 mL di tampone di dissoluzione del campione. Sottoporre il campione a sonicazione per 30-60 s a temperatura ambiente e a una frequenza di 40 kHz per favorire la dissoluzione.
- Introdurre l'intero campione sulla colonna HPLC utilizzando una siringa di plastica da 5 mL munita di un ago in acciaio inossidabile da 16 gauge. Eseguire il metodo di purificazione come descritto al punto 1.3.
NOTA: Il sistema consente l'iniezione del campione mediante un iniettore manuale munito di un loop di iniezione in acciaio inossidabile da 10 mL (Figura 1D). Il peptido Aβ desiderato eluisce tra 72 e 74 minuti come un picco nitido e risolto (Figura 2C). - Raccogliere il campione in un tubo conico da centrifuga da 50 mL. Confermare l'identità del picco di Aβ mediante spettrometria di massa con iniezione diretta dell'eluito raccolto.11 Conservare l'eluito fino a 12 h a -20 °C.
NOTA: Non è consigliabile conservare la soluzione per periodi superiori a 12 h a causa del potenziale rischio di ossidazione del peptido. - Isolare il peptido purificato congelando rapidamente l'aliquota/aliquote raccolte di peptido Aβ in azoto liquido e liofilizzando. Eseguire la liofilizzazione sottoponendo il campione a liofilizzazione a una temperatura di -60 °C e una pressione di 20 mTorr per un periodo di 24 h.
- Eseguire il protocollo HPLC analitica come descritto di seguito per determinare la purezza del peptido Aβ. Conservare i peptidi in forma liofilizzata a -20 °C per un periodo fino a 6 mesi.
2. Analisi HPLC analitica della proteina Aβ purificata
- Preparare i tamponi per HPLC come indicato al punto 1.1. del protocollo sopra riportato.
- Configurare la HPLC analitica come descritto al passaggio 1.2.1 e illustrato in Figura 1, utilizzando la colonna analitica da 4,6 × 250 mm (Figura 1B, colonna più a destra) e l'inalatore manuale con un loop di iniezione in acciaio inossidabile da 20 µL (Figura 1C) montato sull'apparecchiatura.
- Programmare il software della HPLC per eseguire il metodo analitico riportato in Tabella 2, seguendo istruzioni simili a quelle del passaggio 1.3.
| Tempo / min | % del Buffer Aa | % del Buffer Bb | Portata / mL min-1 |
| 0 | 95 | 5 | 1 |
| 30 | 50 | 50 | 1 |
Tabella 2: Cronogramma per l'analisi della purezza tramite HPLC del peptide Aβ. aBuffer A - H2O con 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O con 20 mM NH4OH.
- Analisi della purezza del peptide Aβ
- Preparare una soluzione di 1 mg/mL del peptide purificato sciogliendo il peptide nella soluzione tampone per campioni.
NOTA: La ricetta del tampone è riportata nel sottoparagrafo 1.1. La concentrazione proteica viene determinata misurando l'assorbanza della proteina a 280 nm (A280 nm).12 Il coefficiente di estinzione molare (ε) utilizzato per determinare la concentrazione è ε = 1.490 dm3 mol-1 cm-1.13 - Iniettare 20 µL di 1 mg/mL (222 µM) soluzione sulla colonna HPLC ed eseguire il metodo analitico impostato al punto 2.3.
NOTA: La soluzione rimanente non utilizzata per l'analisi può essere congelata rapidamente in azoto liquido e liofilizzata per recuperare il peptide Aβ. I dettagli della liofilizzazione sono riportati nel sottoparagrafo 1.4.4. Il peptide Aβ eluirà dalla colonna analitica tra 16 e 18 minuti (Figura 2D). Utilizzare il software di analisi integrata fornito con lo strumento HPLC per determinare la purezza del peptide Aβ. La purezza viene determinata integrando ciascun picco individuale dello spettro e calcolando la percentuale dell'area corrispondente al picco del peptide. Tipicamente, una purificazione di >Il 95% deve essere accertato.
- Preparare una soluzione di 1 mg/mL del peptide purificato sciogliendo il peptide nella soluzione tampone per campioni.
Figura 2: Tracce rappresentative di HPLC di Aβ42. (A) C tradizionale4 purificazione con silice, condizioni: Buffer A: H2O con acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1%, tampone B: MeCN (acetonitrile) con TFA allo 0,1%, gradiente: da 20 a 27% di tampone B in 40 min seguito da isocratico al 27% di tampone B; (BPurificazione preparativa utilizzando la colonna 25 x 300 mm2 colonna polimerica, condizioni: Buffer A: H2O con 20 mM NH4OH, buffer B: 80% MeCN / 20% H2O con 20 mM NH4OH, gradiente: dal 20 al 27% di tampone B in 70 min, seguito da isocratico al 27% di tampone B; (CPurificazione preparativa ottimizzata utilizzando la colonna 25 x 300 mm2 colonna polimerica, le condizioni sono descritte nella Tabella 1 riportata nel sottoparagrafo 1.3 del testo descrittivo del protocollo; (D) Cromatografia liquida ad alte prestazioni analitica utilizzando la colonna 4,6 x 250 mm2 colonna polimerica, condizioni: Buffer A: H2O con 20 mM NH4OH, tampone B: 80% MeCN / 20% H2O con 20 mM NH4OH, gradiente dal 5 al 50% di tampone B in 30 min. Nei tracciati A, B e C, il picco corrispondente ad Aβ42 è indicato con un asterisco. La raccolta del picco di Aβ42 marcato nel tracciato C rivela una purezza del >95% come mostrato nella parte D. La spettrometria di massa è stata utilizzata per determinare l'identità del picco di Aβ42. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Risultati
La purificazione del peptide Aβ42 mediante l'uso combinato della fase stazionaria PLRP-S e di una fase mobile ad alto pH determina la formazione di un picco nitido e ben risolto per il peptide Aβ con un tempo di ritenzione compreso tra 72 e 74 minuti (Figura 2C). La conferma dell'identità del picco avviene mediante spettrometria di massa con iniezione diretta dell'eluito raccolto. L'eluito può essere conservato a -20 °C in soluzione per un massimo di 12 h. Periodi di cons...
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Discussione
La purificazione HPLC del peptide Aβ dipende fortemente dalla scelta sia della fase stazionaria impiegata nella purificazione che della fase mobile scelta per eluire il peptide. Il basso punto isoelettrico del peptide e l'elevata propensione all'aggregazione rendono difficili le condizioni cromatografiche tradizionali per la separazione delle proteine idrofobiche (fase stazionaria C4 o C8 accoppiata a un eluente mobile acido), con l'eluizione del peptide Aβ come un picco ampio prolungato e non risolto (Figura 2A<...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Agilent per la loro assistenza tecnica. Kate Markham e Rafael Palomino sono accreditati per il loro aiuto iniziale nella sintesi e purificazione del peptide Aβ e il dottor Hsiau-Wei Lee è ringraziato per il suo aiuto nella preparazione della Figura 1 del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pompa trimestrale Agilent 1260 Infinity II | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Rivelatore a doppia lunghezza d'onda variabile | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Iniettore manuale Agilent 1260 Infinity II dotato di ansa per campioni in acciaio inossidabile da 10 mL | Iniettore manuale Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Iniettore manuale Agilent 1260 Infinity II dotato di 20 µ L anello di campionamento in acciaio inox | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Staffa di montaggio per supporto ad anello | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 Å 5 µ m 4,6 x 250 mm (analitico) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ 42 o Aβ 40 peptide | Sintetizzato internamente utilizzando un sintetizzatore di peptidi automatizzato CEM liberty. | ||
| Idrossido di ammonio (NH4OH, soluzione al 28%) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Acqua di grado HPLC | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 mL provetta da centrifuga conica | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Raccordo Supelco PEEK Giunto monopezzo a serramanico, confezione da 5 cad | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5 siringa sterile cc | Fisher Scientific 1481729 | ||
| ago SS calibro 16 | Rheodyne | 3725-086 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
