CAPRRESI: Assemblaggio chimico mediante inserimento del sito enzimatico di recupero e restrizione di plasmide

Sommario

Qui presentiamo l'assemblaggio di chimera mediante il recupero del plasmide e l'inserimento del sito enzimatico di restrizione (CAPRRESI), un protocollo basato sull'inserimento di siti di enzimi di restrizione in sequenze di DNA sinonimo e recupero plasmide funzionale. Questo protocollo è un metodo veloce e conveniente per fusione di geni di codifica proteica.

Abstract

Qui presentiamo l'assemblaggio di chimera mediante recupero del plasmide e inserimento del sito enzimatico di restrizione (CAPRRESI). CAPRRESI beneficia di molti punti di forza del metodo originale di recupero del plasmide e introduce la digestione dell'enzima di restrizione per facilitare le reazioni di legatura del DNA (richieste per l'assemblaggio di chimera). Per questo protocollo, gli utenti clonano i geni del wildtype nello stesso plasmide (pUC18 o pUC19). Dopo la selezione in silico di regioni di sequenze di aminoacidi in cui devono essere assemblate le chimere, gli utenti ottengono tutte le sequenze sinonime di DNA che li codificano. Gli script di Perl ad hoc consentono agli utenti di determinare tutte le sequenze di sinonimi del DNA. Dopo questo passaggio, un altro script Perl cerca siti di restrizione enzimatica su tutte le sequenze di DNA sinonimo. Questa analisi in silico viene eseguita anche utilizzando il gene di resistenza dell'ampicillina ( ampR ) trovato sui plasmidi pUC18 / 19. Gli utenti progettano oligonucleotidi all'interno delle regioni sinonime per interrompere i geni wildtype e ampR mediante PCR. Dopo obtL'integrazione e la purificazione di frammenti di DNA complementari, la digestione dell'enzima di restrizione viene completata. L'assemblaggio della chimera è ottenuto legando appropriati frammenti di DNA complementari. I vettori pUC18 / 19 sono selezionati per CAPRRESI perché offrono vantaggi tecnici, come piccole dimensioni (2.686 paia di base), numero di copie elevate, caratteristiche di reazione vantaggiosa di sequenziamento e disponibilità commerciale. L'impiego di enzimi di restrizione per l'assemblaggio di chimere elimina la necessità di DNA polimerasi che producono prodotti blunt-ended. CAPRRESI è un metodo veloce e conveniente per la fusione di geni che codificano proteine.

Introduzione

Il complesso gene chimerico è stato ampiamente utilizzato nella biologia molecolare per chiarire la funzione proteica e / o per scopi biotecnologici. Esistono diversi metodi per la fusione di geni, come la sovrapposizione del prodotto PCR ¹ , il recupero del plasmide ² , la ricombinazione omologa ³ , i sistemi CRISPR-Cas9 ⁴ , la ricombinazione localizzata ⁵ e l'assemblaggio Gibson ⁶ . Ognuna di esse offre diversi vantaggi tecnici; Per esempio la flessibilità del disegno PCR sovrapposto, la selezione in vivo di co....

Protocollo

1. Protocollo CAPRRESI

NOTA: la Figura 1 rappresenta il protocollo CAPRRESI complessivo. Questa tecnica è basata su un disegno in silico e la successiva costruzione delle chimere desiderate.

1. Selezione del plasmide di clonazione, pUC18 o pUC19.
   1. Selezionare il vettore pUC che meglio si adatta alle esigenze tecniche.
      NOTA: entrambi i vettori hanno la stessa sequenza, ad eccezione dell'orientamento del sito di clonazione multiplo. Questo è importante per la progettazione di oligonucleotidi e la rottura del plasmide PCR.
2. In analisi

Risultati

La figura 1 descrive CAPRRESI. Utilizzando questo metodo, due geni chimerici sono stati assemblati scambiando i domini di due fattori di sigma primario batterico ( es. E. coli RpoD e R. etli SigA). Le sequenze di DNA dei geni rpoD e sigA sono state ottenute utilizzando il Artemis Genome Browser ¹⁴ da GenBank genome file NC_000913 e NC_007761, rispettivamente. La sequenza DNA del vettore pUC18 è stata ottenuta da.......

Discussione

CAPRRESI è stato progettato come alternativa al PRM ² . Il PRM originale è una tecnica potente; Consente la fusione di sequenze di DNA su qualsiasi parte dei geni selezionati. Per PRM, i geni di tipo selvatico devono essere clonati nello stesso plasmide. Dopo di che, gli oligonucleotidi sono progettati all'interno di geni selvatici e resistenti agli antibiotici trovati sul plasmide. La disfunzione del plasmide è ottenuta mediante PCR mediante DNA-polimerasi estremamente nitide e ad alta fedel.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Platinum Taq DNA polimerasi High Fidelity	Thermo Fisher	11304011	Produce una miscela di prodotti PCR con estremità a sporgenza smussata/3'-A
Kit di isolamento plasmidico ad alta purezza	Roche	11754785001	Utilizzato per tutte le reazioni di purificazione dei plasmidi
Kit di purificazione dei prodotti PCR ad alta purezza	Roche	11732676001	Utilizzato per tutte le reazioni di purificazione PCR da gel di agarosio
Enzima di restrizione AflII	New England Biolabs	R0520L	Riconosce la sequenza 5'-CTTAAG-3' e taglia a 37 ° C
Enzima di restrizione KpnI-HF	New England Biolabs	R3142L	Riconosce la sequenza 5'-GGTACC-3' e taglia a 37 ° Enzima
di restrizione C SpeI-HF	New England Biolabs	R3133L	Riconosce la sequenza 5'-ACTAGT-3' e taglia a 37 ° Enzima
di restrizione C XbaI	New England Biolabs	R0145L	Riconosce la sequenza 5'-TCTAGA-3' e taglia a 37 ° C
Ampicillina sale sodico	Sigma Aldrich	A0166-5G	Antibiotici
Acido nalidixico	Sigma Aldrich	N8878-5G
Antibiotici Estratto di lievito	Sigma Aldrich	Y1625-1KG	Coltura cellulare
batterica Peptone di caseina	Sigma Aldrich	70171-500G	Coltura cellulare batterica
NaCl	Sigma Aldrich	S9888-1KG	cloruro di sodio
Agar	Sigma Aldrich	05040-1KG	coltura cellulare
battericaXbaI	Thermo Fisher	FD0684	Enzima di restrizione XbaI enzima
KpnI Thermo	Fisher	FD0524	KpnI enzima
	England Biolabs	M2200S	Kit di legatura rapida
DNAAflII enzima di restrizione	Thermo Fisher	FD0834	Enzima di restrizione AflII enzima
SpeI	Thermo Fisher	FD1253	Enzima di restrizione SpeI enzima

Enzima di restrizione della Kit di legatura rapida New del