Articolo metodologico

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

DOI:

10.3791/55513

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26 febbraio 2017

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1Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Pharmacology, Physiology, and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo rapporto descrive una tecnica semplice e facile da eseguire, utilizzando il vuoto a bassa pressione, per riempire canali microfluidici con cellule e substrati per la ricerca biologica.

Abstract

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Le tecniche di modellamento del substrato e della cellula sono ampiamente utilizzate in biologia cellulare per studiare le interazioni cellula-cellula e cellula-substrato. Le tecniche di modellizzazione convenzionali funzionano bene solo con forme semplici, piccole aree e biomateriali selezionati. Questo articolo descrive un metodo per distribuire le sospensioni cellulari e le soluzioni di substrato in microcanali complessi, lunghi e chiusi (senza uscita) di polidimetilsilossano (PDMS) utilizzando la pressione negativa. Questo metodo consente ai ricercatori di modellare più substrati tra cui fibronectina, collagene, anticorpi (Sal-1), poli-D-lisina (PDL) e laminina. La modellazione dei substrati consente di modellare indirettamente una varietà di cellule. Abbiamo testato i mioblasti C2C12, la linea cellulare neuronale PC12, i neuroni corticali embrionali di ratto e i neuroni retinici degli anfibi. Inoltre, dimostriamo che questa tecnica può modellare direttamente i fibroblasti nei canali microfluidici attraverso una breve applicazione di un basso vuoto su sospensioni cellulari. Il basso vuoto non riduce significativamente la vitalità cellulare, come dimostrato dai saggi di vitalità cellulare. Vengono discusse le modifiche per l'applicazione del metodo a diversi tipi di cellule e substrati. Questa tecnica consente ai ricercatori di modellare cellule e proteine in modelli specifici senza la necessità di materiali o attrezzature esotiche e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con il vuoto.

Introduzione

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In ingegneria dei tessuti e biosensori, la capacità di controllare l'organizzazione spaziale delle proteine e cellule su scala micron, è diventato sempre più importante negli ultimi quarant'anni 1, 2, 3. Precise organizzazione spaziale delle proteine e cellule ha permesso ai ricercatori di esaminare l'interazione tra cellule e substrati contenenti tipi simili o diversi di cellule, per guidare la crescita cellulare, e immobilizzare biomolecole per la fabbricazione di biosensori 4, 5,

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Protocollo

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NOTA: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell'uso. Alcune delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguati (cappa, cassetto portaoggetti) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera, scarpe chiuse) quando si usano materiali tossici o acido / base.

1. Realizzazione del Maestro Stampo per Soft litografia mediante fotolitografia

  1. Disegnare il layout delle microcanali utilizzando uno strumento di disegno computer-aided ....

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Risultati

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Questo metodo consente di patterning di proteine ​​e patterning indiretta di cellule utilizzando dead-end canali microfluidica con dimensioni piccole come 10 micron e le attrezzature disponibili in quasi tutti i laboratori biologici una volta lo stampo maestro è fatto. Questa tecnica può essere utilizzata con canali microfluidici PDMS creata usando fotolitografia tradizionali morbido, o con canali microfluidici PDMS creati con nastro adesivo di fabbricazione (Figura 1) <.......

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Discussione

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Mentre fotolitografia convenzionale è una tecnica ben consolidata per la realizzazione di stampi per litografia soft, attrezzature, materiali e competenze necessarie per utilizzare fotolitografia convenzionale non sono facilmente disponibili al maggior parte dei laboratori. Per i laboratori senza accesso a queste risorse, abbiamo presentato adesivo fabbricazione nastro come un metodo per creare stampi con caratteristiche relativamente semplici per dispositivi microfluidici. Questo metodo permette qualsiasi laboratorio p.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Il finanziamento per questa ricerca è stato fornito dalla Commissione del New Jersey su Spinal Cord Research (NJCSCR) (a FHK), concedere CSCR14IRG005 (a BLF), NIH concedere R15NS087501 (a CHC), e la Kirby Fondazione FM (ETA).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Strumenti di disegno CAD CorelDRAW X4Corel Corporation, CanadaX4 Versione 14.0.0.701Strumento CAD utilizzato per disegnare il layout del dispositivo microfluidico
Stampante laser HPHewlett Packard, CA1739629Utilizzato per stampare il layout del dispositivo microfluidico per la tecnica del nastro adesivo
Bel-Art DessicatorFisher Scientific, MA08-594-16BUtilizzato per degassare la miscela
PDMSNastro adesivo Scotch3M Product, MNTape 600Utilizzato per fabbricare il nastro adesivo Master
PDMS Sylgard 184Dow Corning, MI1064291Casting polymer
Petri DishFisher Scientific, MA08-772-23Utilizzato per mantenere lo stampo per la colata con PDMS
Bisturi in acciaio inossidabile con lama (# 11)Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan2976#11Utilizzato per tagliare il PDMS
PinzettaTed Pella, CA5627-07Utilizzato per maneggiare il calco PDMS durante il distacco
Vetrini FisherScientific, MA12-546-2Utilizzato come superficie per modellare il substrato
Vetrini FisherScientific, MA12-544-4Utilizzato come superficie per modellare il substrato
Rubber Roller DickBlick Art Materials, IL40104-1004Utilizzato per fissare il nastro adesivo sul vetro senza intrappolare bolle d'aria Laser
Mask WriterHeidelberg Instruments, GermaniaDWL66fsUtilizzato per fabbricare la maschera al quarzo utilizzata nel processo di fabbricazione della fotolitografia
EVG Mask Aligner (strumento di esposizione UV per fotolitografia)EV Group, GermaniaEVG 620T(B)Utilizzato per esporre il fotoresist alla luce UV
Spin Coater Headway HeadwayResearch Inc, TXPWM32-PS-CB15PLUtilizzato per rivestire il fotoresist su wafer di silicio
Fotoresist SU-8 50MicroChem, MAY131269Fotoresist negativo utilizzato per la fabbricazione di stampi
SU-8 DevloperMicroChem, MAY020100Sviluppatore di fotoresist
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetraidroottil-1-triclorosilanoUCT Specialità, PAT2492-KGStampo per rivestimento per evitare l'adesione PDMS
IsopropanoloSigma-Aldrich, MO190764Solvente per la pulizia
EtanoloSigma-Aldrich, MO24102Solvente per sterilizzazione
Bromidrato di poli-D-lisina (PDL)Sigma-Aldrich, MOP0899-10MGLa soluzione PDL è prodotta a 0,1 mg/mL in tampone tetraborato di sodio
LamininSigma-Aldrich, MOL2020Laminina aliquotata in 10 µ L aliquote e diluito a 20 µ g/µ L in PBS prima dell'uso
BSAFisher Scientific, MABP1605100Coltura cellulare
C2C12 Linea cellulare mioblasticaATCC, VACRL-1722Utilizzato per dimostrare il patterning C2C12
Linea cellulare PC12ATCC, VACRL-1721Utilizzato per dimostrare il patterning PC12
Collagene di tipo 1, coda di rattoBD Biosciences40236Coltura cellulare
DMEMGIBCO, MA11965-084Coltura cellulare
Siero di cavallo, inattivato a caldoFisher Scientific, MA26050-070Coltura cellulare
Falloidina-tetrametilrodamina B isotiocianato (TRITC)Sigma-Aldrich, MOP1951Per marcare le cellule Kit di analisi delle
cellule morte vive Calcein-AMInvitrogen, MAL-3224Saggio di vitalità cellulare
Biopsia Hole PunchTed Pella, CA15110-10Foro punzonato nel PDMS

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
  2. Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J<....

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Patterning proteicopatterning cellularemicrocanali in PDMSpressione negativadistribuzione sul substratoapplicazione del vuotopatterning di fibronectinapatterning di collagenepatterning cellulare direttopatterning cellulare indiretto

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