L'elettroporazione di nuova generazione è un metodo efficiente per trasfettare cellule Th17 umane con piccoli RNA per alterare l'espressione genica e il comportamento cellulare.
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Articolo metodologico
Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
CD4+ Le cellule T possono differenziarsi in diversi sottogruppi di cellule T helper effettrici a seconda dell'ambiente citochinico circostante. Le cellule Th17 possono essere generate da cellule T CD4+ naive in vitro attivandole in presenza delle citochine polarizzanti IL-1β, IL-6, IL-23 e TGFβ. Le cellule Th17 orchestrano l'immunità contro batteri e funghi extracellulari, ma la loro attività aberrante è stata anche associata a diverse malattie autoimmuni e infiammatorie. Le cellule Th17 sono identificate dal recettore delle chemochine CCR6 e definite dal loro fattore di trascrizione principale, RORγt, e dalla citochina effettrice caratteristica, IL-17A. Le condizioni di coltura ottimizzate per la differenziazione delle cellule Th17 facilitano gli studi meccanicistici della biologia delle cellule T umane in un ambiente controllato. Forniscono inoltre un ambiente per lo studio dell'importanza di geni specifici e programmi di espressione genica attraverso l'interferenza dell'RNA o l'introduzione di imitatori o inibitori di microRNA (miRNA). Questo protocollo fornisce un metodo facile da usare, riproducibile e altamente efficiente per la trasfezione transitoria di cellule Th17 umane primarie differenzianti con piccoli RNA utilizzando un dispositivo di elettroporazione di nuova generazione.
Introduzione
Cellule T CD4 + sono orchestrators cruciali della risposta immunitaria adattativa. Naive cellule T CD4 + sono capaci di svilupparsi in diversi cellule T effettrici (es Th1, Th2, Th17, ecc), ciascuno con la propria serie di citochine e fattori di trascrizione caratteristici, a seconda del microambiente locale 1. Le decisioni lignaggio che le cellule T fanno sono fondamentali sia per l'immunità protettiva e la tolleranza per sé. Cellule Th17 sono un sottogruppo di cellule T conosciuti per combattere batteri extracellulari e funghi, ma le loro risposte improprie sono anche implicati nella patogenesi di ....
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Protocollo
Questo protocollo aderisce alle linee guida del UCSF per l'etica della ricerca umana.
1. Preparazione di T coltura cellulare, Isolamento di cellule T CD4 + e Th17 polarizzazione
- Al giorno 0, cappotto 6 pozzetti di coltura tissutale con 1,5 ml per pozzetto di anti-umana CD3 (2 ug / mL) e CD28 anti-umano (4 ug / ml) in PBS con calcio e magnesio per almeno 2 ore a 37 ° C.
- In alternativa, ricoprire le piastre per una notte a 4 ° C. Avvolgere le piastre in parafilm.
- Preparare le cellule mononucleate del sangue del cordone (CBMCs) di densità centrifugazione in gradiente le ....
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Risultati
Il primo passo per lo sviluppo di un sistema affidabile di electroporating successo cellule Th17 umane era di generare robusta in vitro differenziato colture di cellule Th17 umane. Le cellule T coltivate in condizioni Th17 polarizzabili espresso il recettore delle chemochine CCR6 e il fattore di trascrizione RORγt (Figura 1A, sinistra). Questi marcatori non sono stati espressi quando le cellule T sono state coltivate in condizioni non polarizzante (THN) .......
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Discussione
Questo protocollo fornisce un metodo migliorato per la consegna di piccoli RNA in cellule Th17 umane. Sebbene le cellule Th17 umane sono stati usati qui, questo metodo di elettroporazione con piccoli RNA può essere utilizzato con altri sottoinsiemi helper umana primaria T, come Th1, Th2 e Tregs. Esso non funziona bene per le cellule T CD4 + naive quindi le cellule devono essere attivati in coltura prima della trasfezione. Per questo protocollo, abbiamo prima ottimizzato il sistema di coltura in vitro in
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health degli Stati Uniti (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), da un premio della Leukemia & Lymphoma Society (K.M.A.) e dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| anti-umano IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-umano IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S. B3 |
| anti-umano CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| topo anti-umano CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-umano RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-umano CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Colorazione del fattore di trascrizione Set di tamponi | ebioscience | 00-5523-00 | Per la colorazione con citometria a flusso con fattore di trascrizione intracellulare |
| Inibitore del legame Hu FcR Purificato | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Terreno di base senza siero" |
| MACS CD28 grado funzionale puro, | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | : 15E8 |
| anti-umano CD3 Purificato | UCSF nucleo di anticorpi monoclonali | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purificato anti-umano IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-umano IFNg, grado funzionale purificato | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Ricombinante umano IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| IL-1 umana ricombinanteβ | Peprotech | 200-01B | |
| TGF umano ricombinante-β 1 | Peprotech | 100-21C | |
| IL-6 umano ricombinante | Peprotech | 200-06 | |
| Pool di controllo siGENOME, non mirato #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool RORC umano Dharmacon | M-003442-00 | ||
| siGENOME SMARTpool PTPRC umano | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Kit di cellule T CD4 umane intatte | ThermoFisher Scientific | 11346D | CD4+ cellula T umana Kit di isolamento |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Strumento di elettroporazione di nuova generazione |
| Neon Tranfection System 10 μ L Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Tampone di risospensione T | ThermoFisher Scientific | Fornito nel kit (MPK1096) | "Tampone di risospensione per trasfezione" |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | Gradiente di densità Medium |
| costar Piastre trattate per colture tissutali a 6 pozzetti | Piastre | ||
| a fondo piatto Corning 3516costar Piastre trattate per colture tissutali a 48 pozzetti | Piastre a fondo piatto | Corning | 3548 |
| Tampone di lisi BD Pharm Lyse, 10x | BD biosciences | 555899 | Deve preparare 1x soluzione con acqua distillata prima dell'uso |
Riferimenti
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J.
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Ristampe e permessi
