Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

Summary

Qui, descriviamo un protocollo rapido e flessibile per la formazione di sferoidi cellulari 3D attraverso l'aggregazione cellulare. Questo è facilmente adattabile a più tipi di cellule ed è adatto per l'uso in una varietà di applicazioni, tra cui la migrazione cellulare, l'invasione o i saggi anoikis e per l'imaging e la quantificazione delle interazioni cellula-matrice.

Abstract

Coltura cellulare monostrato non adeguato a modellare il comportamento in vivo dei tessuti, che comporta complesse interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Tridimensionali tecniche di coltura (3D) delle cellule sono una recente innovazione sviluppata per colmare le lacune di coltura cellulare aderente. Mentre sono state sviluppate diverse tecniche per generare analoghi tessuti in vitro, questi metodi spesso sono complesse, costose da stabilire, richiedono attrezzature specializzate, e sono generalmente limitate dalla compatibilità con solo alcuni tipi di cellule. Qui, descriviamo un protocollo rapida e flessibile per aggregare cellule in sferoidi 3D multicellulari di taglia costante che è compatibile con la crescita di una varietà di tumori e linee cellulari normali. Utilizziamo diverse concentrazioni di siero e metil cellulosa (MC) promuovere ancoraggio-indipendente generazione sferoide e prevenire la formazione di monostrati di cellule in un modo altamente riproducibile. Condizioni ottimali per indivlinee cellulari idual possono essere realizzati regolando MC o concentrazioni sieriche nel mezzo formazione sferoide. Gli sferoidi 3D generati possono essere raccolti per l'uso in una vasta gamma di applicazioni, tra cui segnalazione cellulare o studi di espressione genica, screening di farmaci candidati, o nello studio dei processi cellulari, come l'invasione delle cellule tumorali e la migrazione. Il protocollo è anche facilmente adattato per generare sferoidi clonali da singole cellule, e può essere adattato per valutare crescita ancoraggio-indipendente e anoikis-resistenza. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un metodo facilmente modificabile per generare e utilizzare sferoidi cellulari 3D per ricapitolare microambiente 3D dei tessuti e modellare la crescita in vivo di cellule normali e tumorali.

Introduction

Biologicamente rilevanti valutazione del comportamento delle cellule tumorali è impegnativo utilizzando tradizionali bidimensionali (2D) metodologie di coltura cellulare, in parte perché questi non riflettono adeguatamente il microambiente delle cellule presenti in vivo. Approcci alternativi comprendenti componenti della matrice extracellulare nella cultura (ad esempio, Boyden saggi da camera) sono fisiologicamente più rappresentativi dell'ambiente tessuti in vivo. Tuttavia, possono essere limitati a valutazione del comportamento singola cella, e non ricapitolano complesso in combinazioni vivo di cellula-matrice e cellula-cellula interazioni che contribuiscono al tessuto o tumore crescita ^{1, 2, 3.}

L'uso di sferoidi multicellulari è un approccio recente che riproduce più accuratamente l'architettura compatta nella crescita cellulare vivo ^1,4. Sferoidi possono essere usati per studiare le interazioni cellula-matrice di cellule normali, ma può anche agire come analoghi tumorali per modellare caratteristiche della progressione tumorale, come la crescita metastatica o resistenza ai farmaci ^4.

Sferoidi possono essere formati dalla proliferazione di cellule singole annegate in una matrice ^5, o più rapidamente, promuovendo l'aggregazione di più celle per formare un unico cluster cellulare (per esempio, appendere goccia, metodi centrifugazione) ^{6, 7.} Esistenti tecniche di aggregazione delle cellule possono richiedere materiali costosi o di attrezzature specializzate. Inoltre, questi sferoidi hanno una vasta gamma di dimensioni e morfologie e possono essere difficili da produrre in grandi quantità, fare confronti tra le condizioni di crescita o trattamenti difficili. Infine, sferoidi generati da questi metodi possono essere difficile isolare dal extracel proteinicomatrice lular in cui sono incorporati da utilizzare in altre applicazioni.

Qui, descriviamo una metodologia di aggregazione cellulare robusto e facilmente modificabile per la rapida formazione di sferoidi di cellule di dimensioni sempre utilizzando disponibili in commercio piastre di celle-repellente U-basso e una matrice di adesione di promozione inerte, metilcellulosa. Una volta formati, questi sferoidi multicellulari sono facilmente isolati per uso in una vasta gamma di applicazioni. Il protocollo è anche facilmente adattato per generare sferoidi attraverso la proliferazione cellulare, che può essere utilizzato per valutare altri processi cellulari. Qui, dimostriamo saggi di invasione delle cellule, quantificati da immunofluorescenza, e un saggio anoikis, a titolo di esempio le applicazioni di queste due differenti protocolli di formazione sferoide.

Protocol

NOTA: Tutti i reagenti e materiali di consumo sono elencati nella Lista dei materiali.

1. Produzione Spheroid da Cell aggregazione

1. Soluzione metil cellulosa: Preparare 100 ml di 100 mg / mL metil cellulosa.
   1. Calore 50 mL ultrapura H ₂ O a 80 ° C. Aggiungere 10 g di polvere di cellulosa di metile e agitare fino a quando le particelle sono uniformemente disperse.
   2. Portare a volume finale con ultrapura freddo H ₂ O e mescolare a 4 ° C fino a quando la soluzione diventa chiara, paglia di colore, e non contiene solidi visibili.
   3. Passare attraverso un filtro da 0,45 micron per rimuovere i solidi non disciolti. soluzione preparata possono essere aliquotato e conservato a 4 ° C fino a 12 mesi.
      NOTA: Metil cellulosa funge non citotossica, inerte, agente di sospensione per migliorare l'adesione cellula-cellula e scoraggiare la formazione di un monostrato di cellule aderenti. Metil cellulosa è solubile in acqua e può essere lavato via dopo sphergenerazione OID.
2. Media formazione Spheroid
   NOTA: Preparare medio formazione sferoide immediatamente prima dell'uso. Non conservare.
   1. Diluire soluzione metil cellulosa a 1-5 mg / ml nel terreno di coltura appropriato.
   2. Passare attraverso un filtro 0,22 micron per sterilizzare e rimuovere i solidi non disciolti.
3. Tampone fosfato Dulbecco (PBS)
   1. Diluire a 1x e passare attraverso un filtro da 0,45 micron prima dell'uso. soluzione preparata può essere conservata indefinitamente a temperatura ambiente.
4. Produzione di celle sferoide (Figura 1)
   NOTA: Preparare tutti i reagenti in anticipo. È importante evitare la contaminazione delle soluzioni da polvere, fibre o altre particelle insolubili. La presenza di questi contaminanti avrà effetti negativi sulla formazione sferoide. Terreno di coltura e altre soluzioni devono essere fatti passare attraverso un filtro da 0.45 micron per rimuovere queste particelle quando posbile. Evitare l'uso di pipette di cotone filtrata durante il trasferimento di soluzioni come queste possono introdurre fibre supplementari.
   1. monostrati cellulari Cultura al 70% di confluenza nella cultura appropriata medio supplementato con 10% di siero. Aspirare terreno di coltura e risciacquare con PBS 1x per rimuovere i detriti. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA (0,05% tripsina) di tampone di dissociazione a 10 cm piatto di coltura cellulare, e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO _2.
   2. Ispezionare le cellule al microscopio a 10X di ingrandimento per confermare il distacco. Neutralizzare tampone di dissociazione con 7 ml di terreno di coltura di siero-integrato.
   3. sospensione cellulare centrifugare a 500 xg per 10 min per le cellule delicatamente pellet.
   4. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di media formazione sferoide con una pipetta P1000 con una punta di filtro.
      NOTA: La sospensione cellulare deve essere priva di grumi.
      1. Per triturare pellet cellulare, premere la punta della pipetta contro la parte inferiore del tubo con una leggera angolazione, mentrepipettaggio al taglio pellet cellulare. Evitare di triturazione più di 3 - 5 volte come questo può danneggiare le cellule. Pipetta lentamente e non espellere tutto il contenuto della punta della pipetta per evitare di creare bolle.
   5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare per 1 x 10 ⁴ cellule / ml.
      NOTA: Il numero di cellule può essere ottimizzato per generare sferoidi di varie dimensioni. Trypan blu colorazione delle cellule danneggiate può essere utilizzato per confermare la vitalità delle cellule risospese.
   6. sospensione cellulare Trasferire in un serbatoio multicanale pipetta senza polvere sterili e utilizzare puntali con filtro per erogare 100 ml in ciascun pozzetto di una ben 96 piastra di cella-repellente U-bottom.
      1. Serbatoio di risciacquo con filtrata ultrapura H ₂ O per rimuovere la polvere e le fibre.
      2. Mescolare la sospensione cellulare periodicamente mentre semina per impedire alle cellule di depositarsi sul fondo del serbatoio. Per evitare di creare bolle, utilizzare una tecnica di pipettaggio inverso durante la miscelazione e dispensing.
   7. Piastre di trasferimento di coltura tissutale incubatore (37 ° C e 5% di CO ₂₎ e ispezionare tutti i giorni per la formazione sferoide. Le cellule devono depositarsi sul fondo di ciascun pozzetto entro 6 ore e generalmente aggregarsi in uno sferoide entro 24-48 h (Figura 2).
   8. Per la conferma della formazione sferoide successo, utilizzare una punta di p10 e delicatamente pipetta medie sopra la sferoide osservando al microscopio a 10X di ingrandimento. Correttamente sferoidi formate qualsiasi allentamento dalla piastra and roll, confermando la loro struttura 3D.
      NOTA: metilcellulosa e le concentrazioni sieriche devono essere determinati per titolazione per ciascuna linea cellulare di cedere la formazione di un singolo sferoide per pozzetto. Condizioni ottimizzati in questo modo per linee cellulari selezionate sono mostrate in Tabella 1, ed esempi di sferoidi formate in Figura 2B. Sferoidi possono essere coltivate per più di indicata, ma man mano che diventano più grandi crescono progressivamente più difficileper gestire senza frammentazione. Se le cellule formano un monostrato, sferoidi satellitari, o non riescono a depositarsi sul fondo del pozzo, la concentrazione di metilcellulosa e siero può essere ulteriormente regolata per la formazione sferoide ottimale (Figura 3B). Non utilizzare sferoidi contenenti contaminanti quali fibre o polveri (figura 3A). sferoidi preformate possono essere trattati con composti di interesse, come fattori di crescita, le macchie di cellule vive, o inibitori per l'analisi.

2. Spheroid Invasion Assay (figura 4)

1. collagene neutralizzato
   1. Raffreddare tutti i liquidi a 4 ° C e mantenere in ghiaccio quando si lavora con collagene per prevenire la polimerizzazione indesiderata.
   2. Preparare freschi 0,1 M e 0,01 M soluzioni di NaOH e fresco 0.1 M HCl in ultrapura H ₂ O. Passo tutte le soluzioni attraverso 0,22 micron filtri.
   3. Mescolare tipo bovino 1 del collagene (3,1 mg / ml di), 0,01 M NaOH e 10x PBS (8: 1: 1 rapporto in volume) e regolare a pH 7,4 utilizzando freddo 0,1 M NaOH e HCl. La concentrazione finale di collagene è 2,5 mg / mL.
   4. Preparare abbastanza collagene neutralizzato per riempire il recipiente di imaging ad una profondità di 2-3 mm. è richiesto un minimo di 100 microlitri per ciascun pozzetto della 8 pozzetti di coltura tissutale vetrino da camera riportate nella tabella MATERIALI List.
2. Incorporare sferoidi in collagene (figura 4)
   1. Rivestire il fondo di ciascun pozzetto di una slitta 8 pozzetti camera di coltura tissutale con un minimo di 50 microlitri collagene neutralizzato.
      1. Usare la tecnica di pipettaggio inverso per evitare di creare bolle nel collagene. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere il collagene in modo uniforme su tutta la superficie bene.
         NOTA: Questo strato di base di collagene terrà sferoidi in sospensione ed è di solito di spessore 1-2 mm. Lo strato di base minimizza la formazione di un menisco sullo strato superiore collagene. Se lo strato di base è troppo sottile, sferoidi possono entrare in contatto con il fondo della slitta da camera eformare un monostrato di cellule.
   2. Posizionare il vetrino da camera, e da 35 mm piatto di coltura di tessuti pieno di ultrapura H ₂ O, in un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti. Incubare a 37 ° C fino a quando il collagene viene polimerizzato, tipicamente 1 h. Conservare rimanendo neutralizzato collagene sul ghiaccio.
      NOTA: Il 35 millimetri piatto pieno d'acqua fornirà l'umidità e prevenire l'essiccazione. La diapositiva camera deve rimanere in questa camera di umidità durante tutta la seduta. Lo strato di base di collagene può essere lasciato a polimerizzare durante la notte. incubazioni più lunghe provocano tipicamente un gel più rigida.
   3. Utilizzando una punta di filtro P 1.000, raccogliere sferoidi preformate (step 1.4.7) dalla piastra cellulare repellente 96 pozzetti U-bottom in 1,5 ml scatto top tubi. Pipetta lentamente ed evitare ripetuti o pipettaggio vigorosa per ridurre al minimo fluido taglio di sferoidi. sferoidi multiple possono essere raggruppati in un unico tubo per il trasferimento di un bene del 8 pozzetti di coltura tissutale vetrino da camera.
   4. Centrifugare sferoidi raccolti in un tablETOP microcentrifuga a 2.000 xg per 2-5 s e rimuovere il surnatante con una pipetta p200. Evitare di centrifugazione più a lungo del necessario, in quanto ciò potrebbe causare sferoidi a rompere a pezzi o ciuffo insieme.
      NOTA: dopo aver pipettato via la maggior parte del surnatante, il tubo può essere invertita con cura su un tovagliolo di carta pulito per allontanare il liquido in eccesso. Non permettere sferoidi ad asciugare.
   5. Utilizzando una punta larga foro P200, risospendere delicatamente sferoidi in 50 microlitri di collagene neutralizzati. Fate questo per ogni tubo di sferoidi raccolti prima che sferoidi vengono trasferiti nella diapositiva camera. Mantenere sferoidi che sono state risospese in collagene neutralizzato in ghiaccio fino al momento per il trasferimento di diapositive da camera.
   6. Rimuovere scorrevole della camera da incubatore e pipetta accuratamente la miscela di sferoide-collagene in cima strato di base di collagene. Incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ fino collagene è polimerizzato.
      1. Non somministrare l'intero contenuto della pipetta per evitare di creare bolle. DropwISE pipettaggio riduce le possibilità di disturbare lo strato di base di collagene.
   7. Lentamente aggiungere un minimo di 100 microlitri riscaldato terreno di coltura contenente chemoattractants desiderati, inibitori o altri trattamenti per ogni pozzetto del vetrino camera. I contenenti sferoidi strato di collagene possono strappare se il liquido viene pipettato su di esso troppo energicamente. Terreno di coltura può essere erogato lentamente lungo il lato di un pozzo per non disturbare il collagene.
   8. Incubare vetrino camera a 37 ° C e 5% CO ₂ per consentire l'invasione delle cellule. Cellulare invasione nella collagene circostante può essere osservato brightfield o fluorescenza imaging e quantificato da una varietà di metodi che utilizzano epifluorescenza, confocale microscopia foglio leggero.

3. Quantificazione di Invasion: Campo luminoso

1. A intervalli di tempo prestabiliti, sferoidi immagine collagene-embedded ingrandimento 10x utilizzando un microscopio campo chiaro (fase 2.2.8).
   NOTA: peresperimenti live-cella a lungo termine, una fase di microscopio riscaldata e di CO ₂ da camera regolamentati possono essere utilizzati per mantenere sferoidi a 37 ° C e 5% di CO ₂ durante l'imaging.
2. Quantificare invasività utilizzando software come ImageJ per misurare il numero di cellule che invadono nel collagene circostante e la distanza media invasa in ogni punto.

4. Quantificazione di Invasion: microscopia a fluorescenza con Live cellulare Stain

1. Seguendo passo 2.2.8, integra il supporto nelle diapositive da camera con una macchia fluorescente, come DAPI, calceina AM, o altro composto di cellule-tracking appropriato alla linea cellulare secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Per la quantificazione di invasività, colorazione omogenea in tutto lo sferoide non è essenziale. Per applicazioni che richiedono una penetrazione più profonda di macchia, incubazione più lungo (> 3 ore), può essere necessario.
2. Rimuovere la macchia e sostituire con 500 microlitri di caldo PBS 1x. Incubate a 37 ° C per 10 minuti per rimuovere l'eccesso macchia. Ripetere almeno due volte.
3. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, acquisire sezioni ottiche attraverso sferoidi invasori.
   NOTA: un'esposizione prolungata alla luce del laser deve essere ridotto al minimo durante l'imaging ripetitivo per limitare fototossicità e photobleaching.
4. Utilizzare software come ImageJ per generare un Z-proiezione, che può essere usato per quantificare la superficie totale dello sferoide, numero di cellule invasori, e distanze invaso nella matrice di collagene.
5. Ad esempio, per quantificare l'invasione, regolare la soglia immagine escludere sfondo, evidenziando solo sferoide e invadere le cellule, e misurare la loro area. L'area dello sferoide originale può essere sottratto da questo totale quantificare invasività.

5. Quantificazione di Invasion: Immunofluorescenza

NOTA: Tutte le soluzioni e tamponi dovrebbero essere passati attraverso un filtro da 0,45 micron prima dell'uso Remove detriti, che possono influenzare negativamente la colorazione.

1. Preparare il tampone di lavaggio PBS ^+. Preparare 1x PBS e aggiungere CaCl ₂ e MgCl ₂ ad una concentrazione finale di 0,1 mM. Non sterilizzare in autoclave buffer dopo CaCl ₂ e MgCl ₂ sono aggiunti. Soluzione può essere sterilizzata per filtrazione e conservati a temperatura ambiente.
2. Preparare neutro buffer di fissazione in formalina tamponata (NBF). Aggiungere 5 gocce di NaOH 1 M a 0,6 g di paraformaldeide. Portare a 20 ml con PBS ⁺ e incubare a 60 ° C fino paraformaldeide viene sciolto (circa 1 h). Raffreddare a temperatura ambiente e aggiustare il pH a 7,4 con 1 M HCl.
   NOTA: tampone fissaggio NBF dovrebbe essere preparata immediatamente prima dell'uso.
3. Preparare albumina sierica bovina (BSA) tampone bloccante. Sciogliere BSA in PBS ⁺ al 3% w / v. Soluzione può essere sterilizzata per filtrazione e conservato a 4 ° C per diversi giorni, ma è meglio preparato fresco. Non riscaldare.
4. Preparare permeabilizzazione buffer. Diluire Triton X-100al 0,2% v / v in PBS ^+.
   NOTA: Permeabilizzazione tampone deve essere preparata immediatamente prima dell'uso.
5. Facoltativamente, preparare Mowiol mezzo di montaggio. Combinare 2,4 g Mowiol, 6 g di glicerolo, e 6 mL ultrapura H ₂ O. miscela per 3 ore in un rotore a temperatura ambiente. Aggiungere 12 mL di 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Incubare con miscelazione a 50 ° C per 10 min.
   1. Centrifugare a 5000 xg per 15 min a pellet materiale insolubile. Aggiungere agente anti-imbianchimento, come ad esempio 2,5% DABCO. Conservare in 500 microlitri aliquote a -20 ° C.
6. Immunofluorescenza di sferoidi (figura 5)
   NOTA: Utilizzare una pipetta per aggiungere o rimuovere lentamente liquidi da slitta da camera. Evitare l'uso di un aspiratore, in quanto ciò può interrompere lo strato di collagene.
   1. Preparare sferoidi e incorporare nelle diapositive da camera di collagene-riempita, come descritto nelle sezioni da 1 a 2.
      NOTA: Il collagene autofluorescenza può essere minimizzato utilizzando strati sottili o piccoli volumi di collagen.
   2. Rimuovere terreno di coltura il più possibile da ciascuna diapositiva camera.
   3. Brevemente risciacquare strato di collagene con 500 microlitri di tampone di lavaggio PBS ⁺ per rimuovere media residua.
   4. Aggiungere 500 microlitri di PBS fresco ⁺ tampone di lavaggio in ogni pozzetto e incubare a 37 ° C per 5 minuti per lavare sferoidi. Ripetere due volte.
   5. Sostituire PBS ⁺ tampone di lavaggio con 500 microlitri di buffer NBF fissazione. Incubare a temperatura ambiente per 20 - 25 min.
   6. Rimuovere buffer di fissaggio NBF e risciacquare con 500 microlitri di tampone di lavaggio PBS ^+. Lavare per 5 minuti con PBS fresco ⁺ tampone di lavaggio da un minimo di 3 volte.
      NOTA: fisso sferoidi possono essere conservati a 4 ° C in PBS fresco ⁺ tampone di lavaggio per diversi giorni. 0,01% di sodio azide può essere aggiunto al tampone di lavaggio per inibire la crescita microbica durante la conservazione.
   7. Sostituire PBS ⁺ lavare tampone con 500 microlitri di buffer permeabilizzazione. Incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
   8. Sostituire tampone permeabilizzazione con 500 microlitri BSA tampone di bloccaggio e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
      1. Facoltativamente, rimuovere BSA tampone bloccante. Utilizzando bisturi o forbici, spheroids accise e la circostante area di 3 millimetri x 3 mm dal livello di collagene. Utilizzando una punta larga foro p1000, rimuovere il blocco asportato del collagene sciacquando delicatamente con tampone BSA blocco fresco. Trasferimento a blocchi di collagene per 1,5 ml di tubo.
      2. Centrifugare a 2.000 xg per 2 minuti e rimuovere il surnatante. Il tubo può essere attentamente invertita su un tovagliolo di carta pulito per allontanare il liquido in eccesso.
   9. Aggiungere l'anticorpo primario sferoidi ed incubare a temperatura ambiente per 1 h. Aggiungere un volume sufficiente di anticorpo primario tale che l'intero strato di collagene è uniformemente sommersa. I passaggi facoltativi sopra (5.6.8.1-5.6.8.2) tipicamente consentono l'utilizzo di piccoli volumi di anticorpi.
   10. Immergere vetrino da camera in un contenitore con almeno 10 ml di PBS ⁺ lavaggio bufFer per 10 minuti per lavare. Ripetere almeno due volte.
       1. Opzionale, se sferoidi sono stati asportati dallo strato di collagene in precedenza (punto 5.6.8.1), aggiungere un minimo di 1 ml di PBS ⁺ tampone di lavaggio al tubo 1,5 ml e agitare delicatamente. Lasciare a bagno per un minimo di 10 min.
       2. Rimuovere il più PBS ⁺ tampone di lavaggio possibile e ripetere il lavaggio con PBS ⁺ tampone di lavaggio da un minimo di due volte. Centrifugare a 2.000 xg per diversi minuti per far sedimentare blocco collagene.
          NOTA: Pulire le superfici esterne del vetrino da camera strofinando con etanolo al 70% prima di immergersi nel tampone di lavaggio.
   11. Ripetere i passaggi 5.6.9-5.6.10 utilizzando appropriato anticorpo secondario.
       NOTA: Se sferoidi sono state colorate direttamente nel vaso di imaging, passare al punto 5.6.13.
   12. Opzionale, se sferoidi sono stati asportati dallo strato di collagene in precedenza (punto 5.6.8.1), pulite vetrini e vetrini microscopia confocale-compatibile con il 70% di etanolo.
       1. Rimuovere il tampone di lavaggio, per quanto possibile dal blocco collagene e risospendere in ultrapura H ₂ O. Eseguire questo passo immediatamente prima del montaggio. Non lasciare i blocchi colorati ammollo in acqua.
       2. Utilizzando pinze fine punta, afferrare bordo del blocco collagene e trasferimento al vetrino.
       3. Utilizzando le pinze per tenere il collagene in luogo, utilizzare un batuffolo di cotone pulito per favorire il liquido in eccesso dal blocco collagene, facendo attenzione a non toccare direttamente il collagene.
          NOTA: se il collagene diventa bloccato al tampone di cotone può essere rimosso con delicatezza o con pinze, o immergendo in acqua.
   13. Usando una tecnica pipettaggio inverso, dispensare 100 microlitri Mowiol mezzo di montaggio sul blocco di collagene e il luogo vetrino sul campione.
       1. Usare un tampone di cotone o un tovagliolo di carta per favorire l'eccesso Mowiol mezzo di montaggio e l'acqua da sotto il vetrino.
       2. Lasciare Mowiol mezzo di montaggio per indurire durante la notte a 4 °C. Seal bordi del coprioggetto con smalto.
   14. Immagine sferoidi macchiati utilizzando confocale o microscopia a fluorescenza per osservare la localizzazione delle proteine di interesse, formazione di strutture invasive, ecc (figure 5B, 5C).
       NOTA: Stained sferoidi devono essere protetti dalla luce per evitare photobleaching.

6. anoikis Assay

NOTA: Il protocollo formazione sferoide si adatta facilmente a quantificare la crescita ancoraggio-indipendente e resistenza anoikis in una varietà di tipi cellulari.

1. Semina cellule per l'analisi anoikis (Figura 6)
   1. Seguire le istruzioni per la produzione sferoide nella sezione 1.4, ma usare un minimo di 30 mg / mL metil cellulosa per la preparazione di media formazione sferoide.
      NOTA: Quando riscaldato, 30 mg / mL metilcellulosa dovrebbe produrre un gel denso che contiene cellule in sospensione.
   2. Incubare le cellule per diversi giorni o settimane e inspetto regolarmente a 10X di ingrandimento utilizzando un microscopio. Le cellule che resistono anoikis dovrebbero proliferare e formare colonie.
   3. Quantificare anoikis misurando il numero e le dimensioni delle colonie formate in ciascun pozzetto.
      NOTA: Una volta formati colonie, possono essere lavati per rimuovere la metilcellulosa e utilizzati per saggi sferoidali basato, come descritto.

Results

Descriviamo un metodo flessibile ed efficace per generare sferoidi discreti utilizzando piastre di celle-repellenti e mezzi di formazione sferoide integrato con MC. Nelle condizioni appropriate di MC e siero, singole cellule depositano ed aderiscono insieme al centro del pozzo per formare sferoidi con minima aderenza al fondo del pozzetto. Usando questo protocollo, sferoidi sono stati generati da una varietà di linee cellulari (Figura 2B). Titolazione di MC e le concentr...

Discussion

Vi presentiamo un metodo rapido e flessibile per la produzione di sferoidi di cellule 3D per modellare l'architettura dei tessuti in vivo utilizzando reagenti poco costosi e facilmente reperibili. Il nostro protocollo sfrutta le proprietà non citotossiche e adesione di promozione di MC ^{8, 9} per mediare l'aggregazione delle cellule e ridurre al minimo la formazione di monostrato cellulare. Diversamente matrici a base di proteine ​​isolate da font...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffers
10x Soluzione salina tamponata con fosfato	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Soluzione di cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	21114	Utilizzato per tampone di lavaggio PBS+; Non sterilizzare in autoclave il tampone di lavaggio PBS+ con l'aggiunta di cloruro di calcio
Soluzione di cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M1028	Utilizzato per tampone di lavaggio PBS+; Non sterilizzare in autoclave PBS+ tampone di lavaggio con l'aggiunta di cloruro di magnesio
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
>Per formazione di sferoidi
96-well U-bottom Piastra repellente per cellule	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	Per la coltura di linee cellulari SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	Per la coltura di linee cellulari TT
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F1051	Filtro prima dell'uso per rimuovere i contaminanti particolati
Metilcellulosa	Sigma-Aldrich	M7027	Preparare in acqua a 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	Per la coltura di linee cellulari HCT-116, BxPC-3
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	tampone di dissociazione
Nome	>Azienda	Numero di catalogo	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3,1 mg/mL; Mantenere sul ghiaccio quando in uso
DMEM Phenol Red Free Basso Glucosio	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Meno fluorescenza di fondo rispetto al mezzo integrato con rosso fenolo
cellulare gliale derivata Fattore neurotrofico	Peprotech	450-10	Chemioattrattivo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Per microscopia a immunofluorescenza
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	Per il montaggio di sferoidi asportati
Alexa-Fluor 488 Falloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379	Utilizzato per colorare l'actina a 1:200
Albumina sierica bovina	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Utilizzato nel tampone di blocco BSA
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antisbiadimento
	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Utilizzato nel supporto di montaggio MOWIOL
Software ImageJ	Freeware, NIH-Utilizzato		per l'analisi delle immagini
Microslide	VWR International	48312-024	Per il montaggio di sferoidi asportati
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Utilizzato nel mezzo di montaggio MOWIOL
Paraformaldeide	EMD-Millipore	PX0055-3	Utilizzato nel tampone di fissazione
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Utilizzato nel tampone di permeabilizzazione