Registrazione di EEG nei ratti neonatali liberamente in movimento utilizzando un metodo novello

È ben accertato che la comunicazione continua tra i neuroni sia necessaria per ottenere una normale funzione cerebrale. La comunicazione interneuronale avviene principalmente in sinapsi, dove le informazioni da un neurone vengono trasmesse ad un secondo neurone. Questa trasmissione sinaptica è mediata da due tipi di strutture strutturali dedicate: sinapsi elettrici o chimici ¹ . L'elettrofisiologia è il campo che cattura il potenziale elettrico prodotto durante la comunicazione interneuronale che controlla le funzioni e il comportamento del corpo complessivo ² . EEG è il metodo più comunemente usato tra molte tecniche elettrofisiologiche.

EEG è una tecnica utilizzata per rilevare i cambiamenti nei segnali elettrici prodotti da stimoli interni o esterni. Inoltre, è un test essenziale per la diagnosi clinica e la predizione dei risultati di varie condizioni neurologiche come l'epilessia, il morbo di Parkinson e AlzheimerE, nonché gli effetti degli agenti farmacologici e tossicologici ³ . In generale, un paziente epilettico mostra iperexcitabilità e compromettere la connettività funzionale all'interno del cervello; Questi sono riassunti come scariche epilettiche interattive (IEDs) e possono essere registrate da EEG in forma di picchi affilati e transienti; Onde acute; Complessi ad onda a picco; O polyspikes ⁴ . La caratteristica principale del cervello epilettico è la comparsa spontanea di crisi epilettiche, che possono essere registrate sia dal cuoio capelluto o dal cervello parenchima per individuare l'area cerebrale responsabile delle crisi epilettiche ⁵ . Inoltre, l'EEG ha anche importanti implicazioni nei disturbi neurodegenerativi come la malattia di Alzheimer (AD). La ricerca suggerisce che le alterate registrazioni EEG e le reti oscillatorie compromesse nei pazienti AD sono comuni. Tuttavia, le nostre conoscenze sulla fisiopatologia delle oscillazioni di rete nelle malattie neurodegenerative iÈ sorprendentemente incompleto e deve essere ulteriormente esplorato ⁶ .

In questo protocollo abbiamo progettato un semplice elettrodo con cui si può registrare EEG per comprendere la comunicazione elettrica sia nel cervello normale che nel cervello patologico. L'impianto chirurgico in questo metodo è più economico di altre procedure disponibili ⁷ . Inoltre, questo metodo può essere usato per registrare segnali EEG di alta qualità e stabili per tempi più lunghi ( cioè 2-4 ore ogni giorno per 1 settimana). Inoltre, abbiamo utilizzato elettrodi più leggeri (pesa circa 26 mg) che permettono agli animali di comportarsi più naturalmente ⁸ . Questo metodo è ampiamente applicabile allo studio di EEG nei cuccioli di ratto neonatale che richiede l'amplificatore e il digitalizzatore, comunemente usato nel laboratorio di elettrofisiologia e non richiede alcun dispositivo aggiuntivo.

La cura degli animali, la procedura chirurgica e le procedure di registrazione sono state conformi alle linee guida del comitato per la cura e l'uso degli animali normali dell'Università del Sud della Cina.

1. Preparazione elettrodi (Figura 1A-C)

NOTA: Il pin loci del computer è semplicemente un contatto a contatto come parte dell'interfaccia di segnale nei dispositivi di comunicazione. È costituito da un connettore maschio che si collega al connettore femmina.

1. Separare con cautela i perni maschi e femmine dal perno del computer ( Figura 1A ) con l'aiuto di un pincer. Collegare i perni maschi e femmine per formare un elettrodo e applicare cianoacrilato per creare un forte legame adesivo ( figura 1C ).
2. Mettere gli elettrodi in un bicchiere pieno di acqua distillata per e metterlo in un detergente ultrasonico per 10 min. Spostarli in un forno a secco a 45 ° C per 30 minuti. Sterilizzare gli elettrodi con luce UV per 30 min.

2. Procedura chirurgica (Figura 1D-F)

1. Preparare gli strumenti chirurgici sterilizzati e gli apparecchi stereotossici. Anestetizzare il cucciolo al neonato con anestesia isoflurana (2,5%) con aria. Quando il cucciolo è profondamente anestetizzato, regolare la dose di isoflurano all'1, 0%. Eseguire un pizzico di coda o punta prima della chirurgia per assicurare la giusta profondità dell'anestesia.
2. Fissare la testa del cucciolo nell'apparato stereotossico posando le barre degli orecchi nei canali dell'orecchio e leggermente stringendoli.
   NOTA: Non stringere eccessivamente le barre d'orecchio, poiché il cranio neonatale è molto morbido.
3. Mantenere il campo chirurgico sterile spruzzando tutte le apparecchiature con il 70% di etanolo. Effettuare un'incisione di 15 mm sulla testa usando un bisturi. Usando le pinze, tirare delicatamente il cuoio capelluto dalla linea mediana ai quattro angoli. Mettere un po 'di cotone imbevuto di soluzione salina sotto la pelle per mantenere l'incisione aperta ( Figura 1D ).
4. Trova i punti bregma e lambda sul cranioE contrassegnarli con una matita. Utilizzare un ago a siringa (26 G) per realizzare due fori della burrata nella corteccia prefrontale (PFC) e nell'ippocampo.
   NOTA: Il PFC si trova a +1,8 mm posteriormente al bregma e -0,5 mm lateralmente alla linea mediana, mentre l'ippocampo è posizionato a -2,0 mm anteriori a bregma e ± 0,5 mm laterali alla linea mediana ( Figura 1D e E ). La profondità dell'elettrodo non deve superare i 2 mm sotto la superficie corticale per ridurre al minimo i danni cerebrali.
5. Utilizzare pinze per tenere gli elettrodi e inserire rispettivamente gli elettrodi di riferimento e di registrazione nel PFC e nell'ippocampo. Applicare unguento eritromicina intorno all'elettrodo per evitare eventuali infezioni. Fissare l'elettrodo usando cianoacrilato.
6. Preparare il cemento acrilico dentale in modo che abbia una consistenza leggiadrabile e viscosa. Applicare il cemento dentale per coprire gli elettrodi e il resto del cranio.
   NOTA: Asciugare bene il cranio prima di applicare il cemento dentale. Applicare 5% di acido picrico sugli elettrodi per proteggerli.
   NOTA: L'intera procedura deve essere eseguita in un cappuccio di biosicurezza per mantenere le condizioni sterili.
7. Rimuovere l'animale dalla struttura stereotaxicica e iniettare 300 μL di glucosio al 10% sottocutaneo. Metterlo su una coperta riscaldata per il recupero. Assicurarsi che l'animale sia caldo (37 ° C) e ambulatorio ( cioè completamente recuperato). Somministrare buprenorfina intraperitonealmente (0,05 mg / kg) per il dolore post-chirurgico.
   NOTA: Non lasciare un animale incustodito finché non ha ripreso sufficiente coscienza (comportamento e movimento normali).
8. Ritorna il cucciolo alla sua gabbia di casa con la loro diga dopo che ristabilisce la coscienza. Attendere due giorni fino a che l'animale non sia completamente recuperato.

3. Registrazione EEG

1. Dopo il ripristino completo, collegare gli elettrodi implantati sul cranio del cucciolo all'amplificatore nella propria gabbia. Collegare l'amplificatore ad un cavo analogico-digitaleOnverter e collegare il convertitore ad un computer; Le linee di collegamento devono essere trattate attentamente in modo che non si aggrappano.
2. Selezionare almeno 10.000 Hz di frequenza di campionamento sull'unità di acquisizione dati per la registrazione (la larghezza di banda del trasmettitore è 1-100 Hz). Assicurarsi che i dati siano campionati correttamente.
3. Dopo avere ottenuto la registrazione baseline, iniettare il cucciolo intraperitonealmente con acido kainico (KA) (2 mg / kg) per indurre crisi epilettiche. 15 minuti dopo l'iniezione di KA osservare e registrare gli scarichi epilettici. I sequestri prodotti attraverso KA sono solitamente fisici.
   NOTA: La durata ictal-tonic è di circa 15,2 ± 0,9 s, la durata della sequenza è di circa 62 ± 5 s. È possibile prevenire sequestri nel ratto neonatale dando l'iniezione IP di cloridrato (400 mg / kg).
4. Salvare i dati digitalizzati e analizzarli utilizzando pacchetti software di elaborazione del segnale, ad esempio spike2. Rivelare il livello di potenza dei diversi componenti di frequenza nel segnale EEG neonatale da perfL'analisi di spettro di potenza. Calcola la potenza in un tempo di 1 min, trovando l'ampiezza radice-media quadrata da 1 a 100 Hz (banda EEG) ⁹ .

Se le suddette procedure chirurgiche sono condotte correttamente, sarà eseguita con successo una registrazione del neonato pupino di ratto del canale EEG. 10 minuti dopo l'iniezione KA, un regolare schema di segni comportamentali è emerso sotto forma di movimenti irregolari e graffi, tremori e perdita di equilibrio. La Figura 2 mostra le tracce EEG esplosive rappresentative e le tracce espanse interattive, ictal-tonic e ictal-clonic. Gli schemi di scarico ETS intermittenti e ictali ricorrenti hanno iniziato 15-60 min (30 ± 5,2 min; media ± SEM) dopo l'iniezione KA ( Figura 2A e 2B ). La figura 2D e 2E rappresentano le crisi tonico-cloniche che sono il tipo più comune. La durata ictal-tonic durò 15,2 ± 0,9 s ( figura 2D ). I risultati rappresentativi hanno mostrato che gli scarichi tonici sono stati seguiti da burst cloni ( Figura 2B, 2D e 2 E ).

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Figura 2: sequestro neonatale indotto da KA. ( A ) Una traccia EEG rappresentata da un topo P10 che è stato iniettato con KA (2 mg / kg, ip) ha mostrato scariche ricorrenti di scoppio epilettico. ( B ) Visualizzazione estesa di scariche epilettiche simili a cluster a partire dalla scatola in A. ( C , D e E ) Le tracce tipiche interictali, ictal-tonic e ictal-clonic espanse dalla casella in B. ( F ) Dati summenzionati La potenza media EEG (1 min di tempo) prima e dopo l'iniezione KA (media ± SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Impostazione della registrazione EEG. La registrazione di traccia rappresentativa è shoWn nel cucciolo di topo neonatale liberamente mobile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.