Questo protocollo descrive il confronto in vitro di due funzionalità funzionali chiave di rituximab: indotta da bersaglio e da induzione a dipendenza della citotossicità (CDC). I metodi sono stati impiegati per un confronto tra rituximab di riferimento e biosimilar di rituximab. Questi test possono essere impiegati durante lo sviluppo biosimile o come controllo di qualità nella loro produzione.
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Articolo metodologico
Metodi in vitro per il confronto obiettivo vincolante e CDC induzione Tra terapeutiche Anticorpi: Applicazioni nel Analisi Biosimilarity
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli anticorpi monoclonali terapeutici (mAb) sono rilevanti per il trattamento di diverse patologie, inclusi i tumori. Lo sviluppo di mAb biosimilar da parte delle aziende farmaceutiche è un'opportunità di mercato, ma è anche una strategia per aumentare l'accessibilità dei farmaci e ridurre i costi associati alla terapia. I protocolli qui descritti descrivono la valutazione della binding target e l'induzione del CDC da rituximab nelle cellule Daudi. Queste due funzioni richiedono diverse regioni strutturali dell'anticorpo e sono rilevanti per l'effetto clinico indotto da rituximab. I protocolli permettono il confronto side-by-side di un rituximab di riferimento e un biosimilar di rituximab commercializzato. I prodotti valutati hanno mostrato differenze sia in associazione target e induzione CDC, suggerendo che esistano differenze fisico-chimiche che sottendono e evidenziano la necessità di analizzare l'impatto di tali differenze nell'ambiente clinico. I metodi qui riportati sono semplici e poco costosi in vitro/ Em> modelli per la valutazione dell'attività dei biosimilari rituximab. Così, essi possono essere utili durante lo sviluppo biosimilare, nonché per il controllo della qualità nella produzione biosimilare. Inoltre, i metodi presentati possono essere estrapolati ad altri anticorpi monoclonali terapeutici.
Introduzione
Anticorpi terapeutici sono anticorpi monoclonali ricombinanti (mAbs) sviluppati per il trattamento di diverse patologie, incluso il cancro, autoimmuni e malattie croniche, disturbi neurologici, e altri 1. Attualmente, la FDA ha concesso l'approvazione a più di 40 anticorpi monoclonali terapeutici, e più si prevede di raggiungere il mercato nei prossimi anni.
Rituximab è un anticorpo monoclonale chimerico IgG1 ad alta affinità approvato per il trattamento del linfoma CD20 + cellule B non-Hodgkin (NHL), CD20 + NHL follicolare, leucemia linfatica cronica, e l'artrite reumatoide
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Protocollo
1. Valutazione del legame di target mediante citometria a flusso
- Preparazione di materiali biologici e reagenti
- Realizzare 500 ml di terreno di coltura RPMI integrato con 10% di siero di bovini fetali inattivati termicamente (H-IFBS).
- Cultura Le cellule del linfoma di Daudi Burkitt (Daudi) e le cellule di Daudi GFP + utilizzando RPMI e colaschi di coltura da 75 cm. Mantenere le colture a 37 ° C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO 2 fino a raggiungere 6 - 9 x 10 5 cellule / ml.
- Creare 50 ml di tampone di colorazione diluendo 1/100 H-IFBS in PBS; Questo tampone è stabile....
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Risultati
Usando i protocolli sopra descritti, il binding obiettivo e l'induzione CDC di rituximab di riferimento sono stati confrontati in parallelo con quelli di un rituximab biosimilar prodotto e commercialmente disponibile in Asia.
Nelle cellule di Daudi, entrambi i mAb hanno legato CD20 in modo dipendente dalla concentrazione ( Figura 1D ). Le regressioni non lineari dei dati di legame hanno mostrato una r
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Discussione
La scadenza brevettuale di un mAb terapeutico sta promuovendo lo sviluppo di biosimilari. Pertanto, vi è la necessità di metodi semplici che possono identificare le differenze nelle attività clinicamente rilevanti di questi prodotti. Le cellule colture CD20 + sono state impiegate per la valutazione di due funzioni funzionali chiave di rituximab: binding target e induzione CDC. L'attività precedente richiede il riconoscimento di CD20 dalla regione Fab della mAb, mentre quest'ultima dipende principalmen.......
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Dichiarazioni
N. Salinas-Jazmín, E. González-González, e SM Pérez-Tapia sono dipendenti di Udibi, che esegue studi biosimilarity per diverse aziende farmaceutiche.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno riconoscimenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modificare la coltura a seconda della linea cellulare |
| Soluzione di Trypan Blue | Sigma | T8154 | 0,4%, liquido, filtrato sterile, adatto per la coltura cellulare |
| Cellule di linfoma di Daudi Burkitt ATCC | CCL-213 | È possibile modificare la linea cellulare a seconda dell'anticorpo di interesse | |
| Siero fetale bovino (FBS) | GIBCO | 16000-044 | È possibile modificare la fonte del siero a seconda delle esigenze della linea cellulare |
| Siero umano normale Complemento | Quidel | A113 | È quindi appropriato per l'uso in esperimenti di biocompatibilità, tra cui lo sviluppo di farmaci, l'analisi di biomateriali e altre applicazioni |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | È possibile utilizzare un'ampia gamma di opzioni di colore, compatibili con la maggior parte delle configurazioni di strumenti per analizzare la vitalità. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Cambia fluorocromo a seconda del filtro e del laser del tuo citometro a flusso Controllo dell'isotipo |
| delle IgG umane | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Cambia a seconda del mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Tampone di fissazione per citometria a flusso (1 - 4% formaldeide o paraformaldeide ) |
| PBS pH 7,4 10x (tampone fosfato soluzione fisiologica) | GIBCO | 70011-044 | Tampone fosfato senza Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] e privo di endotossine. |
| Piastre per colture cellulari 96 pozzetti, fondo a V | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm provette a fondo tondo o piastre per microtitolazione a 96 pozzetti con fondo a V o U |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Prodotto di riferimento |
| Rituximab | indiano | — | Prodotto biosimilare |
| Provette da centrifuga coniche da 15 o 50 ml | Corning | 430290 o 430052 | — |
| Puntali per pipette | Eppendorf | — | Sono necessarie più configurazioni di volume |
| Pipette | Eppendorf | — | Sono necessarie pipette a volume regolabile |
| Centrifuga 5430/ 5430R modello | Eppendorf | — | Centrifuga refrigerata a velocità variabile (da 4 a 25 ° C) con velocità da 10 a 30.130 &volte; g |
| Citometro a flusso | BD Dickinson | — | BD FACSAria III o altro citometro a flusso |
| Microscopio ottico e ottico Olympus | Olympus | — | Quantificare e valutare la crescita cellulare |
| Incubatrice | SANYO | — | Incubatore per controllo di temperatura e CO2 per la coltura di cellule |
| cabina di sicurezza biologica | CHC BIOLUS | ® | Armadio di sicurezza biologica che viene utilizzato per proteggere il ricercatore, il prodotto e l'ambiente. |
Riferimenti
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a P....
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Ristampe e permessi
