Protocolli per Indagare la distribuzione Host-tessuti, trasmissione-mode, e Effetto sul Fitness ospite di un Densovirus in cotone bollworm

Sommario

Qui, vi presentiamo un protocollo per indagare la distribuzione host-tessuto, modalità di trasmissione, e l'effetto sulla forma fisica host di un densovirus all'interno di una specie di lepidotteri, il bollworm cotone. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare l'interazione tra altri virus per via orale-trasmissibili e loro ospiti dell'insetto.

Abstract

Molti nuovi virus sono stati scoperti in ospiti animali che utilizzano tecnologie di sequenziamento di prossima generazione. In precedenza, abbiamo riportato un virus mutualistica, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in una specie di lepidotteri, il bollworm cotone, Helicoverpa armigera (Hubner). Qui, descriviamo i protocolli che sono attualmente utilizzati per studiare l'effetto di HaDV2 sul suo ospite. In primo luogo, stabiliamo un cotone bollworm colonia senza HaDV2 da una singola coppia di riproduttori. Poi, abbiamo oralmente inoculare alcuni prole larvale neonato con HaDV2 contenenti liquido filtrato per la produzione di due colonie con lo stesso background genetico: una HaDV2 infettati, l'altro non infetti. Un protocollo per confrontare parametri della tabella vita (ad esempio, larvale, pupa e periodi adulti e fecondità) tra gli individui HaDV2-infetti e -uninfected è anche presentati, come i protocolli per determinare la distribuzione host-tessuto e l'efficienza della trasmissione di HaDV2. Questi protocolli woULD anche essere adatto per lo studio degli effetti di altri virus trasmesse oralmente sui loro ospiti dell'insetto, gli host lepidotteri in particolare.

Introduzione

Negli ultimi decenni, lo sviluppo della tecnologia di sequenziamento, come sequenziamento di prossima generazione (NGS) ha facilitato la scoperta di molti DNA e RNA virus nuovi, virus particolare non patogeni, ma anche nuovi ceppi di virus già noti ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,}

Protocollo

1. Costruzione del HaDV2-libera Cotton bollworm Colony

1. Cotone posteriore bollworm larve (H. armigera) su una dieta artificiale ³² in una camera di crescita controllata o una camera climatica artificiale a 25 ± 1 ° C, con 14 h di luce / 10 h scuro e il 60% di umidità relativa.
2. Aiutare singola coppia di accoppiamento farfalle appena eclosed utilizzando una gabbia di plastica per paio (altezza 10 cm diametro 5 cm) rivestito con una garza di cotone per assicurare una buona ventilazione e per servire come substrato ovideposizione. Per aumentare la probabilità di ottenere una colonia privo di virus, utilizzare almeno 30....

Risultati

Progenie dai genitori che erano HaDV2-libera (Figura 3A) sono stati allevati come NONINF-strain. Abbiamo amplificato con successo il gene actina usando gli stessi modelli di DNA, suggerendo che i modelli di DNA erano di buona qualità (Figura 3B). Inoltre, i selezionati casualmente otto progenie erano liberi di HaDV2 (Figura 3C), HaNPV (Figura 3D), e Wolbachia (Figura 3E). Ancora una vol.......

Discussione

Negli ultimi decenni, la maggior parte degli studi sulle interazioni insetto-virus sono concentrati sulla salute miele delle api ^{34, 35, 36,} vettori di malattie umane ^37, impianto di virus ^38, e alcuni virus patogeni di insetti che hanno un grande potenziale come agenti di controllo biologico ^39. Poca attenzione è stata prestata ai virus segrete negli inset.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a 24 pozzetti	Corning	07-200-740	Più fornitori disponibili.
Kit di estrazione del DNA	TIANGEN	DP304-03	Più fornitori disponibili.
termociclatore	Veriti; Applied Biosystems	4375786
PBS	Corning	21-040-CV
0.22 µ m filtro a membrana	Millipore	SLGS025NB
pEASY-T Cloning Vector	TransGen, Pechino, Cina	CT301-02
Pinzette	IDEAL-TEK	2.SA
Premix Ex Taq (Probe qPCR)	Takara	RR390A
Sonde	Invitrogen	Ordine
Primer	Invitrogen	Ordine
per microspettrofotometria NanoDrop 2000c	Termo scientifico	non disponibile
7500 Sistema di PCR in tempo reale	Applied Biosystems	non disponibile
stereomicroscopio SZX-16	Olympus	non disponibile
saccarosio			Diversi fornitori disponibili.
		vitaminico	Più fornitori disponibili.