Method Article

preparazione e In Vitro Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

DOI:

10.3791/55567

⸱

May 2nd, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

In This Article

Summary

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Questo manoscritto descrive l'erogazione efficiente, non virale miR alle cellule endoteliali da un vettore PEI / MNP e la loro magnetizzazione. Così, oltre alla modificazione genetica, questo approccio consente di orientamento delle cellule magnetica e risonanza magnetica rilevabilità. La tecnica può essere utilizzata per migliorare le caratteristiche dei prodotti cellulari terapeutici.

Abstract

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Fino ad oggi, i trattamenti chirurgici e farmacologici disponibili per le malattie cardiovascolari (CVD) sono limitati e spesso palliative. Allo stesso tempo, terapie geniche e cellulari sono approcci alternativi promettenti per il trattamento CVD. Tuttavia, l'ampia applicazione clinica della terapia genica è fortemente limitato dalla mancanza di idonei sistemi di trasferimento genico. Lo sviluppo di adeguate vettori di trasferimento genico in grado di fornire una soluzione alle sfide attuali in terapia cellulare. In particolare, gli svantaggi esistenti, come l'efficienza limitata e ritenzione delle cellule di basso nell'organo danneggiato, potrebbero essere superati mediante l'ingegneria cella appropriata (cioè, genetica) prima del trapianto. Il protocollo presentato descrive la modificazione transitoria efficiente e sicura delle cellule endoteliali mediante una nanoparticella polietilenimmina superparamagnetico magnetico (PEI / MNP) consegna basata su vettore. Inoltre, l'algoritmo e metodi per la caratterizzazione delle cellule sono definite. Il successo intracelluconsegna LAR di microRNA (miR) nella vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) è stato raggiunto senza compromettere la vitalità cellulare, la funzionalità, o comunicazione intercellulare. Inoltre, questo approccio è stato dimostrato di causare un forte effetto funzionale esogeno introdotto miR. È importante sottolineare che l'applicazione di questo vettore MNP-based assicura magnetizzazione cella, con possibilità di targeting magnetico e non invasivo MRI tracing accompagnamento. Questo può fornire una base per magneticamente guidate, terapie cellulari geneticamente ingegnerizzati che possono essere monitorati in modo non invasivo con MRI.

Introduction

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Terapia genica e cellulare sono strumenti potenti che hanno il potenziale per risolvere le sfide attuali nel trattamento CVD. Nonostante il fatto che entrambi questi approcci sono attualmente in fase di sperimentazione in studi clinici, non sono ancora pronti per una vasta applicazione clinica 1. In particolare, un approccio comune per affrontare le sfide della terapia genica e cellulare è quello di sviluppare vettori di trasferimento dei geni multifunzionali adatte per l'applicazione clinica. La mancanza di sistemi di lancio gene sicuri ed efficienti è la preoccupazione principale della terapia genica. Allo stesso tempo, l'ingegnerizz....

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Protocol

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Cordoni ombelicali umani per l'isolamento delle cellule sono stati ottenuti dopo il parto dalla informati, donne sane che hanno dato il loro consenso scritto per l'uso di questo materiale per la ricerca in base alla Dichiarazione di Helsinki. Il comitato etico dell'Università di Rostock ha approvato lo studio presentato (reg. No. Un 2011 06, prolungato 23 settembre, 2013).

1. Preparazione di Transfection Complessi

  1. Biotinilazione di polietilenimmina (PEI).
    1. Sciogliere ramificato PEI in acqua ultrapura sotto agitazione magnetica a 300 - 400 rpm per 24 ore a temperatura ambiente (RT) e al riparo dalla ....

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Results

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Lo scopo principale del protocollo proposto è di produrre risposte magnetiche cellule miR-modificati e condurre loro caratterizzazione accurata (Figura 1). Di conseguenza, le cellule in modo efficiente trasfettate, sensibili alla selezione magnetica e di orientamento e rilevabili con la risonanza magnetica, devono essere ottenuti.

In primo luogo, le identità di HUVEC isolati sono stati confermati mediante colo.......

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Discussion

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La produzione di cellule geneticamente modificate cariche di nanoparticelle superparamagnetiche per la loro guida ulteriormente magneticamente controllato è presentato nel protocollo corrente. L'applicazione di successo di questa strategia consente la risoluzione di alcune difficoltà di terapia cellulare, come la bassa ritenzione e poveri attecchimento nella zona lesa 2, 3, 4, realizzando un prodotto cellulare targeting per.......

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Disclosures

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Noi non abbiamo concorrenti interessi finanziari da dichiarare.

Acknowledgements

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Vorremmo ringraziare G. Fulda (Microscopia Elettronica Center, Università di Rostock, Germania) per il supporto tecnico ad acquisire immagini TEM di nanoparticelle superparamagnetiche filtrati e nello svolgimento loro analisi ai raggi X. Il lavoro svolto presso la RTC Rostock è stato sostenuto dal Ministero federale dell'Istruzione e della Ricerca Germania (FKZ 0312138A, FKZ 316159 e VIP + 03VP00241) e lo Stato Meclemburgo-Pomerania occidentale con i Fondi strutturali dell'UE (FSE / IV-WM-B34- 0030/10 e FSE / IV-BM-B35-0010 / 12) e dalla DFG (dA 1296-1), l'umidità-Fondazione, e la Heart Foundation tedesco (F / 01/12). Frank Wiekhorst è stato sostenuto dal....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinaThermo Scientific21335
PD-10 Colonne di desalinizzazioneGE Healthcare17085101contenente Sephadex G-25 Soluzione di
reagente di ninidrina media 2%Sigma Aldrich7285
GlycineSigma Aldrich410225
Kit di quantificazione della biotina PierceThermo Scientific28005
Lettore di micropiastre Modello 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Particelle paramagnetichePromegaZ5481
Filtro PVDF Millex-HVMerckSLHV013SL0,45 &; m
Libra 120 microscopio elettronico a trasmissioneZeissTensione di accelerazione 120  Rivelatore
di raggi X kV ZaffiroEDAX-Amatek
Plastica per colture cellulariTPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kitMirus BioMIR 9650
Biotina Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
Collagene Tipo IV GibcoThermo Scientific17104019
Terreno di crescita endoteliale, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
Penicillina/StreptomicinaThermo Scientific15140122100 U/mL, 100 µ g/mL
MatrigelBD Biosciences356234
anticorpo anti-PECAM-1Santa Cruzsc-1506
MS MACS colonneMiltenyi Biotec 130-042-201
Kit per coloranti di cellule vive/morte nel vicino infrarossoThermo ScientificL10119
Cy3 Controllo negativo pre-miR marcato con coloranteThermo ScientificAM17120"Cy3-miR" o "Cyanine-miR3" nel manoscritto
Molecole precursori pre-miRNA pre-miR - Controllo negativo Thermo ScientificAM17110"scr-miR" nel manoscritto
Anti-has-miR92a-3p inibitore sinteticoThermo ScientificAM10916
Sistema LSM 780 ELYRA PS.1Zeiss
ParaformaldeideSigma Aldrich158127soluzione al 4% in
PBS DAPI colorante nucleareThermo ScientificD1306
Kit di isolamento dell'RNA NucleoSpinMachery-Nagel740955
mirVana Kit di isolamento miRNAThermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNAThermo Scientific4366596
StepOnePlus Sistema di PCR in tempo realeApplied Biosystems
trascrizione inversa di cDNA ad alta capacitàThermo Scientific4368814
has-miR-92a TaqMan assayThermo Scientific000431Sequenza miRNA matura: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan assayThermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan assayThermo Scientific001093
18S rRNA Controllo endogenoThermo Scientific4333760F
GelatinaSigma AldrichG7041
CellTrace Calceina Rosso-ArancioThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
tampone MACSMiltenyi Biotec 130-091-221
AgarosioSigma AldrichA9539
7.1 Tesla sistema di risonanza magnetica animaleBruker CorporationA7906
Software ImageJNational Institutes of Healthaggiornato con un dispositivo AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPSSoftware Bruker Biospin
MatlabMathworks
Anello Magnete Neodimo magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm; la rimanenza è ~ 1,3  T, coercitività ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit di imagingThermo ScientificC10340
Reagente FluorSaveMerck345789
Bagno a ultrasuoniBandelin elettronicoTipo: RK 100 SH
Kit di trascrizione inversa Kit di

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al.

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Endothelial CellsMicroRNA DeliveryMagnetic NanoparticlesCell TransfectionConfocal MicroscopyFlow CytometryCell ViabilityTube FormationGap Junction CommunicationMRI Tracing

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