Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

Sommario

Questo articolo descrive come la selettività ionica della canalrodopsina viene determinata con registrazioni elettrofisiologiche di patch-clamp su cellule intere utilizzando cellule HEK293. Qui, viene dimostrata la procedura sperimentale per studiare la selettività del cloruro di una canalrodopsina anionico-selettiva. Tuttavia, la procedura è trasferibile ad altre canalrodopsine di selettività distinta.

Abstract

Negli ultimi dieci anni, i channelrhodopsins sono diventati indispensabili nella ricerca neuroscientificale, dove vengono utilizzati come strumenti per manipolare in modo non invasivo i processi elettrici nelle cellule bersaglio. In questo contesto, la selettività ionica di un channelrhodopsin è di particolare importanza. In questo articolo si descrive l'analisi della selettività di cloruro per una scanografia di Proteomonas sulcata recentemente identificata da anion-conducting channel mediante protezioni elettrofisiologiche di patch-clamp sulle cellule HEK293. La procedura sperimentale per misurare le fotocorri luminose richiede una sorgente luminosa rapida - idealmente monocromatica - accoppiata nel microscopio di una configurazione di patch-clamps altrimenti convenzionale. Sono state descritte procedure preparative prima dell'esperimento che prevedono la preparazione di soluzioni tamponate, considerazioni sui potenziali di giunzione liquidi, la semina e la trasfezione delle cellule e la trazione delle pipette patch. La registrazione effettiva della relazione di tensione-correnteS per determinare le potenzialità di inversione per diverse concentrazioni di cloruro si svolge 24 h a 48 h dopo la trasfezione. Infine, i dati elettrofisiologici vengono analizzati rispetto alle considerazioni teoriche della conduzione di cloruro.

Introduzione

Channelrhodopsins (ChR) sono canali ionici leggeri che si verificano nel punto di occhio delle alghe verdi motile e servono come fotosensori primari per fototassi e risposte fobiche ¹ . Dalla loro prima descrizione nel 2002 ² , i ChRs hanno aperto la strada per il campo emergente dell'ottogenetica e possono essere applicati in una varietà di cellule eccitabili, ad es. Nei muscoli scheletrici, nel cuore o nel cervello ^{3 , 4 , 5} . L'espressione di ChRs nelle cellule bersaglio produce una permeabilità ionica controllabile dalla luce della rispettiva cellula. In un contesto neuronale, questo consente l'attivazione ^{6 , 7 , 8} o inibizione ^{9 , 10} di cottura del potenziale d'azione (AP) - a seconda dello ione condotto - con lo spazio e temporaliPrecisione della luce sottolineando come la selettività ionica di una variante ChR determina l'applicazione ottogenetica.

I primi ChRs scoperti da Chlamydomonas reinhardtii e Volvox carteri sono permeabili a protoni, ma anche a cationi monovalenti come il sodio, il potassio e, in misura minore, a cationi bivalenti come il calcio e il magnesio ^{11 , 12 , 13} . Oggi, più di 70 cantipolisini naturali (CCR) ^{14 , 15 , 16 , 17} e varie varianti progettate ^{18 , 19 , 20} con proprietà diverse come La dimensione fotocirrente, la sensibilità spettrale, la cinetica e la selettività del cation sono disponibili. Mentre nella neuroscienza, CCRs aUtilizzati per attivare le cellule e attivare AP, le pompe microbiche a luce guidata sono stati gli unici antagonisti disponibili per annientare i neuroni. Nel 2014, due gruppi hanno dimostrato simultaneamente che i CCRs possono essere convertiti in channelrhodopsins (ACR) di anion-conducting mediante alterazione della polarità lungo il poro conducente ionico attraverso l'engineering molecolare ^{9 , 21} . Successivamente, ACR naturali sono stati identificati in diverse alghe di crittophyte ^{22 , 23 , 24} . Più importante, l'attivazione leggera di ACR mediata dalle correnti di cloruro nei neuroni adulti permette di inibire l'attività neuronale a intensità luminosa molto minori rispetto alle pompe microbiche che trasportano solo singole cariche per fotone assorbito.

L'attività di ChR può essere direttamente affrontata mediante registrazioni elettrofisiologiche di patch-clamp di correnti indotte da luce nelle cellule HEK293. La pinzettaLa tecnica è stata originariamente sviluppata alla fine degli anni '70 ²⁵ e ulteriormente migliorata da Hamill et al. , Consentendo la registrazione dell'entità delle correnti da una piccola cella (modalità di intera cellula) con alta risoluzione di corrente e controllo diretto della tensione della membrana ²⁶ . Applicata nella coltura cellulare, questa tecnica fornisce un preciso controllo delle condizioni di registrazione ioniche e elettriche e consente di studiare la selettività degli ioni insieme al relativo contributo degli ioni alla corrente totale. Qui esemplifica l'esame della selettività ionica per il channelrhodopsin di Anion -conducting di Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) ^{22 , 23} attraverso la registrazione di relazioni di tensione-corrente in varie concentrazioni di cloruro extracellulare per dimostrare un'elevata conduttanza di cloruro.

Protocollo

Figura 1: Configurazione Patch-clamp. (8) personal computer, (9) monitor (9) monitoraggio (1) sorgente luminosa, (2) fibra ottica, (3) otturatore programmabile, , (16) elettrodo del bagno con il ponte agar (17), (16) elettrodo del bagno con il ponte agarico, (17) (22) lampada a microscopio, (23) tubo a U con acqua, (24) a tre vie Valvola, (25) tabella antivibrazioni, (26) telecamera CCD. ( A ) Fotografie e ( B ) rappresentazione schematica del setup. Clicca qui per vedere una versione più grande di tLa sua figura.

1. Impostazione prima delle registrazioni

	intra.	extra.1	extra.2
	Alto cloruro	Alto cloruro	Basso cloruro
	C [mM]	C [mM]	C [mM]
Na-ASP	0	0	140
NaCl	110	140	0
KCl	1	1	1
CsCl	1	1	1
CaCl2	2	2	2
MgCl2	2	2	2
HEPES	10	10	10
EGTA	10	0	0
pH	7.2	7.2	7.2
osmolarità	290 mOsm	320 mOsm	320 mOsm

Tabella 1: Composizione ionica delle soluzioni tamponate. Composizione di tamponi intracellulari (intra) e extracellulari (extra) per esperimenti di selettività di cloruri nelle cellule HEK. Abbreviazioni utilizzate: acido tetraacetico etilenico glicole (EGTA), acido 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico (HEPES) e aspartato (ASP). Tutte le concentrazioni sono in mM.

1. Preparare le soluzioni di registrazione con concentrazioni di ioni come indicato nella Tabella 1.
   1. Preparare 15 ml di 2 M stock solutions in acqua ultrapure per MgCl2, CaCl2, KCl e CsCl.
   2. Pesare i componenti solidi per 100 ml di intracellulari e500 ml delle soluzioni tamponate extracellulari secondo la tabella 1 in bicchieri separati e aggiungere successivamente la rispettiva quantità delle soluzioni preparate. Ad esempio, per il tampone intracellulare, utilizzare 0,3803 g (10 mM) EGTA, 0,2383 g (10 mM) HEPES e 0,6428 g (110 mM) NaCl e aggiungere 100 μL di 2 M MgCl ₂ e CaCl ₂ e 50 μL di 2 M soluzioni KCl e CsCl.
   3. Aggiungere acqua ultrapure e regolare con precisione il pH utilizzando acidi e basi, che non interferiscono con la misura, cioè non sono condotti dal ChR, come acido citrico e N-metil-D-glucamina (NMG ⁺ ).
   4. Regolare l'osmolarità a 290 mOsm per l'intracellulare e fino a 320 mOsm per le soluzioni extracellulari con glucosio.
      Nota: Le soluzioni intracellulari leggermente ipoosmotiche aumentano il tasso di successo delle patch ²⁶ .
   5. Sterile filtra tutte le soluzioni attraverso filtri da 0,22 μm. Conservare le soluzioni a 4 ° C per due settimaneS o congelare a -20 ° C per l'immagazzinamento a lungo termine.
2. Calcolare potenziali di giunzione liquidi e preparare protocolli di registrazione.
   NOTA: La variazione della concentrazione di cloruro extracellulare dopo la configurazione di una cellula intera provoca un significativo potenziale di giunzione liquido (LJP) che deve essere corretto ^{27 , 28} . LJPs possono essere direttamente misurati o calcolati, qui viene utilizzata l'ultima opzione. In questo protocollo verrà utilizzata una correzione on-line che richiede un protocollo di registrazione per ogni buffer esterno. Tuttavia, per una serie più grande di soluzioni esterne è consigliabile una correzione post di LJP per evitare la falsa correzione.
   1. Aprire la calcolatrice di potenziale di giunzione (JPC) ²⁷ e aprire il dialogo "Nuovo esperimento". Quindi, selezionare "Misura delle pinze". Selezionare "misurazioni a cellule intere", "Elettrodo di soluzione salina standard" e inserire una temperatura di25 ° C. Tra ogni passaggio, andare avanti accettando la selezione premendo il pulsante "successivo".
      NOTA: Gli esperimenti vengono eseguiti ad una temperatura ambiente di 25 ° C in un laboratorio climatizzato. Assicurarsi che le soluzioni tampone abbiano temperatura ambiente prima di iniziare esperimenti. Per variare la temperatura del campione è possibile utilizzare uno stadio o una camera di incubazione. La temperatura del bagno può essere spesso misurata con un termometro.
   2. Aggiungere tutte le concentrazioni individuali di anione e catione della soluzione pipettata e dell'alta tampone cloruro in base alle concentrazioni elencate nella tabella 1 .
      NOTA: il JPC calcola un LJP di -0,5 mV per le condizioni di partenza.
   3. Fare clic su "New Bath Solution" per entrare nella composizione anionica e cationica del buffer di cloruro basso.
      NOTA: il JPC calcola un nuovo LJP di +12,6 mV in base alla soluzione di registrazione extracellulare modificata.
   4. Preparare due protocolli corretti da LJP per ilDue condizioni di misurazione sottraendo il LJP calcolato dal potenziale di tenuta applicato; -0,5 mV per l'alto e +12,6 mV per le basse soluzioni esterne di cloruro. Così i protocolli iniziano con -79,5 mV (alto cloruro) e -92,6 mV (basso cloruro), rispettivamente per ottenere un potenziale di avviamento corretto da LJP -80 mV in entrambi i casi.
      NOTA: Le seguenti fasi si applicano al software di acquisizione dati elencato nell'elenco dei materiali.
   5. Aprire l'editor di protocollo nel software di acquisizione. Passare al menu "Modalità" selezionare "Stimolazione episodica" e includere 7 spazzamenti.
   6. Passare al menu "Forma d'onda" dell'editor e includere un periodo di 200 ms con potenziale di mantenimento 0 mV seguito da un periodo di 2 secondi con un potenziale di tenuta variabile a partire da -79,5 mV per l'alto cloruro. Includere un "livello delta" di 20 mV per il secondo periodo per aumentare il potenziale di tenuta di 20 mV in ogni sweep.
   7. All'interno delle fasi di tensione della forma d'onda edApplicare un periodo di illuminazione di 500 ms con luce di 540 nm (3,10 mW / mm²). A tal fine, cambiare il "bit bit digitale" dell'otturatore collegato che controlla la sorgente luminosa per essere attiva 500 ms dopo il secondo periodo descritto in precedenza (vedere 1.2.6).
      NOTA: L'intensità della luce può influenzare le proprietà biofisiche delle correnti di canale come l'ampiezza o l'inattivazione. Pertanto, la densità di potenza luminosa deve sempre essere segnalata. Per misurare la potenza luminosa dopo aver superato tutte le ottiche e la copertura, utilizzare un ottometro calibrato. Per calcolare la densità di potenza, determinare il campo illuminato dell'oggetto da un micrometro di oggetti e dividere la potenza luminosa misurata dal campo luminoso determinato.
   8. Salvare il protocollo per la soluzione extracellulare ad alto contenuto di cloruro. Modificare il protocollo e sostituire il primo livello di potenziale di mantenimento di -92,6 mV (basso cloruro esterno). Salva questo secondo protocollo per misurare la bassa condizione extracellulare del cloruro.
3. Il rivestimento di lisina della copertura in vetro si scivola secondo il protocollo adattato ²⁹ .
   1. Posizionare più 100 coperchi di copertura in un piatto di vetro di Petri e aggiungere 250 mL di HCl (1 N).
   2. Posizionare il piatto di Petri con i coperchi della copertura su un agitatore lineare e scuotere a 120 giri / min per 72 h per pulire le coperture del coperchio e poi risciacquare con acqua ultrapure per neutralizzare il pH.
   3. Immergetela in un piccolo volume di etanolo al 95% per una ulteriore pulizia.
      NOTA: Le pasticche pulite possono essere conservate in etanolo al 70% prima di procedere. Lavori sotto cappuccio flusso laminare per le seguenti fasi.
   4. Utilizzando un bruciatore e pinzette Bunsen, fiamma ogni coperchio scivolare e trasferirlo in un nuovo piatto di Petri.
   5. Incubare le coperture di vetro con una soluzione sterile di poli-D-lisina da 50 μg / mL per almeno 1 h (o durante la notte) a temperatura ambiente agitando con un agitatore lineare a 150 giri / min.
   6. Lavare le coperture del coperchio con acqua ultrapure per rimuovere l'eccesso di poli-D-lisina.
   7. Spalmare i coperchi della copertura su carta sterile per asciugare per 10 minuti e esporli alla luce UV per la sterilizzazione (almeno 20 minuti).
   8. Raccogliere le coperture in un piatto di Petri sterile rivestito in foglio di alluminio fino all'uso.
4. Preparare il DNA del gene Ps ACR1 fuso a mCherry usando tecniche standard di biologia molecolare.
   1. Clonare la sequenza genica ottimizzata dal codone umano che codifica Ps ACR1 in un plasmide peGFP-C1 (promotore CMV, resistenza kanamycina) in fotogramma con il fluoroforo mCherry utilizzando enzimi di restrizione o altri metodi di clonazione stabiliti.
      Nota: Possono essere utilizzati anche altri fluorofori, ma assicurarsi di avere i corrispondenti filtri disponibili per osservare la loro fluorescenza sotto il microscopio nell'installazione.
   2. Trasformare il DNA plasmidico in cellule E. coli XL1Blue chemocompetenti mediante scoppio di calore secondo protocollo standard e piatturarle su piastre agar (30 μg / mL kanamicina) ³⁰
   3. Il giorno successivo, inoculare 4 mL di media di brodo di lisossine integrato con 30 μg / mL di kanamicina con le cellule di singole colonie e incubarle di notte a 37 ° C e 180 rpm in un incubatore.
   4. Dopo incubazione durante la notte, purificare il DNA plasmidico dalle colture usando un kit disponibile in commercio (vedere tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore.
5. Seme le cellule
   NOTA: eseguire i passaggi sotto una cappa a flusso laminare.
   1. Posizionare fino a tre coperture in vetro liscio rivestite in fianco a fianco in un piatto di Petri da 35 mm.
      NOTA: Premete delicatamente contro il fondo del piatto per evitare che si scivolino l'uno sull'altro.
   2. Seme 1,5 x 10 ⁵ cellule HEK in 2 ml di standard Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) completato con 10% di siero fetale fetale (FBS) in ogni piatto.
   3. Supplemento di tutti i retinici aUna concentrazione finale di 1 μM. Crescere le cellule per almeno un giorno prima di procedere con il passo 1.6.
6. Trasfezionare transitoriamente le cellule tramite la lipofezione ³¹ .
   1. Per ogni piatto di cellule, preparare una soluzione di 2 μg di DNA plasmidico (come preparato al punto 1.4) in 250 μl di DMEM senza FBS e 6 μl di reagente di transfection (vedi tabella dei materiali ).
   2. Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungete delicatamente (a goccia) la soluzione alle cellule.
7. Preparare ponti agar
   1. Aggiungere 0,75 g di agarosio a 50 ml di soluzione di cloruro di sodio sterile (140 mM) e sciogliere con il riscaldamento in un forno a microonde.
      NOTA: 2 - 3 M KCl per la preparazione del ponte agar ulteriormente riduce LJP a causa della concentrazione più elevata ( ad es. Diffusione costante dal ponte) e pari mobilità di K ⁺ e Cl ^- ioni, ma è stata evitata per ridurre al minimo le perdite ioniche (particolarmente Cl) In t Ha la soluzione di bagno ³² .
   2. Riempire 10 μL di pipetta (o un tubo di piccolo diametro) con la soluzione di agarosio liquido usando una siringa.
      NOTA: evitare le bolle d'aria nel ponte.
   3. Dopo che i ponti agarici sono stati raffreddati e solidificati, conservarli in soluzione sterile 140 mM di cloruro di sodio.
8. Preparare elettrodi di registrazione e bagno.
   1. Rimuovere i fili d'argento del bagno e l'elettrodo di registrazione della messa a punto del patch-clamp.
   2. Peli i fili con carta vetrata per rimuovere il cloruro d'argento da esperimenti precedenti. Immergere il filo d'argento pulito in 3 M KCl e collegarlo al polo positivo di una batteria da 1,5 V per rivestimento elettrolitico con cloruro d'argento.
      NOTA: è possibile utilizzare un alimentatore per laboratorio anziché una batteria.
9. Tirare pipette a bassa resistenza (1,5-3,0 MΩ) dai capillari di vetro con un estrattore di micropipette e lucidarli come descritto da Brown et alLass = "xref"> 33. Conservare le pipette senza polvere per il giorno della misurazione.
10. Accendere tutti i componenti di setup per riscaldare fino alla temperatura di lavoro 30 minuti prima delle registrazioni. Assicurarsi che i buffer siano a temperatura ambiente.

2. Misura di selettività

1. Avviare le registrazioni 24 a 48 h dopo la transizione transitoria delle cellule descritte in 1.6.
2. Posizionare uno scivolo di copertura nella camera di misura e sigillarlo con silicio per evitare perdite del buffer esterno. Conservare il piatto di Petri con l'altra copertura in un incubatore per il prossimo set di esperimenti.
3. Riempire con cura la camera con tampone extracellulare (alto [Cl ^- ]) per impedire la stacco delle cellule, quindi collocarlo sotto il microscopio e utilizzare l'obiettivo 40X per la visualizzazione delle celle.
4. Mettere un ponte agar sull'elettrodo per vasca e posizionarlo nella camera insieme al sensore del livello del fluido e all'uscita di perfusione del gestore del bagno.
5. Scambia l'exSoluzione tracellulare due volte con 1 ml di soluzione esterna fresca (alta [Cl ^- ]) per rimuovere il mezzo di coltura residuo e le cellule staccate.
6. Portare le cellule in messa a fuoco e cercare una cella transfettata (fluorescente), che deve essere isolata da altre cellule. Utilizzare un set di filtri tripla banda e una luce arancione (590 nm, larghezza di banda 15 nm, intensità del 100%) per eccitare e visualizzare la mCherry.
   NOTA: le celle HEK possono essere accoppiate elettricamente ai loro vicini mediante giunzioni di giunzione ^{34 con} conseguente bassa resistenza alla membrana nella configurazione a cellule intere.
7. Riempire una delle pipette tirate con soluzione intracellulare e rimuovere le bolle d'aria spostando la pipetta più volte.
8. Montare la pipetta sul porta pipetta e applicare una pressione positiva per impedire l'intasamento della punta.
9. Individuare la punta della pipetta patch sotto il microscopio e spostarla vicino alla cella usando il micromanipolatore.
   NOTA: i passaggi seguenti si applicano all'aMplifier, software di acquisizione e valutazione dei dati menzionati nell'elenco dei materiali.
10. Avviare il "test della membrana" nel software di acquisizione dati e applicare un passo di tensione (impulso di prova, ad es. 5 mV per 10 ms, basale a 0 mV), manualmente o automaticamente tramite software specifico usando "modalità bagno" mentre esegue "test di membrana" Nel software di acquisizione dati.
11. Controllare che la resistenza della pipetta sia nell'intervallo desiderato (1,5-3,0 MΩ).
12. Correndo le correnti di zero regolando il potenziale della pipetta ruotando la manopola di compensazione della pipetta all'amplificatore mentre si lavora in "modalità bagno" del "test della membrana".
13. Stabilire una patch nella configurazione della cella intera ²⁶ .
    NOTA: Le seguenti fasi richiedono l'applicazione di una pressione positiva e negativa erogata alla porta laterale del porta pipetta utilizzata. Ciò può essere fatto usando una siringa, una bocca o un cono elettronicamenteRegolatore di pressione trollato. In questo protocollo si applica una pressione positiva e negativa tramite un boccaglio.
    1. Raggiungere lentamente la cella con la pipetta patch dall'alto e sollevare la pressione positiva prima di toccarla.
       NOTA: quando la punta è vicina alla cella, la resistenza aumenta leggermente; Ciò è indicato da una dimensione ridotta dell'impulso di prova.
    2. Cambiare il "test della membrana" da "modalità bagno" a "modalità patch", quindi il potenziale di mantenimento al potenziale di riposo previsto dalle cellule (da -30 a -40 mV).
    3. In alcuni casi la configurazione connesso alla cella si forma dopo il rilascio della pressione positiva (2.13.1), altrimenti applica delicatamente la pressione negativa per aiutare la formazione di gigasea.
       NOTA: La configurazione connessa alla cella viene stabilita quando l'impulso di prova viene ridotto a due piccoli picchi capacitivi all'inizio e alla fine dell'impulso e la resistenza della membrana è nella gamma GΩ; Tensioni negative fino a -60 mV mIght facilitano la formazione gigasea.
    4. Compensare la capacità della pipetta ruotando le manopole per la compensazione della capacità della pipetta per ottenere una risposta piatta dell'impulso di prova.
    5. Rottura la patch senza distruggere la tenuta applicando brevi impulsi di pressione negativa o pressione negativa con forza crescente, per ottenere la conformazione a cellule intere.
       NOTA: La transizione di successo dalla cella-attaccata alla configurazione a cellule intere è indicata da un aumento dei picchi capacitivi.
    6. Applicare la compensazione della resistenza della serie impostando parametri a cellule intere e regolazioni di compensazione dell'amplificatore utilizzato per una precisa fissazione del potenziale della membrana alla tensione di ritenzione desiderata.
       1. Attivare il "test della membrana" in modalità "intera cella", nel pannello "Compensazione della resistenza di serie" attivare "previsione" e "correzione" fino al 90% per evitare sovraccarichi e oscillazione della risposta capacitiva, girare la cella interaL'interruttore di compensazione si accende e regola i parametri delle celle intere con le opportune manopole del pannello anteriore ("capacità della cella intera" e "resistenza della serie") dell'amplificatore in modo iterativo per ottenere una risposta di guarnizione ideale.
          NOTA: Per una descrizione dettagliata della compensazione e della correzione della resistenza della serie, fare riferimento al manuale o alla guida dell'amplificatore, poiché questa procedura varia da diversi produttori.
    7. Dopo aver stabilito la configurazione a cellule intere, attendere almeno 2 minuti prima della registrazione per garantire una sostituzione sufficiente della soluzione intracellulare attraverso la pipetta patch.
14. Registrare le correnti indotte dalla luce a differenti potenziali di azionamento utilizzando i protocolli precedentemente impostati (in 1.2).
15. Scambiare il buffer estracellulare a basso [Cl ^- ] nella camera almeno cinque volte senza distruggere la patch e registrare un'altra relazione di tensione di corrente ( cfr. Punto 1.2) a tLa nuova concentrazione di cloruro.
    NOTA: un sistema di perfusione per lo scambio automatico di buffer fa di questo processo, ma non è necessario.
16. Ripeti 2.15. Per ogni condizione ionica da sottoporre a test, ma verificare ripetutamente la qualità della patch tra le misurazioni con un "test a membrana" descritto in precedenza.
    NOTA: Per garantire una precisa tensione di membrana e una resistenza di membrana intracellulare di resistenza allo stabile deve essere superiore a 500 MΩ, mentre la resistenza di accesso non deve superare 10 MΩ, si veda . 2.12.6). Non dimenticare di spegnere la compensazione del parametro delle cellule intere per il test della membrana.
17. Ripeti 2.2. A 2.15. Per diverse celle, ma prendere una nuova copertura di copertura per ogni serie di test per garantire la salubrità delle cellule.

3. Valutazione dei dati

1. Regolare la linea di base di ogni traccia corrente sottraendo la corrente media prima dell'illuminazione.
2. Calcolare il fotocorro stazionario medio I _s ( NOTA: Analizzare le fotocorri di picco o variare la lunghezza della media per determinare il fotocorrente fisso a seconda del protocollo o della domanda scientifica.
3. Ripetere i passaggi 3.1) e 3.2) per tutte le condizioni sperimentate e le diverse celle.
4. Progettare le fotocorri determinate rispetto al rispettivo potenziale di tenuta.
   NOTA: se vengono misurate più misurazioni, le singole registrazioni possono essere normalizzate a una condizione specificata o alla capacità della cella.
5. L'intersezione della relazione di tensione-corrente con l'asse di tensione rappresenta il potenziale di inversione (la corrente netta è zero). Determinare l'interpolazione lineare tra i due punti dati vicini.
   NOTA: se non vi è alcuna inversione di polarità delle fotocorri, estrapolare linearmente dagli ultimi due punti vicini allo zero per ottenere una approssimazione del punto di intersezione.
6. Media la determinata rPotenziali eversori per le stesse condizioni e tracciarle contro la concentrazione di cloruro delle soluzioni tampone esterne ( cfr. Figura 2B ).

Risultati

La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi ottenuti dalle misurazioni seguendo il protocollo descritto. Durante l'illuminazione con luce verde, Ps ACR1 presenta una corrente transitoria veloce che decade rapidamente a un livello corrente fisso. Dopo la spegnimento della luce, le fotocorrienti decadono a zero entro millisecondi ( Figura 2A ). Scambiare la concentrazione di cloruro extracellulare provoca uno spostamento del potenziale di inver...

Discussione

Determinazione dei potenziali di inversione a condizioni ioniche e elettriche definite fornisce informazioni sulle specie ioniche trasportate dopo l'attivazione luminosa dei ChRs. Se solo una specie di ioni varia in un complesso complesso fisiologico e il potenziale di inversione ottenuto si sposta in base al potenziale teorico di Nernst, questa specie ione è l'unico trasportato.

Tuttavia, per i ChRs, i cambi potenziali di inversione sono generalmente meno pronunciati di quelli previ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule HEK293	Sigma Aldrich	85120602	Cellule renali embrionali umane
Retinal	Sigma Aldrich	R2500	all-trans retinal
FuGENE HD	Promega	E2312	Reagente di trasfezione
DMEM	Biochrome	FG 0445	Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose	Roth	3810	Ponti Agar
CaCl2	Roth	5239	CaCl2 2H2O
CsCl	Biomol	2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biochrome	S0615	Coltura cellulare
Glucosio	Roth	HN06	D(+)-Glucosio
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2 6H2O
NaCl	Roth	3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-metil-D-glucamina
Na-aspartato	Sigma Aldrich	A6683	Acido L-aspartico sale di sodio monoidrato
Acido citrico	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	Enzima di restrizione
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	Enzima di restrizione
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	Enzima di restrizione
XL1Blue E. coli	Agilent Technologies	200249	Chemocompetent E. coli
Kanamicina	Roth	T832
Brodo di lisogenia medio	Roth	X964
Agar-Agar	Roth	6494	Piastre di agar
Kit di purificazione plasmidico	Marchery-Nagel	740727.25
Penicilina/Streptomicina	Biocromo	A 2213	Coltura cellulare
Bromidrato di poli-D-lisina	Sigma Aldrich	P6407-5MG	Rivestimento antiscivolo
di copertura Microforge	Pipette		per lucidatura antincendio
	su misura TPP		Banco pulito
Banco pulito	Kojair	Biowizard SL130
Agitatore	IKA	RCT classico
Filo d'argento	Prodotti scientifici	AG-T25; AG-T10	Elettrodi, 0,64 mm (bagno); 0,25 mm (elettrodo)
pH-metro	Knick	765 Osmometro calimetrico
	Vogel	OM 815
Microscopio	Carl Zeiss	ID03	Lucidatura a fuoco
CO2 incubatore	Binder	CB150
Piastre per colture cellulari	TPP	93040	34 mm interno diametro
Vetrini Roth		P232	diametro 15 mm
R	ö nave Messtechnik	MTM12
Beamsplitter	Chroma	21011	90/10
trasmissione Porta pipetta	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage	Molecular Devices	CV203BU
Amplifier Molecular	Devices	AxoPatch200B
Digitizer	Molecular Devices	DigiData1400	Convertitore analogico digitale
Sorgente luminosa	TILL Photonics	Polychrome V	Set a 540 nm a piena intensità
Microscopio	Carl Zeiss	Axiovert 100
Shutter	Vincent Associates	VS25
Shutter driver	Vincent Associates	VCM-D1
Capilarries in vetro	Warner Instruments	G150F-3	Capillari in boresilicato con estremità lucidate a fuoco OD 1,5 mm ID 0,86 mm
Estrattore per micropipette	Sutter Instruments	P1000
Gestore del bagno	Lorenz Messger tebau	MPCU
Set di filtri a tripla banda	Chroma	69008	Filtro a fluorescenza  ECFP/EYFP/mCherry
Telecamera CCD	Watec	Wat-221SCCD
Optometro	Gigahertz Optik	P9710	Misura intensità luminosa
Obiettivo	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X/1.0
DIC Micromanipolatore	Scientifica	PatchStar
Camera di registrazione	Alimentazione su misura
	Manson	HCS-3202	Evita il rumore elettrico proveniente dall'alimentatore incorporato nel microscopio
Tavolo isolato dalle vibrazioni	Newport	M-VW-3636-OPT-01
Gabbia di Faraday	Su misura o qualsiasi tavolo
Tubi flessibili	Qualsiasi commerciale; ad esempio Roth		Diverse dimensioni e materiali per la manipolazione del bagno e l'applicazione della pressione della pipetta; ponti di agar
Lineare agitatore	Sunlab Instruments	SU 1000
Calcolatore del potenziale di giunzione liquida	Molecular Devices o direttamente da Peter H. Barry		Il programma è incluso nel software di acquisizione Clampex o può essere ottenuto da p.barry@unsw.edu.au
Software di acquisizione dati	Molecular Devices	Clampex 10.X
Software di valutazione dati	Molecular Devices	Clampfit 10.X
PsACR1	GenBank o Addgene	KF992074.1 o Addgene plasmide #85465	Gene encoding for PsACR1
Guida all'amplificatore	Molecular Devices	The Axon Guide