preparazione e In Vitro Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

Terapia genica e cellulare sono strumenti potenti che hanno il potenziale per risolvere le sfide attuali nel trattamento CVD. Nonostante il fatto che entrambi questi approcci sono attualmente in fase di sperimentazione in studi clinici, non sono ancora pronti per una vasta applicazione clinica ^1. In particolare, un approccio comune per affrontare le sfide della terapia genica e cellulare è quello di sviluppare vettori di trasferimento dei geni multifunzionali adatte per l'applicazione clinica. La mancanza di sistemi di lancio gene sicuri ed efficienti è la preoccupazione principale della terapia genica. Allo stesso tempo, l'ingegnerizzazione genetica di prodotti cellulari prima del trapianto potrebbe superare le gravi sfide della terapia cellulare, come la bassa efficienza (trapianto di cellule post-staminali per esempio, nel campo cardiaco, solo ~ 5% di miglioramento funzionale si ottiene ¹ ) e la scarsa ritenzione / attecchimento presso il sito di lesione (ad esempio, la conservazione delle cellule scende sotto i 5 - 10% in pochi minuti a ore Post-applicazione, indipendentemente dalla via di somministrazione ^{2, 3, 4).}

Fino ad oggi, vettori virali superano notevolmente i sistemi non-virali in termini di efficienza, che ha portato nella loro più ampia applicazione negli studi clinici (~ 67%) ^5. Tuttavia, i veicoli virali comportano rischi gravi, come immunogenicità (e la successiva risposta infiammatoria, con gravi complicazioni), oncogenesi e limitazioni nella dimensione del materiale genetico condotto ^6. A causa di questi problemi di sicurezza e gli elevati costi di produzione vettore virale, l'uso di sistemi non virali è preferibile in alcuni casi ^{7, 8.} È particolarmente adatto per i disturbi che richiedono correzione genetica transitoria, come l'espressione dei fattori di crescita che controllano l'angiogenesi (ad esempio, per il trattamento CVD) o delivery di vaccini.

Nel nostro gruppo, un sistema di erogazione creata da combinando ramificato polietilenimmina 25-kDa (PEI) e nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (MNP) legati insieme da interazione biotina-streptavidina ^9. Questo vettore è un potenziale strumento per l'ingegneria genetica di cellule, consentendo loro magnetizzazione simultanea prima del trapianto. Quest'ultimo fornisce una base per magnetico orientamento / ritenzione, che è particolarmente promettente al giorno d'oggi, come tecniche avanzate di targeting magnetici si stanno sviluppando con successo ^10. Inoltre, le risultanti cellule magneticamente sensibili hanno il potenziale di essere non invasivo monitorato da risonanza magnetica (MRI) o immagini di particelle magnetiche ^{11, 12.}

Nel caso del vettore PEI / MNP, poliammina assicura condensazione di acido nucleico e quindi la protezione dal fattore degradanti s, vettore internalizzazione nelle cellule, e endosomali fuga ^5. Il MNPs completano le proprietà di PEI, non solo in termini di orientamento magnetico, ma anche riducendo il noto tossicità PEI ^{7, 13, 14.} In precedenza, PEI / MNP proprietà vettoriali sono stati regolati in termini di efficienza di consegna (cioè, pDNA e miRNA) e sicurezza utilizzando fibroblasti e cellule staminali mesenchimali umane ^{15, 16.}

In questo manoscritto, un protocollo dettagliato sull'applicazione della PEI / MNPs per la generazione di cellule miRNA-modificata viene descritto ^17. Per questo scopo, vengono utilizzate HUVEC e rappresentano un modello stabilito per l'angiogenesi in vitro. Sono impegnativo per trasfettare e sono suscettibili di influenza tossica ^{18, 19,}ass = "xref"> 20. Inoltre, mettiamo a disposizione un algoritmo per valutare tali cellule in vitro, compresa la loro targeting, la comunicazione intercellulare, e la rilevazione risonanza magnetica.

Cordoni ombelicali umani per l'isolamento delle cellule sono stati ottenuti dopo il parto dalla informati, donne sane che hanno dato il loro consenso scritto per l'uso di questo materiale per la ricerca in base alla Dichiarazione di Helsinki. Il comitato etico dell'Università di Rostock ha approvato lo studio presentato (reg. No. Un 2011 06, prolungato 23 settembre, 2013).

1. Preparazione di Transfection Complessi

1. Biotinilazione di polietilenimmina (PEI).
   1. Sciogliere ramificato PEI in acqua ultrapura sotto agitazione magnetica a 300 - 400 rpm per 24 ore a temperatura ambiente (RT) e al riparo dalla luce per ottenere una soluzione 0,18 mM. Conservare la soluzione a 4 ° C.
   2. Misurare la concentrazione di gruppi amminici primari nella soluzione ottenuta ^{21, 22.}
      1. Utilizzare 2% di soluzione di reagente ninidrina come reagente di rilevazione ammina ²³ mescolando 100 ml di prCampione ediluted (1: 200 con acqua ultrapura) e 75 ml di reagente ninidrina. Incubare per 30 minuti a 80 ° C. Raffreddarlo e aggiungere 100 ml di etanolo al 50% per la stabilizzazione. Misurare l'assorbanza a 550 nm su uno spettrofotometro di assorbimento.
      2. Creare una curva standard utilizzando glicina.
         1. Preparare 0,1 M soluzione ammino-N magazzino (0,75 g di glicina in 100 mL di acqua deionizzata) e sue diluizioni, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40 1:80, 1: 100, 1: 200, e 1: 400, 1: 600. Misurare tali soluzioni, come al punto 1.1.2.1 e creare un grafico con la concentrazione e l'assorbanza sugli assi.
         2. Sulla base del plot ottenuto e l'assorbanza misurata della soluzione di PEI, definire la concentrazione dei gruppi alfa-amino in PEI.
            NOTA: Attenzione. soluzione reagente ninidrina deve essere utilizzata esclusivamente sotto il cofano e deve essere conservato in atmosfera di azoto. Non è utilizzabile quando il colore della soluzione cambia a causa di ossidazione.
   3. Sciogliere 100 mg di biotina linker in acqua ultrapura immediatamente prima dell'uso per ottenere una soluzione 0,01 mM. Calcolare la quantità di biotina aggiungere a PEI moltiplicando la concentrazione di gruppi alfa-ammino in PEI (misurata nella fase 1.1.2) per 20 per ottenere la quantità necessaria (in moli) di reagente biotinylating.
      1. Aggiungere la soluzione biotina alla soluzione PEI a pH 8-9 e incubare per 16 ore sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente.
   4. Rimuovere la biotina reagito mediante cromatografia di esclusione molecolare ^23. Utilizzare le colonne disponibili in commercio contenenti un mezzo adeguato gel filtrazione per la purificazione del 25 kDa PEI e seguire le istruzioni del produttore. Prendere aliquote dopo purificazione per misurare la concentrazione di ammina utilizzando un reagente di rilevamento ammina (fase 1.1.2) e determinare l'efficienza biotina coniugazione (fase 1.2.2). Conservare il ottenuta biotinilato PEI a 4 ° C.
2. Caratterezazione di biotinilato PEI.
   1. Determinare la concentrazione di gruppi alfa-ammino in PEI dopo la biotinilazione, come descritto al punto 1.1.2.
   2. Determinare il grado di PEI biotinilazione per verificare la procedura di coniugazione. Per la quantificazione, utilizzare un kit disponibile in commercio, che si basa sull'applicazione di HABA colorante (acido 4'-hydroxyazobenzene-2-carbossilico), per garantire la corretta determinazione colorimetrica dei livelli biotinilazione ^{24, 25.} Seguire le istruzioni fornite dal produttore.
3. Filtrazione di MNPs e loro caratterizzazione.
   1. Filtrata commercialmente disponibile rivestita con streptavidina MNP attraverso un 0,45-micron filtro a siringa a motore ¹⁶ in modo da escludere aggregati tossici più grandi. Misurare la concentrazione di ferro finale utilizzando un saggio standard di ²⁶ fotometrico.
   2. Esaminare la qualità delle MNPs filtrati per la registrazionela curva di magnetizzazione e di imaging TEM secondo protocolli standard ^{27, 28.}
      1. Diluire la sospensione MNP con acqua distillata e collocare 3 ml della sospensione ottenuta su-maglia 300 griglia di rame Formvar carbonio rivestito per l'analisi TEM. Successivamente, collocare questa griglia su un vetrino su una piastra riscaldante e lasciare asciugare.
      2. Analizzare il campione con un microscopio elettronico a trasmissione a 120 kV e verificare il contenuto elementale utilizzando un rivelatore di raggi X ^27.
4. l'etichettatura di 3 colori di complessi trasfezione per la microscopia super-risoluzione.
   1. Etichettare 0,5% dei gruppi amminici primari misurati in PEI con NHS-Ester Atto 488 colorante seguito le istruzioni del produttore. Rimuovere il colorante non legato in eccesso cromatografia di esclusione molecolare, come descritto sopra (punto 1.1.4). Misurare la conseguente concentrazione di gruppi amminici utilizzando un assa ninidrinay (fase 1.1.2).
   2. Etichettare commercialmente disponibile criptato miR (SCR-MIR) con colorante Cyanine5 utilizzando un apposito kit di etichettatura ¹⁵ (indicata nella lista Materials). Misurare la concentrazione risultante fluoroforo-miR spettrofotometricamente.
   3. Appena etichettare MNP ogni volta con colorante biotina-coniugato (ad esempio, atto 565-biotina) a 1: 1.000 w / w rapporto. Applicare direttamente il colorante dopo aver aggiunto la MNP al miR / PEI durante la formazione dei complessi trasfezione, per i dettagli in Delyangina et al. ^16.

2. Preparazione delle cellule

1. l'isolamento HUVEC.
   1. Isolare cellule dal cordone ombelicale subito dopo l'ottenimento delle corde con collagenasi digestione dall'interno della vena ombelicale; seguire un protocollo precedentemente sviluppato ^29.
      1. Incubare ogni cavo con ~ 60 unità / ml di collagenasi di tipo IV soluzione in tampone - caricate in tegli vena ombelicale - a 37 ° C per 13 min.
   2. Per tutti gli esperimenti, in comune le HUVECs da un minimo di 5 pazienti.
      NOTA: La coltivazione non deve superare i 4-5 passaggi. Non utilizzare le cellule contaminate da micoplasma, in quanto questo provoca una diminuzione della efficienza di trasfezione. contaminazione da Mycoplasma dovrebbe essere testato per prima di avviare il protocollo utilizzando un kit PCR per la rivelazione altamente sensibile di micoplasmi.
      1. Test per la presenza micoplasma.
         1. Centrifugare 1 ml di coltura supernatante cellulare per 10 min (13.000 xg). Sospendere il pellet in 17 ml di dH ₂ O e ebollizione (93 ° C) per 3 min. Utilizzare 2 microlitri della sospensione per amplificare la regione di DNA che codifica per RNA ribosomiale altamente conservati (16S-rRNA) di varie specie di micoplasma.
         2. Eseguire la PCR con 10 pmol di ciascun primer (primer forward: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; primer inverso: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') a pettineination con un kit commerciale PCR nelle seguenti condizioni: 94 ° C per 3 min; 45 cicli di 94 ° C per 30 s, 50 ° C per 30 s, e 72 ° C per 30 s; e un'estensione finale a 72 ° C per 10 min.
         3. Analizzare il prodotto di PCR (292 bp) utilizzando agarosio gel elettroforesi.
   3. O conservare le cellule ottenute lungo termine in azoto o coltura liquida nel mezzo di crescita endoteliale supplementato con 100 U / ml di penicillina e 100 pg / ml di streptomicina a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO _2.
2. HUVEC caratterizzazione.
   1. Caratterizzare HUVEC isolate in termini della loro capacità funzionale di costruire tubi nella matrice membrana basale (ad esempio, matrigel) e la loro espressione del CD31 marcatore endoteliale (piastrine endoteliali molecola di adesione delle cellule, PECAM-1) seguendo protocolli standard ^{30, 3}1.

3. trasfezione

1. Trypsinize la coltura madre HUVEC (vedere fase 4.1.2.) E contare manualmente le cellule utilizzando un emocitometro. Inizializzare il HUVEC su piatti di plastica coltura cellulare e di dimensioni adeguate, con una densità cellulare di partenza di circa 13.000 cellule / cm ² di superficie di crescita, 48 h prima della trasfezione fino a raggiungere il 70-80% di confluenza.
2. Preparare fresco miR / PEI / MNP complessi ogni volta.
   NOTA: In primo luogo, i complessi miR / PEI dovrebbero essere ottenuti (scala 3.2.1 - 3.2.3); successivamente, MNPs dovrebbero essere aggiunti alla soluzione miR / PEI (fase 3.2.4) per ottenere la formulazione finale miR / PEI / MNP utilizzato per la trasfezione (passo 3.3).
   1. Calcolare la quantità di appropriata miR commercialmente disponibile (disallineato etichettato o funzionale, vedere il passaggio 4) con la concentrazione del magazzino fornito dal produttore. Utilizzare 2,5 pmol di miR / cm ² di superficie di crescita delle cellule. Diluire il miR in soluzione glucosata al 5% per obtain una concentrazione finale di 0,125 pmol di miR / ml.
   2. Sulla base della quantità miR dal punto 3.2.1 e il rapporto ottimale NP di 25 ^32, calcolare la quantità richiesta di PEI usando la sua concentrazione misurata (fase 1.1.2). Diluire il PEI (per il volume richiesto calcolato) in un volume uguale di soluzione di glucosio 5%. Aggiungere il ottenuto pre-diluito PEI alla soluzione miR (dal punto 3.2.1) e agitare la miscela ottenuta per 30 s.
   3. Incubare la miscela miR / PEI ottenuta per 30 minuti a RT.
   4. Sonicare il MNPs a 35 kHz per almeno 20 minuti nel bagno d'acqua sonicating (vedere l'elenco dei materiali) a temperatura ambiente, aggiungere la giusta quantità di soluzione di MNP al miR / PEI (5-25 mg di ferro / mL di preparato miR / PEI / miscela MNP ^16), vortex per 30 s, e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente fino al momento.
3. Aggiungere il preparato miR / PEI / MNP miscela a gocce direttamente al mezzo di coltura delle cellule. Utilizzare la miscela risultante di cul cellulemedia tura con miR / PEI / MNP diluito in glucosio come la soluzione di trasfezione. Sostituire questa miscela con il fresco terreno di coltura 6 ore dopo la trasfezione.

4. Analisi di vettore di sicurezza

1. Esame della vitalità cellulare.
   1. Trasfezione delle cellule HUVEC seminate in una piastra di coltura a 24 pozzetti (fasi 3.1 e 3.2); utilizzare Cy3-miR come i puntali e codificate miR (SCR-MIR) come le sonde set comando per la citometria di flusso. Incubare a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO ₂ per 24 h.
   2. Raccogliere il surnatante e cellule trasfettate mediante tripsinizzazione utilizzando 1x Tripsina-EDTA diluito in PBS aggiunto alle cellule per 4 minuti a 37 ° C. Centrifugare a 300 xg per 10 min e utilizzare per l'analisi.
   3. Esaminare la vitalità delle cellule e l'efficienza di assorbimento miR 24 ore dopo la trasfezione mediante citometria a flusso mediante l'applicazione di una macchia disponibile in commercio per distinguere tra vita / le cellule morte; utilizzare protocolli standard ¹⁵
2. Esaminare la sicurezza dei complessi miR / PEI / MNP per le cellule in test funzionali.
   1. Valutare l'attività proliferazione delle cellule trasfettate.
      1. Transfect HUVEC seminate in una piastra di coltura 12 pozzetti (fasi 3.1 e 3.2) e antisenso funzionale miR (ad esempio, anti-miR92a per HUVECs ³¹⁾ ed incubare a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO ₂ per 24 h.
      2. Utilizzare un kit disponibile in commercio per definire il numero di cellule proliferanti dalla colorazione con EdU (5-etinil-2'-deossiuridina) e la scansione con la microscopia confocale laser-based. Utilizzare le seguenti impostazioni: microscopia obiettivo 40X con immersione in olio; laser di eccitazione 633 nm (per un colorante 647 nm); 5 campi aleatori da registrare in ogni campione. Calcolare il tasso di cellule proliferanti dividendo il numero di nuclei EdU macchiati per il numero totale nuclei (Hoechst-macchiato).
   2. Valutare la capacità delle cellule trasfettate per formare strutture tube-like, come descritto in precedenza ^{17, 31.}
      1. Trasfezione delle cellule HUVEC seminate in una piastra di coltura a 24 pozzetti (fasi 3.1 e 3.2) con SCR-miR e incubare per 48 ore a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO _2. Raccogliere le cellule trasfettate (come al punto 4.1.1).
      2. Seme 3,5 x 10 ⁴ cellule HUVEC modificati in piastre da 24 pozzetti rivestiti con 140 ml di matrice membrana basale. Incubare per 18 ore a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO _2.
      3. registrare le immagini di 10 campi casuali in ogni scansione laser e usando la microscopia confocale (interferenza differenziale contrasto) e analizzare utilizzando il software ImageJ con il plugin "Angiogenesi Analyzer". Includere tali parametri come la lunghezza totale di rami, il numero di rami, e il numero di junctions nella valutazione. Confrontare questo al controllo non trattato.
3. Esaminare la possibile influenza tossica di complessi trasfezione in gap giunzione (GJ) mediata comunicazione intercellulare (GJIC) verificando recupero di fluorescenza dopo photobleaching 3D (FRAP) ³³ in 3D.
   1. Seme le cellule su vetrini rivestiti di gelatina con un fondo sottile adatto per l'imaging live-cell (immersione in olio). Trasfezione delle cellule come sopra descritto nello stadio 3.2 con-etichettato, non funzionale miR (SCR-MIR) e incubare per 24 h.
   2. Preparare le cellule per l'imaging caricandoli con calceina direttamente prima microscopia. In particolare, sostituire il mezzo di coltura con terreno fresco contenente 5 mM calceina, incubare per 20 minuti, lavare con PBS, e aggiungere terreno di coltura fresco. Pre-riscaldare l'incubatore del microscopio a 37 ° C e regolare la concentrazione di CO ₂ al 5%.
      NOTA: Tutti i reattivi devono essere caldo per evitare Contrac cellularezione prima della misurazione.
   3. Utilizzare un laser di eccitazione 561 nm per la visualizzazione delle cellule e l'esperimento FRAP. In primo luogo, selezionare manualmente le celle per la misurazione come regioni di interesse (ROI); celle di prova devono avere almeno 3 celle vicine. Definire una cella di riferimento con brillante, fluorescenza stabile che non saranno sbiancato. Definire i limiti di un z-stack. Registrare la fluorescenza dalla parte superiore delle celle verso il basso per includere 10 - 15 strati.
   4. Candeggiare le celle di prova utilizzando 100% della potenza del laser e registrare il successivo recupero di fluorescenza (a causa del trasferimento dei colori GJ-specifica da cellule vicine) durante il successivo 15 min. Registrare i dati grezzi nelle z-stack ogni 60 s. In totale, effettuare le misure FRAP con non meno di 5 - 10 celle di prova per esperimento. Confrontare i risultati alle cellule non trasfettate.

5. Test di Transfection efficienza

1. Esame di miR assorbimento.
   1. Preparare le sonde descritte in step 4.1 e utilizzarli contemporaneamente per definire miR captazione con la citometria di flusso.
2. Confermare e descrivere la localizzazione intracellulare di complessi trasfezione confocale e super-risoluzione illuminazione strutturata microscopia (SIM).
   1. Inizializzare il HUVEC su vetrini rivestiti di gelatina posti in pozzetti di piastre di coltura da 24 pozzetti, come descritto in precedenza (passo 3.1). Trasfezione delle cellule con 3-colore marcato miR / PEI / MNP (passo 1.4) e incubare per 24 ore a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO _2.
   2. Lavare i coprioggetti prima con il 2% di albumina di siero bovino (BSA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi con solo PBS. Fissare cellule incubando a 4% paraformaldeide (PFA) a 37 ° C per 15 min e macchia nuclei con DAPI seguenti protocolli standard ^16. Lavare 3 volte l'agitatore (15 min ciascuna) per rimuovere il colorante in eccesso.
      NOTA: PFA è cancerogeno e deve essere maneggiato con cura.
   3. Posizionare il prcoprioggetti epared sui vetrini con adatto mezzo di fissaggio, lasciarli asciugare almeno per 1 h, e li usa per la microscopia, come descritto di seguito.
   4. Acquisire immagini utilizzando un obiettivo ad immersione 63X e le seguenti impostazioni: SIM 405-, 488-, 561-, e linee laser 633 nm per eccitazione; Modalità z-stack con una profondità di 32 bit a 5 angoli, 5 fasi, con una media di 4; griglia G2 con una linea 405 laser, G3 con 488, G4 con 561, e G5 con 633.
3. Valutare la funzionalità del miR consegnato da RT-qPCR in miR / PEI / MNP-HUVECs rispetto non trattata.
   1. Trasfezione delle cellule HUVEC seminato in 12 pozzetti gradini piastra di coltura (3.1 e 3.2) con antisenso funzionale miR (ad esempio, anti-miR92a per HUVEC ³¹⁾ ed incubare per 48 ore a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO _2.
   2. Valutare la consegna anti-miR92a e lavorazione con RT-qPCR utilizzando kit disponibili in commercio (vedere i materiali); seguire tlui le istruzioni del produttore, come descritto altrove ^{17, 31.} In parallelo, esaminare l'espressione del gene bersaglio (per esempio, ITGA5 ^31).
      NOTA: consegna antagomir contro endogena miR è preferito rispetto imita quanto garantisce la misura del risultato reale del miR e non soltanto l'accumulo intracellulare.

6. cellulare Targeting Valutazione e separazione cellulare magnetica

1. Cella di targeting in condizioni statiche in vitro.
   1. Trasfettare le cellule HUVEC in una piastra a 24 pozzetti (2,5 pmol / cm ² SCR-miR, NP 25, e 15-25 ug / mL MNP), incubare per 24 h, lavare, e raccogliere come descritto in precedenza (fase 4).
   2. Mescolare il pellet cellulare ottenuto da 1 bene con 1 ml di terreno di coltura fresco e posizionarlo nei pozzetti di una piastra 12 pozzetti. Fissare un piccolo magnete localmente (sul lato) nella parte inferiore della piastra con nastro.
   3. Incubare la sospensione cellulare per 24 h ed osservare l'attaccamento cellulare e la crescita nella zona sopra il magnete e l'area senza un magnete. Per una valutazione qualitativa, utilizzare un microscopio invertito convenzionale.
2. Cellulare targeting in condizioni dinamiche simulate in vitro.
   1. Trasfettare le cellule HUVEC in una piastra a 24 pozzetti a passi 3.1 e 3.2 (2.5 pmol / cm ² Cy3-miR, NP 25 e 15 - 25 ug / mL MNP), incubare per 24 ore, lavate, e raccogliere mediante tripsinizzazione utilizzando 1x tripsina-EDTA diluito in PBS aggiunto alle cellule per 4 minuti a 37 ° C. Centrifugare a 300 xg per 10 min.
   2. Mescolare il pellet cellulare ottenuto da 1 bene con 1 ml di terreno di coltura fresco e posizionarlo nella pozzetto di una piastra 12 pozzetti. Fissare un piccolo magnete in locale (sul lato di un pozzo) con del nastro. Posizionare la piastra di coltura su shaker e incubare la sospensione cellulare per 12 ore a 150 rpm per simulare condizioni dinamiche ^34.
   3. Lavare le cellule e fissareutilizzando 4% PFA. Macchiare i nuclei con DAPI ^16. Registrare l'adesione cellulare mediante scansione laser confocale con un laser di eccitazione 514 nm, modalità z-stack (5 - 12 fette) per ottenere dati grezzi, e massima elaborazione dell'immagine di proiezione per creare immagini per analisi.
3. analisi quantitativa di cellule magneticamente sensibili e non reattivi.
   1. Trasfettare le cellule HUVEC in una piastra a 24 pozzetti (2,5 pmol / cm ² SCR-miR, NP 25, e 15-25 ug / mL MNP), incubare per 24 ore, lavate, e raccogliere come descritto in precedenza (fase 6.2.1) . Pre-caldo PBS e cellule buffer di scelta (sterilizzato per filtrazione, vedere l'Elenco materiali) a 37 ° C. Risospendere il pellet cellulare ottenuto da ogni pozzetto con 500 microlitri di tampone smistamento cellulare.
   2. Applicare questa sospensione cellulare a una magnetiche colonne ordinamento fissati dal magnete fornita, lavare le colonne sul magnete 3 volte con tampone di cellule fresche di smistamento, e raccogliere il flusso attraverso il magnetiCally frazione non risponde (MAG).
   3. Rimuovere le colonne del magnete e immediatamente raccogliere la frazione di cellule magneticamente sensibile (MAG +) spingendo tampone fresco cell sorting attraverso la colonna utilizzando uno stantuffo.
   4. Centrifuga sia MAG e MAG + a 300 xg per 10 min. Risospendere il pellet cellulare in PBS, contare le cellule, e valutare la vitalità cellulare con Trypan saggio di esclusione del blu ^35. Utilizzare il pellet cellulare ottenuto o per analisi a lungo termine (cioè, ri-seme e valutare dopo 24, 48, e 72 ore in coltura ¹⁷⁾ o direttamente per citometria a flusso (passo 4.1.).
4. Definire il sovraccarico di ferro delle cellule trasfettate.
   NOTA: Durante la preparazione, qualsiasi contatto delle sonde cellulari con materiali e strumenti di ossido di ferro deve essere evitata.
   1. Raccogliere le cellule HUVEC trasfettate e trasfettate controllo (come al punto 4.1.1). Lavare le cellule raccolte due volte in 2% BSA in PBS ³⁶ b y mescolando accuratamente le cellule con 1 ml di questa soluzione di lavaggio e poi centrifugazione a 300 xg per 10 min. Risospendere il pellet cellulare ottenuto in 250 ml di PBS, aggiungere 100 ml di 4% PFA, e incubare per 20 min per fissare le cellule. Lavare 3 volte con PBS, come descritto sopra.
   2. Risospendere il pellet cellulare fisso con conseguente 110 ml di PBS e trasferirlo 100-ml provette PCR.
      1. Prendere aliquote di 10 microlitri per il conteggio delle cellule e utilizzare il campione restante per spettroscopia particella magnetica (MPS).
   3. Eseguire la misurazione su un dispositivo MPS disponibile in commercio. Durante la misurazione, applicare le seguenti impostazioni: campo magnetico _{di azionamento} B = 25 mT e frequenza f ₀ = 25 kHz. Per ferro quantificazione dei campioni, normalizzare la terza armonica A ₃ della MPS spettro al corrispondente A _{3, ref} di un campione di riferimento MNP con una quantità di ferro noto di 2,1 ugxref "> 37. Utilizza cellule non trattate come controlli.

7. Limiti Definizione MRI Detection

1. preparazione cellulare.
   1. HUVEC seme in una piastra a 6 pozzetti e trasfezione (2,5 pmol / cm ² SCR-miR, NP 25 e 15 - 25 ug / mL MNP) in duplicati o triplicati in conformità con la quantità di cellule (per la preparazione phantom). Incubare le cellule per 24 ore e lavare, raccogliere, e fissarle con 4% PFA, come descritto in precedenza (fase 4).
   2. Contare le cellule ottenute, preparare aliquote con numero di cellule appropriate (ad esempio, 10 ^3, 10 ^4, 10 ^5, etc.), e regolare il volume a 50 microlitri.
2. Preparazione phantom Agarosio
   1. Preparare diversi strati di 2% agarosio in provette da 50 ml con diverse quantità di cellule transfettate incorporate tra gli strati ^38. Durante la preparazione, ultrasuoni e centrifugare l'agarosio caldo ³⁸ adistruggere le bolle d'aria che causano artefatti.
      NOTA: È importante sottolineare che, fantasmi contenenti 5.5 x 10 ⁵ cellule HUVEC trattate con amagnetici complessi miR / PEI dovrebbero essere preparati nello stesso modo per servire come controlli.
3. Scan La ottenuti in vitro fantocci con un sistema MRI 7.1 T animale dopo aver posizionato il fantasma centralmente nella bobina, parallela alla asse z del campo magnetico.
   1. Applicare i seguenti parametri della sequenza di acquisizione sequenza gradiente-echo: TR = 66 ms; TE _1/2 TE / TE ₃ / TE _4/5 TE / TE ₆ = 1.44 / 2.88 / 4.51 / 6.11 / 7.60 / 9.01 ms; flip angle = 3 °; matrix = 128 × 128, interpolata a 256 x 256; campo visivo = 42 mm; 100%; medie = 1, eco lunghezza del treno = 1; spessore di strato = 1,5 mm e 16 fette.
   2. Valutare il decadimento di tutti i quattro tempi di eco del segnale e calcolare le mappe R2 * (R2 * = 1 / T2 *) utilizzando il software appropriato, come descritto altrove ³⁹.

Lo scopo principale del protocollo proposto è di produrre risposte magnetiche cellule miR-modificati e condurre loro caratterizzazione accurata (Figura 1). Di conseguenza, le cellule in modo efficiente trasfettate, sensibili alla selezione magnetica e di orientamento e rilevabili con la risonanza magnetica, devono essere ottenuti.

In primo luogo, le identità di HUVEC isolati sono stati confermati mediante colorazione tipica con il CD31 marcatore endoteliale (PECAM) (Figura 2A) e dalla loro capacità di formare tubi sulla matrice membrana basale appropriata (Figura 2B). Le cellule ottenute hanno preso il miR introdotto da PEI / MNP molto efficiente; La microscopia ha dimostrato che tutte le cellule erano positive per un segnale di etichettato miR (Cy3) 24 ore dopo la trasfezione (Figura 3A). Soprattutto, nessuna morte cellulare è stata registrata rispetto alle cellule non trattate (Figura 3B), e nAspetto ormal stata mantenuta (Figura 3A). Come osservato con microscopio confocale a scansione laser, il segnale di Cy3-miR è stato principalmente situato all'interno delle cellule. Inoltre, un esame più dettagliato della localizzazione intracellulare di tutte le parti del vettore trasfezione e miR stata effettuata con maggiore risoluzione usando 3-colore complessi marcati. SIM, Mir, PEI, e MNP segnali sono stati tutti rilevati nel citoplasma della regione perinucleare (Figura 3C).

Inoltre, un esame dettagliato di sicurezza trasfezione vettore ha dimostrato che miR / PEI / MNP-HUVEC sono in grado di formare tubi sulla matrice membrana basale appropriato e che la rete risultante è paragonabile a quello delle cellule non trattate utilizzate come controllo positivo (Figura 4A ). Inoltre, le cellule trasfettate mantenute GJIC, come esperimenti 3D-FRAP rivelato. In particolare, quando le cellule vengono caricati con fluorescente GJ-Permeacolorante ble e uno di essi viene sbiancata, sua fluorescenza recupera causa della comunicazione con le cellule vicine e il trasferimento del colore risultante (Figura 4B).

Soprattutto, per la presenza del superparamagnetico composto 40 (Figura 5A), applicazione PEI / MNP permette non solo trasfezione delle cellule, ma anche la magnetizzazione simultanea. La quantità risultante di ferro intracellulare è stata misurata utilizzando MPS (Figura 5B) per tutte le concentrazioni MNP applicati entro l'intervallo ottimale (2,5 pmol / cm 2 miR; NP 25 complementata con 5-25 ug / mL MNP): 0,37 ± 0,079 a 0,7 ± 0,150 pg ferro / cellulare 17. Poiché l'utilizzo di colonne di separazione magnetica dimostrato, per tutte queste concentrazioni MNP, la quantità di cellule magneticamente sensibili nel volume totale delle cellule trasfettate è ~ 70% (Figura 5C). Inoltre, transfettate HUVECs sono visibili con la risonanza magnetica (Figura 5D) all'interno di agarosio in vitro fantasmi, imitando suscettibilità tessuti mouse. Inoltre, targeting magnetico di HUVEC trasfettate in condizioni dinamiche simulate in vitro è stato dimostrato di essere efficace (Figura 6). In questa configurazione sperimentale, anche il vigoroso movimento continuo di terreno di coltura non impedisce la crescita cellulare prevalente nella zona vicino applicazione del magnete.

Figura 1. Schema Illustrazione della produzione di HUVECs magnetizzato miR-modificati e la loro analisi. Il PEI / MNP (polietilenimminica / vettore a base di nanoparticelle superparamagnetico) viene applicato per fornire microRNA (miR) per le cellule umane ombelicale vena endoteliali (HUVEC). Il prodotto cellulare ottenuta è caratterizzato dai seguenti parametri: sicurezza (compresa la vitalità cellulare, funzionalelità e capacità di comunicazione intercellulare); efficienza di trasfezione (cioè, miR efficienza di assorbimento e la funzionalità in seguito); magnetico targeting in vitro in condizioni dinamiche e statiche simulate; la risonanza magnetica (MRI) di rilevamento. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Caratterizzazione dei isolata HUVEC. A. Immagine rappresentativa della HUVECs isolate e coltivate colorate con marcatore CD31 endoteliale. I nuclei sono di contrasto con DAPI (blu). La barra della scala è 20 um. Risultato B. rappresentativa del saggio formazione del tubo eseguita su isolato HUVECs; l'immagine è stata registrata usando un microscopio confocale a scansione laser (inter differenzialeferenza contrasto) 18 ore dopo la semina delle cellule sulla matrice membrana basale. La barra della scala è di 100 um. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. miR consegna di HUVEC utilizzando PEI / MNP. A. L'assorbimento di targhetta miR (Cy3, rosso) 24 ore dopo la trasfezione (2,5 pmol / cm 2 di Cy3-contrassegnati miR, NP 25 e MNP 25 ug / mL) e la manutenzione di aspetto normale cella sono illustrati. Immagini sono state prese da microscopio confocale a scansione laser con un 514-nm laser di eccitazione (Cy3, rosso) e contrasto interferenziale differenziale. La barra della scala è 50 um. B. La vitalità cellulare 24 h post-trasfezione è stata valutata mediante citometria di flusso. La trama rappresenta i risultati ottenuti per HUVECs trattati con le seguenti composizioni complesse: 2,5 pmol / cm 2 di Cy3-miR; NP rapporto 25 integrato con 5 a 25 ug / mL di MNPs. Le barre rappresentano il rapporto tra il numero medio di cellule vitali e l'intera popolazione di cellule (n = 6; barre di errore: SEM). C. Strutturato illuminazione microscopia (SIM) imaging 3-colore etichettato complessi miR / PEI / MNP assunte da HUVEC. Le cellule sono state transfettate come descritto sopra, incubato, e fissato 24 h dopo il trattamento; i nuclei sono stati di contrasto con DAPI. dati grezzi SIM sono stati registrati in z-stack ed elaborati; le immagini rappresentative sono il risultato della proiezione massima intensità. Sono stati applicati i seguenti laser di eccitazione: 405 nm (DAPI, blu), 488 nm (Atto488-PEI, arancio), 565 nm (Atto565-MNP, ciano) e 633 nm (Cy5-miR, rosso). La barra della scala è 5 um. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. La sicurezza degli HUVECs modifica con miR / PEI / MNP. A. Un saggio di formazione del tubo è stata eseguita con le cellule trasfettate (2,5 pmol / cm 2 di SCR-MIR NP 25 e MNP 25 ug / mL) 48 h post-trattamento. Immagini sono state acquisite con un microscopio confocale a scansione laser (cioè differenziale contrasto interferenziale) 18 ore dopo semina delle cellule su matrici membrana basale. HUVEC trasfettate con miR / PEI sono stati usati come controllo tossicità e cellule non trattate come controllo positivo. La barra della scala è di 100 um. La trama rappresenta il rapporto tra le cellule HUVEC trasfettate e le cellule non trattate utilizzando diversi parametri: lunghezza del tubo, il numero di rami, e giunzioni (n = 3, le barre di errore: SEM). B. La giunzione mediata comunicazione intercellulare gap di miR / PEI / MNP modificato HUVEC è stata valutata 24 ore dopo l'transfeczione. Per questo scopo, le cellule sono state caricate con il calceina colorante GJ-permeabile (arancione); recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) è stata esaminata in 3D da celle di scansione di test in z-stack. Immagini rappresentative di cellule calceina-caricato prima del candeggio, direttamente dopo lo sbiancamento, e 15 minuti post-candeggio (con fluorescenza recuperati) sono raffigurati. La barra della scala è 20 um. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. cellulare magnetizzazione risultante dalla trasfezione con PEI / MNP e la sua applicazione. A. immagine rappresentativa del filtrato MNPs, preso con TEM, illustrando loro morfologia cluster. Una piccola taglia (~ 5 - 15 nm) di particelle di ossido di ferro singoli (con conseguente superparamagnetismo) è quindiconfermato. La barra della scala è di 100 nm. B. Il caricamento intracellulare delle cellule trasfettate è stata valutata mediante spettroscopia particella magnetica (MPS) 24 ore dopo la trasfezione. Il gruppo rappresentativo raffigura lo spettro MPS di campioni esaminati. In particolare, la sospensione puro MNP (50 mL) è servita da riferimento (quadrati blu); i cerchi sono gli spettri MPS di due campioni transfettate cellule (cerchi rossi: MNP 25 ug / mL; cerchi verdi: MNP 5 ug / mL), mentre i triangoli grigi mostrano lo spettro di fondo rilevato ottenuto da una misura senza alcun campione. Notare la scala logaritmica l'ampiezza (A). C. La quantità di cellule magneticamente modificata è stata quantificata mediante l'applicazione di HUVEC trasfettate (2,5 pmol / cm 2 miR; NP 25 complementata con 5-25 ug / mL di MNP), raccolte mediante tripsinizzazione 24 h post-trattamento, per un magnetico colonna di separazione cellulare. La risultante frazione magneticamente positivo (cioè, che è rimasta nella colonna)è stato contato, e la sua percentuale su tutta la quantità di cellule transfettate si riflette sul terreno per ciascuna concentrazione MNP (triangoli rossi). La vitalità cellulare è stata successivamente esaminata dal Trypan saggio di esclusione del blu (rombi grigi). I dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). D. L'immagine illustrativo MRI transfettate cellule HUVEC (300.000 cellule; 2,5 pmol / cm 2 miR; NP 25 e 25 ug / mL di MNP) incorporato in un fantoccio agarosio è stato registrato con un sistema MRI animale 7.1 T. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. In Vitro magnetica Targeting di miR / PEI / MNP-HUVEC in simulate condizioni dinamiche. HUVECs sono stati raccolti 24 h post-trasfezioneion (2,5 pmol / cm 2 di Cy3-miR; NP 25 e MNP 25 ug / mL) e ri-inoculate in un terreno di coltura fresco nei pozzetti, con un piccolo magnete collegata localmente alla parete laterale. A sua volta, questa piastra di coltura è stato fissato ad un agitatore rotante a 150 rpm. attaccamento cellulare e la crescita sono stati valutati 12 ore dopo fissando cellule con PFA, colorazione loro nuclei con DAPI, e l'esecuzione di scansione laser confocale (laser di eccitazione: 405 nm, DAPI, blu, 514 nm, Cy3, arancione). Immagini rappresentative raffigurano la crescita delle cellule della zona, con applicazione del magnete; senza applicazione del magnete; e nel centro della cultura pozzo, dove il flusso di liquido è stato concentrato cellule. Le barre scala sono 50 um. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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