Articolo metodologico

Un Tailored HPLC purificazione protocollo che i rendimenti di elevata purezza beta-amiloide 42 e beta amiloide 40 peptidi, in grado di Oligomer Formazione

DOI:

10.3791/55482

⸱

27 marzo 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California, Santa Cruz

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui riportiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura che produce peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza, in grado di formare oligomeri. L'amiloide-beta è un peptide idrofobico altamente incline all'aggregazione implicato nella malattia di Alzheimer. La natura amiloidogenica del peptide rende la sua purificazione una sfida.

Abstract

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I peptidi amiloidogenici come l'amiloide-beta (Aβ) implicata nel morbo di Alzheimer, possono rappresentare una sfida significativa quando si cerca di ottenere materiale di elevata purezza. Qui presentiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura per produrre peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza. Abbiamo scoperto che la combinazione di poli(stirene/divinilbenzene) in fase stazionaria idrofobica disponibile in commercio, polimeri in laboratorio in fase inversa - stirenedivinilbenzene (PLRP-S) in condizioni di pH elevato, consente il raggiungimento di un'elevata purezza (>95%) Aβ42 in un singolo ciclo cromatografico. La purificazione è altamente riproducibile e può essere modificata sia in condizioni semi-preparative che analitiche a seconda della quantità di materiale che si desidera purificare. Il protocollo può essere applicato anche al peptide Aβ40 con identico successo e senza la necessità di modificare il metodo.

Introduzione

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La malattia di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa che colpisce oltre 35 milioni di persone in tutto il mondo. 1 Fortemente implicato nell'insorgenza e nello sviluppo della malattia, è il peptide idrofobico altamente incline all'aggregazione, l'amiloide-beta (Aβ). 2 Aβ varia da 36 a 43 amminoacidi in lunghezza, tuttavia, si pensa che la variante di 42 aminoacidi, l'amiloide-beta 42 (Aβ42), sia la forma più tossica della proteina. 3 Ciò è dovuto in gran parte alla capacità di Aβ42 di formare facilmente specie oligomeriche diffusibili che si ritiene siano entità particolarmente neurotossiche. 4 Per approfondire la nostra comprensione del peptide Aβ, è essenziale ottenere regolarmente materiale ad alta purezza. È stato dimostrato che la presenza di tracce di impurità altera drasticamente le proprietà di propensione all'aggregazione del peptide. 5

Tradizionalmente, la separazione con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) di peptidi idrofobici come l'Aβ è stata effettuata attraverso l'uso di una combinazione di fasi stazionarie a base di silice C4 oC 8 e una fase mobile acida. 6 Tuttavia, tali condizioni possono rappresentare una sfida per la purificazione del peptide. Il basso punto isoelettrico del peptide Aβ (pI circa 5,5)7 significa che in condizioni acide, l'aggregazione peptidica è aumentata e di conseguenza si producono picchi HPLC ampi e non risolti, spesso difficili da isolare (Figura 2A). Inoltre, tali picchi ampi spesso contengono impurità che possono influire sul profilo di aggregazione del peptide e richiedono comunemente cicli successivi di purificazione che possono avere un impatto drammatico sulla quantità di peptide prodotto.

La fase stazionaria di poli(stirene/divinilbenzene), PLRP-S, rappresenta un mezzo alternativo per purificare i peptidi idrofobici. La fase stazionaria è stata impiegata nella purificazione di un certo numero di diverse proteine e acidi ribonucleici messaggeri (mRNA). 8,9 La fase stazionaria PLRP-S non richiede alcun ligando alchilico aggiuntivo per la separazione della fase inversa e, cosa più importante, è chimicamente stabile ad un pH elevato, il che porta alla deaggregazione del peptide. 7 Qui, riportiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura che produce peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza.

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Protocollo

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1. Purificazione HPLC preparativa del peptide Aβ40 o Aβ42

  1. Preparare i seguenti tamponi per la purificazione HPLC.
    1. Preparare il tampone A (20 mM NH4OH) aggiungendo 1,3 mL di NH4OH (soluzione al 28%) a 1.000 mL di acqua ultrapura.
    2. Preparare il tampone B (acetonitrile all'80% con 20 mM di NH4OH) aggiungendo 1,3 mL di NH4OH (soluzione al 28%) a una soluzione di 800 mL di acetonitrile di grado HPLC e 200 mL di acqua ultrapura.
    3. Preparare il tampone di dissoluzione del campione (0,1% NH4OH) aggiungendo 100 μL di NH4OH (soluzione al 28%) a 100 mL di acqua ultrapura.
  2. Configurare lo strumento HPLC come mostrato nella Figura 1.
    1. Montare i flaconi di solvente che contengono il tampone A e il tampone B sugli ingressi della pompa HPLC utilizzando un tubo in polimero. Collegare il tubo in polimero alla pompa HPLC con un raccordo monopezzo. Assicurarsi che il tubo in polimero di ciascun tampone sia montato sulla valvola di ingresso corretta dello strumento. Dotare la pompa HPLC di un degasatore.
    2. Accoppiare la pompa HPLC con l'ingresso della colonna preparativa da 300 Å 8 μm 25 mm х 300 mm (Figura 1B, colonna all'estrema sinistra, vedere l'elenco dei materiali) utilizzando un tubo polimerico.
      1. Fissare il tubo in polimero alla colonna preparativa con un raccordo monopezzo a serrare le dita. Assicurarsi che la colonna in polimero sia orientata nel modo corretto.
        NOTA: La fase stazionaria della colonna preparativa è composta da particelle di poli(stirene-divinilbenzene). Il corretto orientamento della colonna in polimero è contrassegnato sull'involucro esterno con una singola freccia direzionale.
    3. Collegare l'uscita della colonna al rivelatore a doppia lunghezza d'onda utilizzando un tubo polimerico e impostare il rivelatore di lunghezza d'onda su 214 nm e 280 nm.
      1. È possibile modificare la lunghezza d'onda modificando i parametri della lunghezza d'onda di rilevamento nell'opzione di configurazione del metodo dello strumento del software HPLC integrato.
    4. Collegare il tubo in polimero all'ingresso del rilevatore di lunghezza d'onda con un raccordo monopezzo a tenuta di mano. Collegare il tubo polimerico alla valvola di uscita del rilevatore di lunghezza d'onda. Collegare il tubo in polimero alla valvola di uscita del rivelatore HPLC con un raccordo monopezzo a serraggio. Questo sarà il tubo di raccolta del campione.
      NOTA: La mancanza di un cromoforo forte sul peptide Aβ impone che 214 nm venga utilizzato come lunghezza d'onda ultravioletta (UV) primaria per la raccolta dei picchi.

figure-protocol-1
Figura 1: Configurazione sperimentale dello strumento HPLC utilizzato per la purificazione dei peptidi di amiloide-beta. (A) la pompa HPLC quaternaria dotata di degasatore e rivelatore a lunghezza d'onda variabile regolata a 214 nm e 280 nm; (B) colonne HPLC utilizzate per la purificazione dei peptidi di amiloide-beta, da sinistra a destra, 2colonne preparative da 25 x 300 mm, 2 colonne semi-preparative da 7,5 x 300 mm2 e colonne analiticheda 4,6 x 250 mm; (C) iniettore manuale con circuito di iniezione in acciaio inossidabile da 20 μl utilizzato per HPLC analitica; (D) Iniettore manuale con circuito di iniezione in acciaio inossidabile da 10 mL utilizzato per la purificazione preparativa e semipreparativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Programmare il software HPLC per eseguire il metodo di purificazione come mostrato nella Tabella 1. Inserire il metodo di purificazione modificando il parametro del calendario del solvente (nell'opzione di configurazione del metodo dello strumento integrata nel software HPLC). Accendere la pompa HPLC facendo clic sul pulsante "on" sul software HPLC.
    NOTA: La pompa inizierà a fornire il rapporto iniziale del tampone A e del tampone B attraverso la colonna preparativa e lo strumento HPLC.
    1. Lasciare il sistema per 30 minuti per equilibrarsi completamente.
Tempo / min % del buffer aa % del buffer Bb Portatad/mL min-1 0 80 20 6 45 75,5 24,5 6 45.01 80 20 6 52.01 80 20 6 52.02 73 27 6 85 73 27 6 92 5 95c 6

Tabella 1: Calendario per la purificazione dei peptidi Aβ42 e Aβ40 utilizzando la colonna polimerica da 25 × 300 mm. unTampone A - H2O con 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O con 20 mM NH4OH; cHa funzionato per 15 minuti per lavare la colonna prima della successiva iniezione del campione; dPer eseguire una portata di 6 mL/min sulla strumentazione HPLC, il limite di pressione deve essere ridotto a 200 bar.

  1. Purificazione del campione di peptide Aβ
    Nota: Il peptide grezzo è stato ottenuto attraverso la sintesi automatizzata di peptidi in fase solida. 10
    1. Sciogliere 3 mg di peptide Aβ grezzo in 4 mL del tampone di dissoluzione del campione. Sonicare il campione per 30-60 s a temperatura ambiente e a una frequenza di 40 kHz per facilitare la dissoluzione.
    2. Iniettare l'intero campione sulla colonna HPLC utilizzando una siringa di plastica da 5 mL dotata di un ago in acciaio inossidabile calibro 16. Eseguire il metodo di purificazione come descritto nel passaggio secondario 1.3.
      NOTA: Il sistema consente di eseguire l'iniezione del campione attraverso l'uso di un iniettore manuale dotato di un circuito di iniezione in acciaio inossidabile da 10 mL (Figura 1D). Il peptide Aβ desiderato eluirà tra 72 e 74 minuti come un picco risoluto (Figura 2C).
    3. Raccogliere il campione in una provetta da centrifuga conica da 50 mL. Confermare l'identità del picco Aβ attraverso la spettrometria di massa a iniezione diretta dell'eluente raccolto. 11 Conservare l'eluente per un massimo di 12 ore a -20 °C.
      NOTA: Si sconsiglia la conservazione della soluzione per periodi superiori a 12 ore a causa del potenziale di ossidazione del peptide.
    4. Isolare il peptide purificato mediante congelamento rapido dell'aliquota/aliquote raccolte del peptide Aβ in azoto liquido e liofilizzare. Eseguire la liofilizzazione liofilizzando il campione a una temperatura di -60 °C e una pressione di 20 mTorr per un periodo di 24 ore.
    5. Eseguire il protocollo HPLC analitico come descritto di seguito per determinare la purezza del peptide Aβ. Conservare i peptidi nella loro forma liofilizzata a -20 °C per un periodo fino a 6 mesi.

2. Analisi analitica HPLC della proteina Aβ purificata

  1. Preparare i tamponi HPLC come descritto nella sottosezione 1.1 del protocollo di cui sopra.
  2. Configurare l'HPLC analitico come indicato al punto 1.2.1 e come illustrato nella Figura 1 con la colonna analitica da 4,6 × 250 mm (Figura 1B, colonna all'estrema destra) e l'iniettore manuale con circuito di iniezione in acciaio inossidabile da 20 μL (Figura 1C) montato sullo strumento.
  3. Programmare il software HPLC per eseguire il metodo analitico come mostrato nella Tabella 2 seguendo istruzioni simili a quelle del passaggio 1.3.
Tempo / min % del buffer aa % del buffer Bb Portata / mL min-1 0 95 5 1 30 50 50 1

Tabella 2: Calendario per l'analisi della purezza HPLC del peptide Aβ. unTampone A - H2O con 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O con 20 mM NH4OH.

  1. Analisi della purezza del peptide Aβ
    1. Preparare una soluzione da 1 mg/mL del peptide purificato attraverso la dissoluzione del peptide nella soluzione tampone campione.
      NOTA: La ricetta del tampone si trova nella sottosezione 1.1. La concentrazione proteica viene determinata misurando l'assorbimento proteico a 280 nm (A280nm). 12 Il coefficiente di estinzione molare (ε) utilizzato per determinare la concentrazione è ε = 1.490 dm3 mol-1 cm-1. 13
    2. Iniettare 20 μl della soluzione da 1 mg/mL (222 μM) sulla colonna HPLC ed eseguire il metodo analitico impostato al punto 2.3.
      NOTA: La soluzione rimanente non utilizzata per l'analisi può essere congelata in azoto liquido e liofilizzata per recuperare il peptide Aβ. I dettagli sulla liofilizzazione sono riportati nella sottosezione 1.4.4. Il peptide Aβ eluirà dalla colonna analitica tra 16 e 18 minuti (Figura 2D). Utilizzare il software di analisi dell'integrazione integrato che accompagna lo strumento HPLC per determinare la purezza del peptide Aβ. La purezza è determinata integrando ciascuno dei singoli picchi sullo spettro e calcolando l'area percentuale peptide-picco. In genere, dovrebbe essere accertata una purificazione del >95%.

figure-protocol-2
Figura 2: Tracce HPLC rappresentative di Aβ42. (A) Purificazione tradizionale con silice C4, condizioni: Tampone A: H2O con acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1%, tampone B: MeCN (acetonitrile) con TFA allo 0,1%, gradiente: dal 20 al 27% tampone B per 40 minuti seguito da tampone B isocratico al 27%; (B) Purificazione preparativa utilizzando la colonna polimerica2 da 25 x 300 mm, condizioni: Tampone A: H2O con 20 mM NH4OH, tampone B: 80% MeCN / 20% H2O con 20 mM NH4OH, gradiente: dal 20 al 27% tampone B su 70 min seguito da tampone B isocratico al 27%; (C) Purificazione preparativa ottimizzata utilizzando la colonna polimerica di 25 x 300 mm2, le condizioni sono descritte nella Tabella 1 situata nella sottosezione 1.3 del testo di descrizione del protocollo; (D) HPLC analitica utilizzando la colonna polimericada 4,6 x 250 mm 2, condizioni: Tampone A: H2O con 20 mM NH4OH, tampone B: 80% MeCN / 20% H2O con 20 mM NH4OH, gradiente-50% al 50% tampone B oltre 30 min. Per le parti A, B e C il picco corrispondente ad Aβ42 è contrassegnato da un asterisco. La raccolta del picco Aβ42 marcato nella parte C rivela una purezza del >95% come mostrato nella parte D. La spettrometria di massa è stata utilizzata per determinare l'identità del picco Aβ42. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

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La purificazione del peptide Aβ42 utilizzando una combinazione della fase stazionaria PLRP-S e di una fase mobile ad alto pH porta alla formazione di un picco acuto e risolto per il peptide Aβ con un tempo di ritenzione compreso tra 72 e 74 minuti (Figura 2C). La conferma dell'identità del picco viene effettuata attraverso la spettrometria di massa a iniezione diretta dell'eluente raccolto. L'eluente può essere conservato a -20 °C in soluzione per un massimo di 12 ore. Pe...

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Discussione

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La purificazione HPLC del peptide Aβ dipende fortemente dalla scelta sia della fase stazionaria impiegata nella purificazione che della fase mobile scelta per eluire il peptide. Il basso punto isoelettrico del peptide e l'elevata propensione all'aggregazione rendono difficili le condizioni cromatografiche tradizionali per la separazione delle proteine idrofobiche (fase stazionaria C4 o C8 accoppiata a un eluente mobile acido), con l'eluizione del peptide Aβ come un picco ampio prolungato e non risolto (Figura 2A<...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Agilent per la loro assistenza tecnica. Kate Markham e Rafael Palomino sono accreditati per il loro aiuto iniziale nella sintesi e purificazione del peptide Aβ e il dottor Hsiau-Wei Lee è ringraziato per il suo aiuto nella preparazione della Figura 1 del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pompa trimestrale Agilent 1260 Infinity IIAgilentG7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Rivelatore a doppia lunghezza d'onda variabileAgilentG7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Iniettore manuale Agilent 1260 Infinity II dotato di ansa per campioni in acciaio inossidabile da 10 mLIniettore manuale Agilent0101-1232http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Iniettore manuale Agilent 1260 Infinity II dotato di 20 µ L anello di campionamento in acciaio inoxAgilentG1328Chttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Staffa di montaggio per supporto ad anelloAgilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5  µ m 4,6 x 250 mm (analitico)AgilentPL1512-5501http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ 42 o Aβ 40 peptideSintetizzato internamente utilizzando un sintetizzatore di peptidi automatizzato CEM liberty.
Idrossido di ammonio (NH4OH, soluzione al 28%)Fisher ScientificA669-500
AcetonitrileFisher ScientificA998-4
Acqua di grado HPLCFisher ScientificW5-4
Falcon 50 mL provetta da centrifuga conicaFisher Scientific14-954-49A
Raccordo Supelco PEEK Giunto monopezzo a serramanico, confezione da 5 cadSigma-AldrichZ227250
Normject 5  siringa sterile ccFisher Scientific 1481729
ago SS calibro 16Rheodyne3725-086
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Riferimenti

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  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).

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