Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

Stefanie Dudczig; Peter D. Currie; Lucia Poggi; Patricia R. Jusuf

doi:10.3791/55490

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Articolo metodologico

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

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DOI:

10.3791/55490

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22 marzo 2017

Stefanie Dudczig¹^,² , Peter D. Currie² , Lucia Poggi³ , Patricia R. Jusuf¹^,²

¹School of Biosciences, The University of Melbourne, ²Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, ³The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

In questo articolo

Sommario

Live tracking dei singoli progenitori retinici WT in background genetici distinti consente la valutazione del contributo delle cellule di segnalazione non autonomo durante la neurogenesi. Qui, una combinazione di knockdown gene, generazione chimera tramite trasferimento di embrioni in time-lapse imaging confocale vivo è stata utilizzata per questo scopo.

Abstract

I punti di forza genetici e tecnici hanno fatto la vertebrati zebrafish organismo modello chiave in cui le conseguenze di manipolazioni genetiche possono essere rintracciate in vivo per tutto il periodo di sviluppo rapido. Più processi possono essere studiati tra cui la proliferazione cellulare, l'espressione genica, la migrazione delle cellule e la morfogenesi. È importante sottolineare che la generazione di chimere attraverso trapianti possa essere effettuata facilmente, permettendo etichettatura mosaico e monitoraggio delle singole celle sotto l'influenza dell'ambiente host. Ad esempio, mediante la combinazione di manipolazioni funzionali di geni dell'embrione host (ad esempio, attraverso morfolino microiniezione) e l'imaging dal vivo, gli effetti di estrinseco, segnali non autonomi cellulari (forniti dall'ambiente geneticamente modificati) su singole cellule del donatore trapiantate possono essere valutate. Qui mostriamo come questo approccio viene utilizzato per confrontare l'insorgenza di espressione del transgene fluorescente come proxy per i tempi del destino delle cellule determinzione in diversi ambienti host genetica.

In questo articolo, forniamo il protocollo per microinjecting embrioni di zebrafish per marcare cellule del donatore e di causare silenziamento genico in embrioni di accoglienza, una descrizione della tecnica di trapianto usato per generare embrioni chimerici, e il protocollo per la preparazione e l'esecuzione in vivo confocale time-lapse imaging più embrioni. In particolare, l'esecuzione di imaging multiposizione è cruciale quando si confrontano tempistica di eventi come l'insorgenza di espressione genica. Ciò richiede la raccolta di dati dal controllo multiplo e embrioni sperimentali elaborati contemporaneamente. Tale approccio può essere facilmente esteso per gli studi di influenze estrinseche in qualsiasi organo o tessuto di scelta accessibili a vivere l'imaging, a condizione che i trapianti possono essere mirati facilmente in base alle mappe destino embrionali stabiliti.

Introduzione

La possibilità di visualizzare importanti processi di sviluppo in un vertebrato in vivo ha contribuito a rendere il pesce zebra un modello chiave per lo studio condizioni normali e di malattia (recensione in ^{^1,} ^2). In particolare, la retina neurale è una parte accessibile del sistema nervoso centrale. La retina si presta per effettuare facilmente studi di neurogenesi per la sua altamente organizzata, ma struttura relativamente semplice, ed i suoi tipi di neuroni altamente conservati tra le specie di vertebrati ^3. Dinamica dei comportamenti cellulari come la proliferazion....