Questo protocollo presenta l'uso di un'iniezione di ganglio della radice dorsale (DRG) con un vettore virale e una concomitante lesione da schiacciamento della radice dorsale in un ratto adulto come modello per studiare la rigenerazione sensoriale degli assoni. Questo modello è adatto per studiare l'uso della terapia genica per promuovere la rigenerazione sensoriale degli assoni.
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Articolo metodologico
Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration
In questo articolo
Sommario
Abstract
Raggiungere la rigenerazione degli assoni dopo una lesione del sistema nervoso è un compito impegnativo. Poiché diverse parti del sistema nervoso centrale (SNC) differiscono tra loro anatomicamente, è importante identificare un modello appropriato da utilizzare per lo studio della rigenerazione degli assoni. Utilizzando un modello adatto, possiamo formulare un trattamento specifico in base alla gravità della lesione, al tipo di cellula neuronale di interesse e al tratto spinale desiderato per valutare la rigenerazione. All'interno del percorso sensoriale, i neuroni DRG sono responsabili della trasmissione delle informazioni sensoriali dalla periferia al SNC. Presentiamo qui un protocollo che utilizza un'iniezione di DRG con un vettore virale e una concomitante lesione da schiacciamento della radice dorsale nel midollo spinale cervicale inferiore di un ratto adulto come modello per studiare la rigenerazione sensoriale degli assoni. Come dimostrato utilizzando un virus di controllo, AAV5-GFP, mostriamo l'efficacia di un'iniezione diretta di DRG nella trasduzione dei neuroni DRG e nel tracciamento degli assoni sensoriali nel midollo spinale. Mostriamo anche l'efficacia della lesione da schiacciamento della radice dorsale nella denervazione della zampa anteriore come modello di lesione per valutare la rigenerazione degli assoni. Nonostante la necessità di una formazione specializzata per eseguire questa procedura chirurgica invasiva, il protocollo è flessibile e i potenziali utenti possono modificare molte parti per soddisfare le loro esigenze sperimentali. È importante sottolineare che può servire come base per coloro che sono alla ricerca di un modello animale adatto per i loro studi. Crediamo che questo articolo aiuterà i nuovi utenti ad apprendere la procedura in modo molto efficiente ed efficace.
Introduzione
Il raggiungimento di rigenerazione degli assoni dopo una lesione del sistema nervoso è un compito impegnativo 1. Per studiare il fallimento della rigenerazione assonale nel sistema nervoso centrale (SNC), i ricercatori hanno usato una pletora di modelli di lesioni nervose. Come regioni del SNC differiscono, è importante utilizzare un modello anatomicamente appropriato per studiare la rigenerazione assonale. Utilizzando il modello appropriato, i ricercatori possono formulare una terapia specifica in base alla gravità del danno, il tipo di cellule neuronali di interesse, e il tratto della colonna vertebrale desiderato per valutare la rigenerazione, al contrario di una strategia di trattamento "uno-per-tutti".
Lesioni del midollo spinale, per esempio, i sintomi più debilitanti derivano dalla perdita di sensibilità e locomozione. Perdita di sensibilità è causata da un danno ai percorsi sensoriali ascendente, mentre la perdita di locomozione è causata da un danno alle vie motorie discendenti. A causa di differenze cellulari e anatomiche tra questi two percorsi, molti studi di rigenerazione degli assoni mirati concentrano solo su uno o l'altro percorso, con la motivazione che il successo di recupero di entrambi sarebbe di enorme beneficio per i pazienti. In questo articolo, presentiamo un protocollo che utilizza un'iniezione diretta gangli della radice dorsale (DRG) con un vettore virale e un concomitante radice dorsale lesione da schiacciamento nella inferiore cervicale midollo spinale di ratto adulto come modello per studiare la rigenerazione assonale sensoriale.
DRG neuroni sensoriali sono responsabili per la trasmissione di informazioni sensoriali, come la sensazione tattile e il dolore, dalla periferia al SNC. Le lunghe proiezioni assonale dei neuroni sensoriali del midollo spinale servire come un buon modello per studiare la rigenerazione degli assoni a lunga distanza. Inoltre, come roditori possono sopravvivere ad una lesione percorso sensoriale, come una lesione da schiacciamento radice dorsale con complicazioni assistenziali minimi, i ricercatori possono studiare la rigenerazione degli assoni del sistema nervoso centrale, senza la necessità di lesioni completamente il midollo spinale. Una quadrupla C5 - C8 (cervicale level 5 - 8) della radice dorsale lesione da schiacciamento ha dimostrato di essere un modello utile per forepaw deafferentazione 2. Inoltre, una dorsale lesioni radice schiacciamento fornisce un modello "pulito" per studiare la rigenerazione assonale di una lesione del midollo spinale diretta perché è complicata da altri fattori, quali la formazione della cicatrice gliale.
L'uso della terapia genica virale per riprogrammare i neuroni in uno stato rigenerativo è stata sempre considerata come una strategia di trattamento promettente per molte condizioni neurologiche 3. Gli studi hanno dimostrato l'applicazione di un vettore virus adeno-associato (AAV) portante il transgene di una proteina che favorisce la crescita può raggiungere rigenerazione assonale robusta con recupero comportamentale 4, 5, 6. La bassa patogenicità apparente di AAV nel provocare una risposta immunitaria e la capacità di trasdurre cellule che non si dividono, come i neuroni, rendonocosì il vettore ottimale per la terapia genica. Inoltre, il modulo AAV ricombinante è utilizzato per la terapia. In questa forma, è incapace di integrare suo genoma virale nel genoma dell'ospite 7, riducendo il rischio di mutagenesi inserzionale rispetto ad altri vettori virali, come lentivirus. Questo rende AAV una scelta sicura per applicazioni di terapia genica.
Come DRG contiene i corpi cellulari dei neuroni sensoriali, è il bersaglio anatomico più appropriata per la somministrazione del virus per la terapia genica di studiare e / o promuovere la rigenerazione assonale sensoriale. In uno studio comparativo differenti sierotipi di AAV e lentivirus, AAV sierotipo 5 (AAV5) ha dimostrato di essere il più efficiente in trasduzione neuroni DRG su un percorso tempo di almeno 12 settimane quando iniettato direttamente nel DRG 8. Inoltre, AAV può raggiungere più del 40% efficienza di trasduzione, trasduzione tutti i sottotipi neuronali DRG, come il grande diametro neurofilamenti 200 kDa(NF200) neuroni -positive e il piccolo diametro CGRP (CGRP) - o b4 isolectin (IB4) neuroni -positive 4, 8.
Poiché la procedura chirurgica di iniezione DRG e lesione da schiacciamento delle radici dorsali è estremamente invasivo e delicato, noi crediamo che questo articolo vi aiuterà i nuovi utenti ad imparare la procedura in modo molto efficiente. In questo articolo, mostriamo risultati rappresentativi di ratti adulti quattro settimane dopo l'iniezione di un virus controllo AAV5-GFP (proteina fluorescente verde) in C6 - C7 DRG con un concomitante C5 - C8 spinali lesione da schiacciamento. Questo modello è particolarmente adatto per i ricercatori che stanno indagando l'uso della terapia genica virale per promuovere la rigenerazione degli assoni sensoriali.
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Protocollo
Tutte le seguenti procedure di animali sono state condotte in accordo con il Regno Unito Animali (procedure scientifiche) Act 1986. Se familiarità con queste procedure, si prega di verificare con le normative locali / nazionali e consultare un veterinario prima di iniziare il protocollo.
1. La scelta di uno Strain Adatto degli animali
NOTA: Una radice dorsale risultati lesione da schiacciamento nella perdita di sensibilità e zampa deafferentazione. effetti avversi più comuni di zampa anteriore deafferentazione possono includere over-governare, automutilazione, e zampa autotomia.
- Ottenere gli animali per la procedura.
NOTA: per ratti, i ceppi più attivi, come Lister-incappucciato e Wistar, hanno una maggiore incidenza di zampa autotomia dopo deafferentazione rispetto ai ceppi più docile, come Lewis e Sprague-Dawley. Se possibile, il ceppo più docile, Lewis, dovrebbe sempre essere presa in considerazione prima. Dovrebbe essere necessario per l'esperimento un ceppo particolarmente attivo dovuta al m geneticaODIFICA o requisiti specifici di valutazione del comportamento, cure veterinarie devono essere in atto per affrontare gli effetti negativi previsti.
2. Preparazione del virus per iniezione
ATTENZIONE: Maneggiare tutti i virus in conformità alle normative di sicurezza biologica e di laboratorio.
- Diluire o concentrare il virus ad un titolo di 2 x 10 copia 12 genoma (GC) / mL seguendo protocolli di confezionamento individuale dei virus 9.
NOTA: Qui, il virus è stato diluito in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS) con il 5% di saccarosio. Il titolo può essere ottimizzato a seconda del tipo di virus, promoter, costruire dimensioni, e mirata tipo di cellula. - Opzionale: Aggiungere 1% colorante (ad esempio, Fast Verde) per la soluzione di virus per una facile visualizzazione della iniezione in seguito. Mescolare la soluzione molto delicatamente.
- Conservare la soluzione in ghiaccio per uso immediato (entro 4 ore) o in un congelatore C -80 ° per lungoconservazione a lungo termine.
3. Esecuzione della preoperatoria Preparazione del Animal
NOTA: A causa della estrema invasività della chirurgia, le tecniche di asepsi in ogni momento.
- Preparare e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e il telaio stereotassico vertebrale prima di iniziare l'intervento chirurgico. Ad esempio, sterilizzare gli strumenti in autoclave a 134 ° C. Utilizzare una nuova serie di strumenti sterilizzati per ogni animale.
- Anestetizzare l'animale. Confermare il corretto anestesia pizzicando la zampa per verificare il riflesso di ritiro o toccando la cornea per il riflesso palpebrale.
- Per ratti adulti utilizzando anestesia per inalazione come isoflurano, utilizzare 4% isoflurano in 2,0 L / min di ossigeno per l'induzione. Per la manutenzione durante l'intervento chirurgico, utilizzare 2 - 3% isoflurano in 1,5 L / min di ossigeno, variando la concentrazione di isoflurano secondo il modello di respirazione dell'animale per evitare dosaggio sotto-sovra o.
- SopraCE L'animale viene anestetizzato inizialmente, registrare il peso preoperatorio dell'animale.
- Per l'iniezione DRG cervicale, radere il pelo sul collo di tra le orecchie per appena distale al scapole. Disinfettare la zona rasata con un prodotto antisettico.
- Iniettare 2 ml di soluzione salina per via sottocutanea sul fianco dell'animale, insieme con una dose adeguata di analgesico (es, 5 mg / kg carprofen) e antibiotici (ad esempio, 5 mg / kg enrofloxacina).
- Applicare una pomata occhio ad entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione della cornea durante la procedura.
- Procedere alla chirurgia su un telaio stereotassico vertebrale con un cuscinetto riscaldante a 37 ° C posto sotto l'animale.
4. Iniezione DRG ed esecuzione di un Crush Injury radice dorsale
NOTA: Si tratta di un intervento chirurgico estremamente delicato. Si consiglia di pratica su alcuni animali morti prima di familiarizzare con l'anatomia prima di avanzare a vivere la chirurgia degli animali.
- LOcate prominenti processi spinosi C2 e T2 sulla pelle. Fare un'incisione cutanea tra le C2 e T2 processi spinosi con una lama di bisturi n.10 (una volta che la pelle è aperto, una linea mediana bianco, fibroso-tessuto deve essere visibile sul primo strato del muscolo, il primo strato di muscolo ha un " gelatinoso" texture).
- Eseguire un'incisione di dimensioni simili sul primo strato del muscolo lungo la linea mediana bianco utilizzando un bisturi. Non andare al di là del processo spinoso T2 di primo piano, in quanto v'è un ramo arterioso importante dal aorta discendente trova lì vicino.
NOTA: sanguinamento pesante può verificarsi ovunque da questo punto in poi. interrompere sempre l'emorragia e rimuovere il sangue utilizzando cotton fioc sterili o spugne riassorbibili chirurgici per permettere la visualizzazione chiara in ogni momento. Procedendo con la procedura "alla cieca" può causare danni indesiderati al midollo spinale, DRG, o delle radici dorsali, portando ad effetti avversi inattesi nell'animale in seguito. - ritrarre laprimo strato di muscolo usando due divaricatori poste una rostralmente e uno caudalmente; il secondo strato di muscolo, con un aspetto striato, dovrebbe essere visibile.
- Individuare la linea mediana del secondo strato di muscolo (dove si possono osservare due muscoli longitudinali collegati da un sottile tessuto, membranosa). Sezionare il tessuto membranoso utilizzando una coppia di microscissors per separare i due muscoli longitudinali. Evitare l'uso di una lama di bisturi, se possibile, in quanto ciò potrebbe causare danni muscolari inutili e sanguinamento.
- Regolare i divaricatori di conseguenza per esporre il terzo strato di muscolo sottile che copre la colonna vertebrale. I processi spinosi può essere sentito toccando leggermente con un paio di pinze sul terzo strato di muscolo.
- Fare una piccola incisione sul terzo strato di muscolo utilizzando microscissors e delicatamente raschiare il muscolo dall'osso utilizzando una curette o di bisturi in maniera sideway per esporre chiaramente le vertebre. Se necessario, tagliare alcuni dei muscoli o tendini via per fare la laminectomy più facile.
- Per esporre la C5 sinistra - DRG C8, eseguire un fianco emi-laminectomia sul C4 - vertebre T1 rimuovendo accuratamente parte della lamina e peduncolo utilizzando una coppia di Rongeurs sottili. DRG si trova vicino forame trasversali delle vertebre.
NOTA: C3 - C7 vertebre non hanno un processo spinoso di primo piano. C5 DRG si trova tra C4 e C5 vertebre, C6 DRG è tra C5 e C6 vertebre, e così via, mentre il C8 DRG è tra C7 e T1 vertebre. Non v'è alcun vertebra C8, nonostante la presenza di un DRG C8 e un segmento del midollo spinale C8. - Una volta abbastanza del DRG è stato esposto per l'iniezione, di preparare la siringa mettendo la siringa microlitro virus-riempita dotata di una, l'ago 33-gauge smussato su misura sul supporto della siringa stereotassica. Prima dell'iniezione, utilizzare un ago smussato 30 gauge per effettuare una piccola apertura superficiale su ciascuno dei DRG mirata per assistere con l'inserimento dell'ago iniezione.
- Inserire il 33-gauge ago nel centro della DRG ruotando delicatamente la manopole per regolare le coordinate stereotassica. Non over-inserire l'ago, in quanto ciò potrebbe causare fluido fuoriuscire dalla parte ventrale del DRG. Caso di perdite, regolare la posizione dell'ago immediatamente.
NOTA: Le coordinate stereotassica numerici non sono utilizzati; Tuttavia, è utile utilizzare il telaio per mantenere l'ago per l'iniezione. - Iniettare 1 ml di virus in ciascun DRG a 0,2 ml / min utilizzando una pompa per infusione a siringa. Attendere per altri tre minuti prima di estrarre l'ago. Durante l'iniezione, il DRG cambierà lentamente colore se la soluzione virus contiene un colorante.
- Per eseguire un concomitante C5 - C8 lesioni spinali schiacciare, schiacciare ogni radice tre volte per 10 s ciascuno utilizzando una coppia di pinze a punta fine (Bonn Micro), opposte estremità delle pinze totalmente; una linea bianca nel tessuto dovrebbe comparire nel sito cotta. Non andare più a fondo richiesto con la forceps, poiché ciò può causare danni alla radice ventrale.
- Dopo l'iniezione e / o schiacciare, assicurarsi che non v'è alcun sanguinamento o piccoli pezzi di frammenti ossei lasciati al sito di incisione prima di chiudere l'animale. Se preferito, inserire un piccolo pezzo di spugna chirurgica assorbibile in cima al midollo spinale esposto e DRG.
- Lasciare che il terzo strato di muscolo per ritrarre di nuovo, naturalmente, sulla colonna vertebrale, senza sutura. Liberamente sutura i due muscoli longitudinali sul secondo strato (≈ 3 interrotti suture) con assorbibile materiale 6-0 sutura. Suturare il primo strato di muscolo (≈ 5 interrotto suture) con assorbibile materiale 6-0 sutura.
- Suturare la pelle con assorbibile 5-0 materiale di sutura (≈ 10 interrotto suture).
NOTA: Assicurarsi che i punti di sutura non siano troppo strette. Rigonfiamento della pelle è un segno di un eccesso di serraggio e può causare disagio per l'animale. - Se l'emorragia pesante verificato durante l'intervento chirurgico, sottocutanea iniettare 1 - 2mL di soluzione fisiologica per ricostituire la perdita di liquido dall'animale come consentito dalla normativa locale.
- Fornire gel idratante commestibile e permettere all'animale di riprendersi completamente dall'anestesia, eseguendo un controllo regolare per almeno 1 ora prima di ritornare l'animale ritorna alla zona di attesa.
- Mantenere l'animale per almeno 3 settimane per l'espressione del transgene ottimale per valutare la rigenerazione degli assoni sensoriali.
5. Esecuzione di assistenza post-operatoria del Animal
- Fornire poltiglia cibo e biancheria da letto di cotone morbido per l'animale durante la prima settimana post-operatorio. Se necessario, somministrare dosi addizionali di analgesici e antibiotici per aiutare con il recupero in conformità con le norme locali / nazionali e consigli veterinaria.
- Rimuovere i punti di sutura sulla pelle dopo 7 - 10 giorni.
NOTA: effetti avversi più comuni della chirurgia includono la formazione di sieroma o un ematoma al sito di incisione, graffio segni sulla pelle a causa del prurito causato dale suture assorbibili interni, deficit sensoriali o locomozione sottili, e segni di automutilazione sulla zampa deafferented dopo la lesione da schiacciamento delle radici dorsali. Per eventuali problemi di benessere che sono sostanzialmente più grave del previsto, consultare veterinaria immediato.
6. Esecuzione di un'iniezione anterograda CTB per assonale Tracing
NOTA: Si raccomanda di eseguire tossina colerica B subunità (CTB) assonale tracciando una settimana prima della raccolta del tessuto.
- Preparare 1% soluzione CTB come da istruzioni del produttore.
- Opzionale: Aggiungere colorante 1% alla soluzione per una facile visualizzazione della iniezione in seguito. Mescolare la soluzione molto delicatamente.
- Anestetizzare l'animale (vedere fase 3.2.1) e stabilizzare la zampa anteriore sinistra di nastratura l'arto al tavolo.
- Manualmente e iniettare lentamente 1 ml di 1% CTB per via sottocutanea al centro della zampa glabro e quattro cifre utilizzando una connessione Wi microlitro siringa graduataTh A, 33-gauge ago corto su misura.
NOTA: Prima dell'iniezione, aiuta a usare prima un ago smussato da 30 gauge per fare una piccola apertura superficiale sulla pelle, che assiste con l'inserimento dell'ago iniezione. - Permettere all'animale di riprendersi completamente da anestesia prima di tornare l'animale alla zona di attesa.
7. Raccolta Tissue
- Per raccogliere il DRG virus iniettato e del midollo spinale per immunoistochimica, somministrare una dose eccessiva di anestetico e transcardially profumato l'animale con PBS seguita da freddo 4% paraformaldeide. eseguire con cura un laminectomia completa sulla colonna vertebrale per raccogliere il tessuto fissato al microscopio. Alla predisposizione dei tessuti, sezionamento e lavorazione come richiesto per l'analisi 4, 5, 6.
NOTA: Il sito dell'incisione recuperato dovrebbe essere evidente, come rilevato dalla presenza di stessuto dell'automobile. - In alternativa, per raccogliere il DRG virus iniettato per la coltura in vitro, sacrificare l'animale in modo umano con un metodo approvato, come ad esempio un aumento di concentrazione di anidride carbonica. sezionare accuratamente DRG al microscopio, assicurando condizioni asettiche quando possibile. Procedere con la coltura di tessuti come desiderato 4, 5, 6, 10.
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Risultati
Come una rappresentazione, una sezione trasversale del midollo spinale con DRG allegata viene presentato per mostrare l'efficacia di questo protocollo di trasduzione neuroni DRG e rintracciare assoni sensoriali del midollo spinale quattro settimane dopo l'iniezione di un virus di controllo, AAV5-GFP, direttamente nel C7 DRG senza pregiudizio radice dorsale schiacciamento (Figura 1A). Assoni sia nella colonna dorsale e il corno dorsale del midollo spinale esprimon...
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Discussione
In questo articolo, presentiamo una guida passo-passo per eseguire un'iniezione DRG e lesione da schiacciamento radice dorsale in basso cervicale midollo spinale di ratto adulto. Poiché si tratta di un intervento chirurgico estremamente invasiva e delicata, si consiglia vivamente che tutti i potenziali utenti di ottenere la formazione e la pratica sufficiente prima di avanzare a vivere la chirurgia degli animali. Gli utenti dovrebbero avere familiarità non solo con l'anatomia del midollo spinale, ma anche con i ...
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Dichiarazioni
James Fawcett è un consulente retribuito per Acorda Therapeutics e Novartis.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Christopher and Dana Reeve Foundation, il Medical Research Council, il Consiglio europeo della ricerca ECMneuro, e il Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Vorremmo esprimere la nostra più profonda gratitudine a Heleen Merel van 't Spijker e Justyna Barratt per la loro assistenza tecnica durante le riprese. Vorremmo ringraziare il Dott Elizabeth Moloney e il professor Joost Verhaagen (Netherlands Institute for Neuroscience) per l'assistenza nella produzione di AAV.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Colorante FCF verde veloce | Sigma-Aldrich | F7258 | Per la visualizzazione di soluzioni incolori. Concentrazione consigliata: 1% |
| Subunità B della tossina del colera | Elenco Laboratori biologici | 104 | Per il tracciato assonale anterogrado. Concentrazione consigliata: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Anestetico per inalazione (principio attivo: isoflurano) |
| Baytril 2,5% iniettabile | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (principio attivo: enrofloxacina). Dosaggio raccomandato dal produttore: 10 mg/kg |
| Carprieve 5,0% p/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesico (principio attivo: carprofene). Dosaggio raccomandato dal produttore: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Unguento per gli occhi |
| Olsen-Hegar Portaago | Strumenti per le scienze fini | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Tazza curva da 0,7 mm | Strumenti per le scienze fini | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Pinze | Strumenti per le scienze fini | FST 11083-07 | Per eseguire lo schiacciamento della radice dorsale Forbici |
| la separazione dei tessuti | Strumenti per le scienze fini | FST 14072-10 | |
| Forbici per | le scienze fini | FST 14058-11 | |
| Pinze Micro-Adson Strumenti per | le scienze fini | FST 11018-12 | |
| Divaricatore Goldstein | Strumenti per le scienze fini | FST 17003-03 | |
| Forbici a molla Vannas (dritte) | Strumenti | per le scienze finiFST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Spugna di gelatina assorbibile | Ethicon | 1972 | Per il controllo del sanguinamento |
| Siringa da microlitro RN701 (10 μ L) | Hamilton | 80330 | |
| Ago rimovibile su misura (per iniezione DRG) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, stile di punta 3 |
| Ago rimovibile su misura (per iniezione CTB) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, stile di punta 3 |
| UltraMicroPump con controller SYS-Micro4 | World Precision Instruments | UMP3-1 |
Riferimenti
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