Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Summary

Questo rapporto descrive una tecnica semplice e facile da eseguire, utilizzando il vuoto a bassa pressione, per riempire canali microfluidici con cellule e substrati per la ricerca biologica.

Abstract

Le tecniche di modellamento del substrato e della cellula sono ampiamente utilizzate in biologia cellulare per studiare le interazioni cellula-cellula e cellula-substrato. Le tecniche di modellizzazione convenzionali funzionano bene solo con forme semplici, piccole aree e biomateriali selezionati. Questo articolo descrive un metodo per distribuire le sospensioni cellulari e le soluzioni di substrato in microcanali complessi, lunghi e chiusi (senza uscita) di polidimetilsilossano (PDMS) utilizzando la pressione negativa. Questo metodo consente ai ricercatori di modellare più substrati tra cui fibronectina, collagene, anticorpi (Sal-1), poli-D-lisina (PDL) e laminina. La modellazione dei substrati consente di modellare indirettamente una varietà di cellule. Abbiamo testato i mioblasti C2C12, la linea cellulare neuronale PC12, i neuroni corticali embrionali di ratto e i neuroni retinici degli anfibi. Inoltre, dimostriamo che questa tecnica può modellare direttamente i fibroblasti nei canali microfluidici attraverso una breve applicazione di un basso vuoto su sospensioni cellulari. Il basso vuoto non riduce significativamente la vitalità cellulare, come dimostrato dai saggi di vitalità cellulare. Vengono discusse le modifiche per l'applicazione del metodo a diversi tipi di cellule e substrati. Questa tecnica consente ai ricercatori di modellare cellule e proteine in modelli specifici senza la necessità di materiali o attrezzature esotiche e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con il vuoto.

Introduction

In ingegneria dei tessuti e biosensori, la capacità di controllare l'organizzazione spaziale delle proteine e cellule su scala micron, è diventato sempre più importante negli ultimi quarant'anni ^{1, 2, 3.} Precise organizzazione spaziale delle proteine e cellule ha permesso ai ricercatori di esaminare l'interazione tra cellule e substrati contenenti tipi simili o diversi di cellule, per guidare la crescita cellulare, e immobilizzare biomolecole per la fabbricazione di biosensori ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Gli attuali metodi di proteine ​​patterning includono photopatterning e stampa microcontact. Photopatterning utilizza materiale sensibile alla luce, che viene reticolato in seguito all'esposizione ad ultruna viola (UV). Luce UV diretta a un fotomaschera (costituito da aree trasparenti con le regioni più scure per prevenire la trasmissione della luce UV) provoca la reticolazione in regioni specifiche che possono poi essere utilizzati per successivo fissaggio dei biomateriali o celle ^{10, 11.} Mentre questo schema è molto preciso e consente un controllo preciso della topografia della superficie cultura, è limitato a biomolecole sensibili ai raggi UV che possono essere modellati da radiazione UV ^12. Stampa microcontact è un altro metodo popolare di patterning proteine specifiche ^{13, 14.} In questo metodo, un silossano (PDMS) timbro poli-dimetil viene trattata con una varietà di reagenti modifica della superficie prima di essere stati immersi in una soluzione del substrato biomolecolare prescelto. E 'poi delicatamente pressato su un vetrino di vetro o di altra superficie così "stamping" biomolecole sulla superficie cultura. However, stampaggio è limitata al tipo di materiale che può essere trasferito, nonche la bagnabilità di biomolecole alla superficie del timbro PDMS ^15.

Patterning diretto delle cellule può essere più difficile e si basa su metodi complessi come substrati commutabili, metodi basati stencil, o patterning con specifiche molecole di adesione cellulare ^{16, 17.} Questi metodi sono limitati nella loro capacità di cellule modello a causa della mancanza di substrati di adesione cellulare compatibili, incompatibilità del processo di lavorare con cellule sensibili biologiche e vincoli, incoerenza nel riprodurre il patterning e complessità della procedura. Ad esempio, con i substrati commutabile, substrati personalizzati devono essere progettati per ogni tipo di cellula, per passare la loro adesione a specifici tipi cellulari senza degradazione per esposizione alla luce UV e calore utilizzato nel processo ^17, < class = sup "xref"> ^{18, 19, 20.} metodi di patterning basata Stencil sono versatili nella loro capacità di cellule del modello; Tuttavia, è difficile produrre matrici PDMS a spessori adeguati per l'utilizzo ^{16, 21.} L'iniezione diretta di cellule in canali microfluidica PDMS hanno alcuni vantaggi quali: 1) facilità di fabbricazione di canali microfluidica e 2) di idoneità per molte cellule e substrati diversi. Tuttavia, il problema prevalente di cattura bolla d'aria durante il processo di iniezione a causa della idrofobicità del PDMS senza l'uso di pulizia al plasma, o altri metodi per ridurre bolle d'aria, rende difficile creare costantemente cellule modellata su superfici di vetro o di plastica ^21.

Questo lavoro si espande su capillare micromolding ^{22, 23,}lass = "xref"> ^{24, 25, 26} e riporta un metodo per iniettare proteine e cellule sospensioni in microcanali. Il metodo utilizzato qui dimostra la patterning dei substrati ed entrambi patterning diretto e indiretto di specifici tipi cellulari. Questa tecnica supera l'elevata idrofobicità di PDMS ed elimina la presenza di bolle durante l'iniezione del substrato o da cellule sfruttando la permeabilità ai gas di PDMS ^27. Questo documento dimostra l'uso della tecnica con diversi substrati diversi e tipi di cellule. L'articolo evidenzia anche la fabbricazione di stampi per la litografia morbido utilizzando la fotolitografia convenzionale nonché una semplice ed adesivo a basso costo metodo nastro utile risorse limitate impostazioni ^{28, 29.}

Protocol

NOTA: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell'uso. Alcune delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguati (cappa, cassetto portaoggetti) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera, scarpe chiuse) quando si usano materiali tossici o acido / base.

1. Realizzazione del Maestro Stampo per Soft litografia mediante fotolitografia

1. Disegnare il layout delle microcanali utilizzando uno strumento di disegno computer-aided design (CAD).
2. Stampa il layout su un piatto maschera vuoto utilizzando la maschera laser scrittore.
3. Risciacquare un wafer di silicio da 4 pollici con acetone mediante isopropanolo e asciugare con una pistola ad aria azoto per garantire che nessun solvente viene lasciato sul wafer.
4. Disidratare wafer mediante cottura su una piastra calda a 200 ° C per 5 min.
5. Selezionare un fotoresist negativo progettata per l'altezza desiderata dei microcanali. Fo esempio, utilizzare fotoresist negativo SU-8 50 per ottenere microcanali con un'altezza di 50 micron.
6. Lasciare il wafer raffreddare a temperatura ambiente, e quindi allineare il wafer sul mandrino di coater rotazione.
7. Dispensare 4 ml (1 mL diametro / pollice della fetta) di fotoresist negativo sul centro della fetta.
8. Spin cappotto il wafer con un ciclo di centrifuga in due fasi utilizzando un filatore. Innanzitutto, applicare un ciclo di diffusione di 500 rpm con un'accelerazione di 100 rpm / s per 10 s. Quindi applicare un ciclo di centrifuga di 2000 giri con un'accelerazione di 300 rpm / s ² per 30 s per ottenere un rivestimento 50 micron di photoresist su un wafer.
9. Morbido cuocere il wafer in due fasi su un piatto caldo secondo le istruzioni del produttore. Per un rivestimento 50 micron di photoresist, prima pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 6 minuti e poi subito rampa della temperatura della piastra calda per lasciare cuocere il wafer a 95 ° C per 20 min.
10. Lasciare il wafer raffreddare a temperatura ambiente e quindi caricare ilwafer sul palco litografia.
11. Allineare la maschera sul wafer utilizzando maschera allineatore ed esporre la fetta di luce UV (come da istruzioni del produttore) ad una intensità di 1,5 mW / cm ² per 146 s per applicare la dose totale UV di 220 mJ / cm ² necessario per un 50 micron di spessore strato di resina fotosensibile.
12. Applicare dopo l'esposizione cuocere al wafer in due fasi su un piatto caldo. Per un rivestimento di 50 micron di photoresist, prima pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 1 min e immediatamente rampa della temperatura della piastra calda per lasciare cuocere è a 95 ° C per 5 min.
13. Sviluppare il wafer in immergendo il wafer di SU-8 sviluppatore e scuotendo delicatamente fino a quando le caratteristiche diventano chiari sul wafer. Sviluppare il wafer per ~ 6 min per il photoresist spessore 50 micron.
14. Risciacquare eccesso sviluppatore con isopropanolo ed etanolo, quindi asciugare il wafer con una pistola ad aria azoto.
15. Duro cuocere il wafer di silicio su una piastra calda a 150 ° C per 15 min.
16. Posiziona ilwafer in un essiccatore con 25 ml di agente silanizzazione tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triclorosilano.
    NOTA: L'agente silanizzazione è corrosivo, quindi dovrebbe essere utilizzato in un cappa acido / base, con attrezzature adeguate di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, chiuso-toe scarpe).
17. Applicare il vuoto per 5 minuti ed esporre il wafer ai vapori di silano per 30 minuti senza rilasciare il vuoto.
18. Trasferire il wafer in una capsula di Petri opportunamente dimensionato.

2. Realizzazione del Maestro Stampo per Soft litografia con nastro adesivo

1. Disegnare il layout delle microcanali utilizzando uno strumento di disegno CAD e stampare il disegno su carta bianca.
2. Pulire un vetrino abbastanza grande per ospitare il disegno con isopropanolo e poi asciugare il vetrino con un fucile ad aria.
3. Attaccare il nastro adesivo sul vetrino pulito. Non essere attenti a intrappolare eventuali bolle d'aria.
4. Nastro lati della glass scivolare sulla carta con il disegno, con il nastro rivolta verso l'alto.
5. Utilizzare un bisturi per tagliare il nastro sul vetrino utilizzando il disegno di carta come riferimento e quindi rimuovere il nastro da aree indesiderate del vetrino.
6. Sciacquare il vetrino con isopropanolo e asciugare con un fucile ad aria. Cuocere il vetrino in stufa a 65 ° C per 30 min.
7. Delicatamente rotolare sopra il nastro con un rullo di gomma per rimuovere le bolle d'aria e consentire la slitta raffreddare a temperatura ambiente.

3. soft litografia fabbricazione dei dispositivi PDMS

1. Mescolare PDMS elastomero e il suo agente di indurimento in un rapporto di 10: 1 (w: w), agitare la miscela vigorosamente, e quindi degassare la miscela ponendolo in una camera a vuoto fino bolle d'aria vengono visualizzati nella miscela.
2. Versare il composto su uno stampo di silicone silanizzata o muffa nastro adesivo in una capsula di Petri per ottenere un ~ 2 spesso strato di PDMS e Degas mm fino a quando tutta l'aria bolle scompaiono.
3. Curare il PDMS in un fornoa 65 ° C per 2 h.
4. Utilizzare un bisturi per tagliare lo strato PDMS di almeno 5 mm di distanza dalle caratteristiche e poi sbucciate le PDMS curato fuori lo stampo con pinzetta.
5. Effettuare un singolo foro di ingresso con una biopsia 1 millimetro punzone ovunque sul microcanali, preferibilmente al termine di una rete di microcanali, come mostrato nella figura 2a e 4b.
6. Pulire i PDMS espressi con del nastro adesivo per rimuovere le particelle di polvere adsorbiti sul dispositivo. Sterilizzare il dispositivo microcanali PDMS (PDMS Cast) risciacquando con una soluzione di etanolo al 70% seguita da deionizzata sterile dell'acqua (DI), e esporre a UV per 30 min.
7. Tenere il dispositivo PDMS sterile in una capsula di Petri sterile fino al momento dell'uso.

4. substrato Patterning

1. Posizionare il PDMS sterili espressi con una pinzetta su un vetrino di vetro sterile o capsula di Petri e applicare una leggera pressione con la punta delle pinzette.
   NOTA: Il cast PDMS fa una conforme, ma tenuta reversibili con la glass vetrino o una scatola Petri formando microcanali senza l'uso di alcun adesivo.
2. Posizionare una goccia (20 - 40 ml) della soluzione di substrato sull'ingresso copre completamente il foro di immissione. Motivo Poly-D-lisina (PDL) posizionando una goccia 20 ml di PDL in tampone sodio tetraborato in ingresso dei microcanali.
3. Mettere la capsula di Petri in un vuoto di ~ 254 mmHgA (equivalente ad alloggiare vuoto in laboratori biologici) per 10 minuti, e osservare l'aria che esce dal canale nella forma di bolle.
4. Rilasciare il vuoto e osservare la soluzione di substrato che scorre nel microcanali.
5. Incubare il piatto alle condizioni adeguate per il substrato aderenza. Vedere Tabelle 1 e 2 per le condizioni di incubazione (questi variano a seconda del substrato). Per PDL patterning, incubare per 1 ora a 37 ° C.
6. sbucciare con cautela il timbro PDMS con una pinzetta sterile e lavare il modello sul vetrino di vetro tre volte con acqua deionizzata.
7. Aggiungere una soluzione 1% di siero albumina bovina (BSA) per capsula di Petri per coprire il piatto o vetro coprioggetto e incubare una notte a 37 ° C.
   NOTA: Ciò consentirà di ridurre l'aderenza non specifico nelle regioni non rivestiti.
8. Aspirare off la soluzione BSA 1% e il substrato modellato è ora pronto per l'uso.

5. Patterning indiretta di celle

1. Preparare la sospensione cellulare in terreno di coltura privo di siero. Il tipo di cellula e densità cellulare sono elencati nella Tabella 1.
2. Aggiungere la sospensione cellulare al piatto modellato Petri e sommergere completamente la regione modellata in sospensione cellulare.
3. Incubare la piastra di Petri a 37 ° C in un incubatore per 15 minuti per permettere alle cellule di allegare al substrato modellato.
4. Aspirare la sospensione cellulare in eccesso dalla piastra di Petri e lavare le cellule fantasia tre volte con tampone fosfato (PBS) mentre delicatamente agitazione per 10 s per rimuovere le cellule senza legami.
5. Aggiungere l'unamezzo di coltura ppropriate alle colture cellulari fantasia e incubare le cellule modellata a 37 ° C in un incubatore CO _2.

6. Patterning diretta delle cellule

NOTA: Questa tecnica è un'alternativa al patterning cella indiretta descritto nel passaggio 5. Tuttavia, a differenza del passaggio 5, in questa tecnica cellule sono modellati su superfici coltura tissutale con o senza rivestimento substrato.

1. Sterilizzare il dispositivo microfluidico risciacquando con una soluzione di 70% di etanolo seguito da acqua DI.
2. Immergere il dispositivo notte in una soluzione di 1% BSA per impedire l'adesione cellulare ai PDMS.
3. Essiccare il dispositivo a temperatura ambiente e fissarlo al fondo del piatto Petri coltura di tessuti trattati.
4. Preparare la sospensione cellulare in terreni di coltura privo di siero. Il tipo di cellula e densità cellulare sono elencati nella Tabella 2.
5. Inserire una gocciolina (4 - 8 ml) della sospensione cellulare, sufficiente a riempire lamicrocanali, sull'ingresso coprendo completamente il foro di immissione.
6. Mettere la capsula di Petri in un vuoto per 10 minuti e osservare aria proveniente dal canale in forma di bolle. Il vuoto e osservare la sospensione cellulare scorre nel microcanali.
7. Incubare la piastra di Petri in un incubatore per favorire l'adesione delle cellule secondo le condizioni di incubazione (dipende dal tipo di cellula modellata) indicato nella Tabella 2. Aggiungere PBS alla capsula di Petri immergendo il dispositivo PDMS.
8. Sbucciare la PDMS con cautela la capsula di Petri con una pinzetta e lavare il modello con PBS. Aggiungere terreni di coltura cellulare per la piastra di Petri e posizionare la coltura cellulare in incubatrice.

Results

Questo metodo consente di patterning di proteine ​​e patterning indiretta di cellule utilizzando dead-end canali microfluidica con dimensioni piccole come 10 micron e le attrezzature disponibili in quasi tutti i laboratori biologici una volta lo stampo maestro è fatto. Questa tecnica può essere utilizzata con canali microfluidici PDMS creata usando fotolitografia tradizionali morbido, o con canali microfluidici PDMS creati con nastro adesivo di fabbricazione (Figura 1) <...

Discussion

Mentre fotolitografia convenzionale è una tecnica ben consolidata per la realizzazione di stampi per litografia soft, attrezzature, materiali e competenze necessarie per utilizzare fotolitografia convenzionale non sono facilmente disponibili al maggior parte dei laboratori. Per i laboratori senza accesso a queste risorse, abbiamo presentato adesivo fabbricazione nastro come un metodo per creare stampi con caratteristiche relativamente semplici per dispositivi microfluidici. Questo metodo permette qualsiasi laboratorio p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Strumenti di disegno CAD CorelDRAW X4	Corel Corporation, Canada	X4 Versione 14.0.0.701	Strumento CAD utilizzato per disegnare il layout del dispositivo microfluidico
Stampante laser HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Utilizzato per stampare il layout del dispositivo microfluidico per la tecnica del nastro adesivo
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Utilizzato per degassare la miscela
PDMSNastro adesivo Scotch	3M Product, MN	Tape 600	Utilizzato per fabbricare il nastro adesivo Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Utilizzato per mantenere lo stampo per la colata con PDMS
Bisturi in acciaio inossidabile con lama (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Utilizzato per tagliare il PDMS
Pinzetta	Ted Pella, CA	5627-07	Utilizzato per maneggiare il calco PDMS durante il distacco
Vetrini Fisher	Scientific, MA	12-546-2	Utilizzato come superficie per modellare il substrato
Vetrini Fisher	Scientific, MA	12-544-4	Utilizzato come superficie per modellare il substrato
Rubber Roller Dick	Blick Art Materials, IL	40104-1004	Utilizzato per fissare il nastro adesivo sul vetro senza intrappolare bolle d'aria Laser
Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germania	DWL66fs	Utilizzato per fabbricare la maschera al quarzo utilizzata nel processo di fabbricazione della fotolitografia
EVG Mask Aligner (strumento di esposizione UV per fotolitografia)	EV Group, Germania	EVG 620T(B)	Utilizzato per esporre il fotoresist alla luce UV
Spin Coater Headway Headway	Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Utilizzato per rivestire il fotoresist su wafer di silicio
Fotoresist SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Fotoresist negativo utilizzato per la fabbricazione di stampi
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Sviluppatore di fotoresist
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetraidroottil-1-triclorosilano	UCT Specialità, PA	T2492-KG	Stampo per rivestimento per evitare l'adesione PDMS
Isopropanolo	Sigma-Aldrich, MO	190764	Solvente per la pulizia
Etanolo	Sigma-Aldrich, MO	24102	Solvente per sterilizzazione
Bromidrato di poli-D-lisina (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	La soluzione PDL è prodotta a 0,1 mg/mL in tampone tetraborato di sodio
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminina aliquotata in 10 µ L aliquote e diluito a 20 µ g/µ L in PBS prima dell'uso
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Coltura cellulare
C2C12 Linea cellulare mioblastica	ATCC, VA	CRL-1722	Utilizzato per dimostrare il patterning C2C12
Linea cellulare PC12	ATCC, VA	CRL-1721	Utilizzato per dimostrare il patterning PC12
Collagene di tipo 1, coda di ratto	BD Biosciences	40236	Coltura cellulare
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Coltura cellulare
Siero di cavallo, inattivato a caldo	Fisher Scientific, MA	26050-070	Coltura cellulare
Falloidina-tetrametilrodamina B isotiocianato (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	Per marcare le cellule Kit di analisi delle
cellule morte vive Calcein-AM	Invitrogen, MA	L-3224	Saggio di vitalità cellulare
Biopsia Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Foro punzonato nel PDMS