Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

Christiane Grimm; Johannes Vierock; Peter Hegemann; Jonas Wietek

doi:10.3791/55497

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Articolo metodologico

Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

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DOI:

10.3791/55497

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22 maggio 2017

Christiane Grimm^*¹ , Johannes Vierock^*¹ , Peter Hegemann¹ , Jonas Wietek¹

¹Experimental Biophysics, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive come la selettività ionica della canalrodopsina viene determinata con registrazioni elettrofisiologiche di patch-clamp su cellule intere utilizzando cellule HEK293. Qui, viene dimostrata la procedura sperimentale per studiare la selettività del cloruro di una canalrodopsina anionico-selettiva. Tuttavia, la procedura è trasferibile ad altre canalrodopsine di selettività distinta.

Abstract

Negli ultimi dieci anni, i channelrhodopsins sono diventati indispensabili nella ricerca neuroscientificale, dove vengono utilizzati come strumenti per manipolare in modo non invasivo i processi elettrici nelle cellule bersaglio. In questo contesto, la selettività ionica di un channelrhodopsin è di particolare importanza. In questo articolo si descrive l'analisi della selettività di cloruro per una scanografia di Proteomonas sulcata recentemente identificata da anion-conducting channel mediante protezioni elettrofisiologiche di patch-clamp sulle cellule HEK293. La procedura sperimentale per misurare le fotocorri luminose richiede una sorgente luminosa rapida - idealmente monocromatica - accoppiata nel microscopio di una configurazione di patch-clamps altrimenti convenzionale. Sono state descritte procedure preparative prima dell'esperimento che prevedono la preparazione di soluzioni tamponate, considerazioni sui potenziali di giunzione liquidi, la semina e la trasfezione delle cellule e la trazione delle pipette patch. La registrazione effettiva della relazione di tensione-correnteS per determinare le potenzialità di inversione per diverse concentrazioni di cloruro si svolge 24 h a 48 h dopo la trasfezione. Infine, i dati elettrofisiologici vengono analizzati rispetto alle considerazioni teoriche della conduzione di cloruro.

Introduzione

Channelrhodopsins (ChR) sono canali ionici leggeri che si verificano nel punto di occhio delle alghe verdi motile e servono come fotosensori primari per fototassi e risposte fobiche ¹ . Dalla loro prima descrizione nel 2002 ² , i ChRs hanno aperto la strada per il campo emergente dell'ottogenetica e possono essere applicati in una varietà di cellule eccitabili, ad es. Nei muscoli scheletrici, nel cuore o nel cervello ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . L'espressione di ChRs nelle cellule bersaglio produce una permeabilità ionica contr....