Articolo metodologico

preparazione e In Vitro Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

DOI:

10.3791/55567

⸱

2 maggio 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto descrive l'erogazione efficiente, non virale miR alle cellule endoteliali da un vettore PEI / MNP e la loro magnetizzazione. Così, oltre alla modificazione genetica, questo approccio consente di orientamento delle cellule magnetica e risonanza magnetica rilevabilità. La tecnica può essere utilizzata per migliorare le caratteristiche dei prodotti cellulari terapeutici.

Abstract

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Fino ad oggi, i trattamenti chirurgici e farmacologici disponibili per le malattie cardiovascolari (CVD) sono limitati e spesso palliative. Allo stesso tempo, terapie geniche e cellulari sono approcci alternativi promettenti per il trattamento CVD. Tuttavia, l'ampia applicazione clinica della terapia genica è fortemente limitato dalla mancanza di idonei sistemi di trasferimento genico. Lo sviluppo di adeguate vettori di trasferimento genico in grado di fornire una soluzione alle sfide attuali in terapia cellulare. In particolare, gli svantaggi esistenti, come l'efficienza limitata e ritenzione delle cellule di basso nell'organo danneggiato, potrebbero essere superati mediante l'ingegneria cella appropriata (cioè, genetica) prima del trapianto. Il protocollo presentato descrive la modificazione transitoria efficiente e sicura delle cellule endoteliali mediante una nanoparticella polietilenimmina superparamagnetico magnetico (PEI / MNP) consegna basata su vettore. Inoltre, l'algoritmo e metodi per la caratterizzazione delle cellule sono definite. Il successo intracelluconsegna LAR di microRNA (miR) nella vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) è stato raggiunto senza compromettere la vitalità cellulare, la funzionalità, o comunicazione intercellulare. Inoltre, questo approccio è stato dimostrato di causare un forte effetto funzionale esogeno introdotto miR. È importante sottolineare che l'applicazione di questo vettore MNP-based assicura magnetizzazione cella, con possibilità di targeting magnetico e non invasivo MRI tracing accompagnamento. Questo può fornire una base per magneticamente guidate, terapie cellulari geneticamente ingegnerizzati che possono essere monitorati in modo non invasivo con MRI.

Introduzione

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Terapia genica e cellulare sono strumenti potenti che hanno il potenziale per risolvere le sfide attuali nel trattamento CVD. Nonostante il fatto che entrambi questi approcci sono attualmente in fase di sperimentazione in studi clinici, non sono ancora pronti per una vasta applicazione clinica 1. In particolare, un approccio comune per affrontare le sfide della terapia genica e cellulare è quello di sviluppare vettori di trasferimento dei geni multifunzionali adatte per l'applicazione clinica. La mancanza di sistemi di lancio gene sicuri ed efficienti è la preoccupazione principale della terapia genica. Allo stesso tempo, l'ingegnerizzazione genetica di prodotti cellulari prima del trapianto potrebbe superare le gravi sfide della terapia cellulare, come la bassa efficienza (trapianto di cellule post-staminali per esempio, nel campo cardiaco, solo ~ 5% di miglioramento funzionale si ottiene 1 ) e la scarsa ritenzione / attecchimento presso il sito di lesione (ad esempio, la conservazione delle cellule scende sotto i 5 - 10% in pochi minuti a ore Post-applicazione, indipendentemente dalla via di somministrazione 2, 3, 4).

Fino ad oggi, vettori virali superano notevolmente i sistemi non-virali in termini di efficienza, che ha portato nella loro più ampia applicazione negli studi clinici (~ 67%) 5. Tuttavia, i veicoli virali comportano rischi gravi, come immunogenicità (e la successiva risposta infiammatoria, con gravi complicazioni), oncogenesi e limitazioni nella dimensione del materiale genetico condotto 6. A causa di questi problemi di sicurezza e gli elevati costi di produzione vettore virale, l'uso di sistemi non virali è preferibile in alcuni casi 7, 8. È particolarmente adatto per i disturbi che richiedono correzione genetica transitoria, come l'espressione dei fattori di crescita che controllano l'angiogenesi (ad esempio, per il trattamento CVD) o delivery di vaccini.

Nel nostro gruppo, un sistema di erogazione creata da combinando ramificato polietilenimmina 25-kDa (PEI) e nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (MNP) legati insieme da interazione biotina-streptavidina 9. Questo vettore è un potenziale strumento per l'ingegneria genetica di cellule, consentendo loro magnetizzazione simultanea prima del trapianto. Quest'ultimo fornisce una base per magnetico orientamento / ritenzione, che è particolarmente promettente al giorno d'oggi, come tecniche avanzate di targeting magnetici si stanno sviluppando con successo 10. Inoltre, le risultanti cellule magneticamente sensibili hanno il potenziale di essere non invasivo monitorato da risonanza magnetica (MRI) o immagini di particelle magnetiche 11, 12.

Nel caso del vettore PEI / MNP, poliammina assicura condensazione di acido nucleico e quindi la protezione dal fattore degradanti s, vettore internalizzazione nelle cellule, e endosomali fuga 5. Il MNPs completano le proprietà di PEI, non solo in termini di orientamento magnetico, ma anche riducendo il noto tossicità PEI 7, 13, 14. In precedenza, PEI / MNP proprietà vettoriali sono stati regolati in termini di efficienza di consegna (cioè, pDNA e miRNA) e sicurezza utilizzando fibroblasti e cellule staminali mesenchimali umane 15, 16.

In questo manoscritto, un protocollo dettagliato sull'applicazione della PEI / MNPs per la generazione di cellule miRNA-modificata viene descritto 17. Per questo scopo, vengono utilizzate HUVEC e rappresentano un modello stabilito per l'angiogenesi in vitro. Sono impegnativo per trasfettare e sono suscettibili di influenza tossica 18, 19,ass = "xref"> 20. Inoltre, mettiamo a disposizione un algoritmo per valutare tali cellule in vitro, compresa la loro targeting, la comunicazione intercellulare, e la rilevazione risonanza magnetica.

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Protocollo

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Cordoni ombelicali umani per l'isolamento delle cellule sono stati ottenuti dopo il parto dalla informati, donne sane che hanno dato il loro consenso scritto per l'uso di questo materiale per la ricerca in base alla Dichiarazione di Helsinki. Il comitato etico dell'Università di Rostock ha approvato lo studio presentato (reg. No. Un 2011 06, prolungato 23 settembre, 2013).

1. Preparazione di Transfection Complessi

  1. Biotinilazione di polietilenimmina (PEI).
    1. Sciogliere ramificato PEI in acqua ultrapura sotto agitazione magnetica a 300 - 400 rpm per 24 ore a temperatura ambiente (RT) e al riparo dalla luce per ottenere una soluzione 0,18 mM. Conservare la soluzione a 4 ° C.
    2. Misurare la concentrazione di gruppi amminici primari nella soluzione ottenuta 21, 22.
      1. Utilizzare 2% di soluzione di reagente ninidrina come reagente di rilevazione ammina 23 mescolando 100 ml di prCampione ediluted (1: 200 con acqua ultrapura) e 75 ml di reagente ninidrina. Incubare per 30 minuti a 80 ° C. Raffreddarlo e aggiungere 100 ml di etanolo al 50% per la stabilizzazione. Misurare l'assorbanza a 550 nm su uno spettrofotometro di assorbimento.
      2. Creare una curva standard utilizzando glicina.
        1. Preparare 0,1 M soluzione ammino-N magazzino (0,75 g di glicina in 100 mL di acqua deionizzata) e sue diluizioni, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40 1:80, 1: 100, 1: 200, e 1: 400, 1: 600. Misurare tali soluzioni, come al punto 1.1.2.1 e creare un grafico con la concentrazione e l'assorbanza sugli assi.
        2. Sulla base del plot ottenuto e l'assorbanza misurata della soluzione di PEI, definire la concentrazione dei gruppi alfa-amino in PEI.
          NOTA: Attenzione. soluzione reagente ninidrina deve essere utilizzata esclusivamente sotto il cofano e deve essere conservato in atmosfera di azoto. Non è utilizzabile quando il colore della soluzione cambia a causa di ossidazione.
    3. Sciogliere 100 mg di biotina linker in acqua ultrapura immediatamente prima dell'uso per ottenere una soluzione 0,01 mM. Calcolare la quantità di biotina aggiungere a PEI moltiplicando la concentrazione di gruppi alfa-ammino in PEI (misurata nella fase 1.1.2) per 20 per ottenere la quantità necessaria (in moli) di reagente biotinylating.
      1. Aggiungere la soluzione biotina alla soluzione PEI a pH 8-9 e incubare per 16 ore sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere la biotina reagito mediante cromatografia di esclusione molecolare 23. Utilizzare le colonne disponibili in commercio contenenti un mezzo adeguato gel filtrazione per la purificazione del 25 kDa PEI e seguire le istruzioni del produttore. Prendere aliquote dopo purificazione per misurare la concentrazione di ammina utilizzando un reagente di rilevamento ammina (fase 1.1.2) e determinare l'efficienza biotina coniugazione (fase 1.2.2). Conservare il ottenuta biotinilato PEI a 4 ° C.
  2. Caratterezazione di biotinilato PEI.
    1. Determinare la concentrazione di gruppi alfa-ammino in PEI dopo la biotinilazione, come descritto al punto 1.1.2.
    2. Determinare il grado di PEI biotinilazione per verificare la procedura di coniugazione. Per la quantificazione, utilizzare un kit disponibile in commercio, che si basa sull'applicazione di HABA colorante (acido 4'-hydroxyazobenzene-2-carbossilico), per garantire la corretta determinazione colorimetrica dei livelli biotinilazione 24, 25. Seguire le istruzioni fornite dal produttore.
  3. Filtrazione di MNPs e loro caratterizzazione.
    1. Filtrata commercialmente disponibile rivestita con streptavidina MNP attraverso un 0,45-micron filtro a siringa a motore 16 in modo da escludere aggregati tossici più grandi. Misurare la concentrazione di ferro finale utilizzando un saggio standard di 26 fotometrico.
    2. Esaminare la qualità delle MNPs filtrati per la registrazionela curva di magnetizzazione e di imaging TEM secondo protocolli standard 27, 28.
      1. Diluire la sospensione MNP con acqua distillata e collocare 3 ml della sospensione ottenuta su-maglia 300 griglia di rame Formvar carbonio rivestito per l'analisi TEM. Successivamente, collocare questa griglia su un vetrino su una piastra riscaldante e lasciare asciugare.
      2. Analizzare il campione con un microscopio elettronico a trasmissione a 120 kV e verificare il contenuto elementale utilizzando un rivelatore di raggi X 27.
  4. l'etichettatura di 3 colori di complessi trasfezione per la microscopia super-risoluzione.
    1. Etichettare 0,5% dei gruppi amminici primari misurati in PEI con NHS-Ester Atto 488 colorante seguito le istruzioni del produttore. Rimuovere il colorante non legato in eccesso cromatografia di esclusione molecolare, come descritto sopra (punto 1.1.4). Misurare la conseguente concentrazione di gruppi amminici utilizzando un assa ninidrinay (fase 1.1.2).
    2. Etichettare commercialmente disponibile criptato miR (SCR-MIR) con colorante Cyanine5 utilizzando un apposito kit di etichettatura 15 (indicata nella lista Materials). Misurare la concentrazione risultante fluoroforo-miR spettrofotometricamente.
    3. Appena etichettare MNP ogni volta con colorante biotina-coniugato (ad esempio, atto 565-biotina) a 1: 1.000 w / w rapporto. Applicare direttamente il colorante dopo aver aggiunto la MNP al miR / PEI durante la formazione dei complessi trasfezione, per i dettagli in Delyangina et al. 16.

2. Preparazione delle cellule

  1. l'isolamento HUVEC.
    1. Isolare cellule dal cordone ombelicale subito dopo l'ottenimento delle corde con collagenasi digestione dall'interno della vena ombelicale; seguire un protocollo precedentemente sviluppato 29.
      1. Incubare ogni cavo con ~ 60 unità / ml di collagenasi di tipo IV soluzione in tampone - caricate in tegli vena ombelicale - a 37 ° C per 13 min.
    2. Per tutti gli esperimenti, in comune le HUVECs da un minimo di 5 pazienti.
      NOTA: La coltivazione non deve superare i 4-5 passaggi. Non utilizzare le cellule contaminate da micoplasma, in quanto questo provoca una diminuzione della efficienza di trasfezione. contaminazione da Mycoplasma dovrebbe essere testato per prima di avviare il protocollo utilizzando un kit PCR per la rivelazione altamente sensibile di micoplasmi.
      1. Test per la presenza micoplasma.
        1. Centrifugare 1 ml di coltura supernatante cellulare per 10 min (13.000 xg). Sospendere il pellet in 17 ml di dH 2 O e ebollizione (93 ° C) per 3 min. Utilizzare 2 microlitri della sospensione per amplificare la regione di DNA che codifica per RNA ribosomiale altamente conservati (16S-rRNA) di varie specie di micoplasma.
        2. Eseguire la PCR con 10 pmol di ciascun primer (primer forward: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; primer inverso: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') a pettineination con un kit commerciale PCR nelle seguenti condizioni: 94 ° C per 3 min; 45 cicli di 94 ° C per 30 s, 50 ° C per 30 s, e 72 ° C per 30 s; e un'estensione finale a 72 ° C per 10 min.
        3. Analizzare il prodotto di PCR (292 bp) utilizzando agarosio gel elettroforesi.
    3. O conservare le cellule ottenute lungo termine in azoto o coltura liquida nel mezzo di crescita endoteliale supplementato con 100 U / ml di penicillina e 100 pg / ml di streptomicina a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO 2.
  2. HUVEC caratterizzazione.
    1. Caratterizzare HUVEC isolate in termini della loro capacità funzionale di costruire tubi nella matrice membrana basale (ad esempio, matrigel) e la loro espressione del CD31 marcatore endoteliale (piastrine endoteliali molecola di adesione delle cellule, PECAM-1) seguendo protocolli standard 30, 31.

3. trasfezione

  1. Trypsinize la coltura madre HUVEC (vedere fase 4.1.2.) E contare manualmente le cellule utilizzando un emocitometro. Inizializzare il HUVEC su piatti di plastica coltura cellulare e di dimensioni adeguate, con una densità cellulare di partenza di circa 13.000 cellule / cm 2 di superficie di crescita, 48 h prima della trasfezione fino a raggiungere il 70-80% di confluenza.
  2. Preparare fresco miR / PEI / MNP complessi ogni volta.
    NOTA: In primo luogo, i complessi miR / PEI dovrebbero essere ottenuti (scala 3.2.1 - 3.2.3); successivamente, MNPs dovrebbero essere aggiunti alla soluzione miR / PEI (fase 3.2.4) per ottenere la formulazione finale miR / PEI / MNP utilizzato per la trasfezione (passo 3.3).
    1. Calcolare la quantità di appropriata miR commercialmente disponibile (disallineato etichettato o funzionale, vedere il passaggio 4) con la concentrazione del magazzino fornito dal produttore. Utilizzare 2,5 pmol di miR / cm 2 di superficie di crescita delle cellule. Diluire il miR in soluzione glucosata al 5% per obtain una concentrazione finale di 0,125 pmol di miR / ml.
    2. Sulla base della quantità miR dal punto 3.2.1 e il rapporto ottimale NP di 25 32, calcolare la quantità richiesta di PEI usando la sua concentrazione misurata (fase 1.1.2). Diluire il PEI (per il volume richiesto calcolato) in un volume uguale di soluzione di glucosio 5%. Aggiungere il ottenuto pre-diluito PEI alla soluzione miR (dal punto 3.2.1) e agitare la miscela ottenuta per 30 s.
    3. Incubare la miscela miR / PEI ottenuta per 30 minuti a RT.
    4. Sonicare il MNPs a 35 kHz per almeno 20 minuti nel bagno d'acqua sonicating (vedere l'elenco dei materiali) a temperatura ambiente, aggiungere la giusta quantità di soluzione di MNP al miR / PEI (5-25 mg di ferro / mL di preparato miR / PEI / miscela MNP 16), vortex per 30 s, e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente fino al momento.
  3. Aggiungere il preparato miR / PEI / MNP miscela a gocce direttamente al mezzo di coltura delle cellule. Utilizzare la miscela risultante di cul cellulemedia tura con miR / PEI / MNP diluito in glucosio come la soluzione di trasfezione. Sostituire questa miscela con il fresco terreno di coltura 6 ore dopo la trasfezione.

4. Analisi di vettore di sicurezza

  1. Esame della vitalità cellulare.
    1. Trasfezione delle cellule HUVEC seminate in una piastra di coltura a 24 pozzetti (fasi 3.1 e 3.2); utilizzare Cy3-miR come i puntali e codificate miR (SCR-MIR) come le sonde set comando per la citometria di flusso. Incubare a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO 2 per 24 h.
    2. Raccogliere il surnatante e cellule trasfettate mediante tripsinizzazione utilizzando 1x Tripsina-EDTA diluito in PBS aggiunto alle cellule per 4 minuti a 37 ° C. Centrifugare a 300 xg per 10 min e utilizzare per l'analisi.
    3. Esaminare la vitalità delle cellule e l'efficienza di assorbimento miR 24 ore dopo la trasfezione mediante citometria a flusso mediante l'applicazione di una macchia disponibile in commercio per distinguere tra vita / le cellule morte; utilizzare protocolli standard 15 . Applicare le cellule untransfected come controllo positivo per la vitalità.
  2. Esaminare la sicurezza dei complessi miR / PEI / MNP per le cellule in test funzionali.
    1. Valutare l'attività proliferazione delle cellule trasfettate.
      1. Transfect HUVEC seminate in una piastra di coltura 12 pozzetti (fasi 3.1 e 3.2) e antisenso funzionale miR (ad esempio, anti-miR92a per HUVECs 31) ed incubare a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO 2 per 24 h.
      2. Utilizzare un kit disponibile in commercio per definire il numero di cellule proliferanti dalla colorazione con EdU (5-etinil-2'-deossiuridina) e la scansione con la microscopia confocale laser-based. Utilizzare le seguenti impostazioni: microscopia obiettivo 40X con immersione in olio; laser di eccitazione 633 nm (per un colorante 647 nm); 5 campi aleatori da registrare in ogni campione. Calcolare il tasso di cellule proliferanti dividendo il numero di nuclei EdU macchiati per il numero totale nuclei (Hoechst-macchiato).
    2. Valutare la capacità delle cellule trasfettate per formare strutture tube-like, come descritto in precedenza 17, 31.
      1. Trasfezione delle cellule HUVEC seminate in una piastra di coltura a 24 pozzetti (fasi 3.1 e 3.2) con SCR-miR e incubare per 48 ore a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO 2. Raccogliere le cellule trasfettate (come al punto 4.1.1).
      2. Seme 3,5 x 10 4 cellule HUVEC modificati in piastre da 24 pozzetti rivestiti con 140 ml di matrice membrana basale. Incubare per 18 ore a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO 2.
      3. registrare le immagini di 10 campi casuali in ogni scansione laser e usando la microscopia confocale (interferenza differenziale contrasto) e analizzare utilizzando il software ImageJ con il plugin "Angiogenesi Analyzer". Includere tali parametri come la lunghezza totale di rami, il numero di rami, e il numero di junctions nella valutazione. Confrontare questo al controllo non trattato.
  3. Esaminare la possibile influenza tossica di complessi trasfezione in gap giunzione (GJ) mediata comunicazione intercellulare (GJIC) verificando recupero di fluorescenza dopo photobleaching 3D (FRAP) 33 in 3D.
    1. Seme le cellule su vetrini rivestiti di gelatina con un fondo sottile adatto per l'imaging live-cell (immersione in olio). Trasfezione delle cellule come sopra descritto nello stadio 3.2 con-etichettato, non funzionale miR (SCR-MIR) e incubare per 24 h.
    2. Preparare le cellule per l'imaging caricandoli con calceina direttamente prima microscopia. In particolare, sostituire il mezzo di coltura con terreno fresco contenente 5 mM calceina, incubare per 20 minuti, lavare con PBS, e aggiungere terreno di coltura fresco. Pre-riscaldare l'incubatore del microscopio a 37 ° C e regolare la concentrazione di CO 2 al 5%.
      NOTA: Tutti i reattivi devono essere caldo per evitare Contrac cellularezione prima della misurazione.
    3. Utilizzare un laser di eccitazione 561 nm per la visualizzazione delle cellule e l'esperimento FRAP. In primo luogo, selezionare manualmente le celle per la misurazione come regioni di interesse (ROI); celle di prova devono avere almeno 3 celle vicine. Definire una cella di riferimento con brillante, fluorescenza stabile che non saranno sbiancato. Definire i limiti di un z-stack. Registrare la fluorescenza dalla parte superiore delle celle verso il basso per includere 10 - 15 strati.
    4. Candeggiare le celle di prova utilizzando 100% della potenza del laser e registrare il successivo recupero di fluorescenza (a causa del trasferimento dei colori GJ-specifica da cellule vicine) durante il successivo 15 min. Registrare i dati grezzi nelle z-stack ogni 60 s. In totale, effettuare le misure FRAP con non meno di 5 - 10 celle di prova per esperimento. Confrontare i risultati alle cellule non trasfettate.

5. Test di Transfection efficienza

  1. Esame di miR assorbimento.
    1. Preparare le sonde descritte in step 4.1 e utilizzarli contemporaneamente per definire miR captazione con la citometria di flusso.
  2. Confermare e descrivere la localizzazione intracellulare di complessi trasfezione confocale e super-risoluzione illuminazione strutturata microscopia (SIM).
    1. Inizializzare il HUVEC su vetrini rivestiti di gelatina posti in pozzetti di piastre di coltura da 24 pozzetti, come descritto in precedenza (passo 3.1). Trasfezione delle cellule con 3-colore marcato miR / PEI / MNP (passo 1.4) e incubare per 24 ore a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO 2.
    2. Lavare i coprioggetti prima con il 2% di albumina di siero bovino (BSA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi con solo PBS. Fissare cellule incubando a 4% paraformaldeide (PFA) a 37 ° C per 15 min e macchia nuclei con DAPI seguenti protocolli standard 16. Lavare 3 volte l'agitatore (15 min ciascuna) per rimuovere il colorante in eccesso.
      NOTA: PFA è cancerogeno e deve essere maneggiato con cura.
    3. Posizionare il prcoprioggetti epared sui vetrini con adatto mezzo di fissaggio, lasciarli asciugare almeno per 1 h, e li usa per la microscopia, come descritto di seguito.
    4. Acquisire immagini utilizzando un obiettivo ad immersione 63X e le seguenti impostazioni: SIM 405-, 488-, 561-, e linee laser 633 nm per eccitazione; Modalità z-stack con una profondità di 32 bit a 5 angoli, 5 fasi, con una media di 4; griglia G2 con una linea 405 laser, G3 con 488, G4 con 561, e G5 con 633.
  3. Valutare la funzionalità del miR consegnato da RT-qPCR in miR / PEI / MNP-HUVECs rispetto non trattata.
    1. Trasfezione delle cellule HUVEC seminato in 12 pozzetti gradini piastra di coltura (3.1 e 3.2) con antisenso funzionale miR (ad esempio, anti-miR92a per HUVEC 31) ed incubare per 48 ore a 37 ° C in atmosfera fi cata umidificazione contenente 5% di CO 2.
    2. Valutare la consegna anti-miR92a e lavorazione con RT-qPCR utilizzando kit disponibili in commercio (vedere i materiali); seguire tlui le istruzioni del produttore, come descritto altrove 17, 31. In parallelo, esaminare l'espressione del gene bersaglio (per esempio, ITGA5 31).
      NOTA: consegna antagomir contro endogena miR è preferito rispetto imita quanto garantisce la misura del risultato reale del miR e non soltanto l'accumulo intracellulare.

6. cellulare Targeting Valutazione e separazione cellulare magnetica

  1. Cella di targeting in condizioni statiche in vitro.
    1. Trasfettare le cellule HUVEC in una piastra a 24 pozzetti (2,5 pmol / cm 2 SCR-miR, NP 25, e 15-25 ug / mL MNP), incubare per 24 h, lavare, e raccogliere come descritto in precedenza (fase 4).
    2. Mescolare il pellet cellulare ottenuto da 1 bene con 1 ml di terreno di coltura fresco e posizionarlo nei pozzetti di una piastra 12 pozzetti. Fissare un piccolo magnete localmente (sul lato) nella parte inferiore della piastra con nastro.
    3. Incubare la sospensione cellulare per 24 h ed osservare l'attaccamento cellulare e la crescita nella zona sopra il magnete e l'area senza un magnete. Per una valutazione qualitativa, utilizzare un microscopio invertito convenzionale.
  2. Cellulare targeting in condizioni dinamiche simulate in vitro.
    1. Trasfettare le cellule HUVEC in una piastra a 24 pozzetti a passi 3.1 e 3.2 (2.5 pmol / cm 2 Cy3-miR, NP 25 e 15 - 25 ug / mL MNP), incubare per 24 ore, lavate, e raccogliere mediante tripsinizzazione utilizzando 1x tripsina-EDTA diluito in PBS aggiunto alle cellule per 4 minuti a 37 ° C. Centrifugare a 300 xg per 10 min.
    2. Mescolare il pellet cellulare ottenuto da 1 bene con 1 ml di terreno di coltura fresco e posizionarlo nella pozzetto di una piastra 12 pozzetti. Fissare un piccolo magnete in locale (sul lato di un pozzo) con del nastro. Posizionare la piastra di coltura su shaker e incubare la sospensione cellulare per 12 ore a 150 rpm per simulare condizioni dinamiche 34.
    3. Lavare le cellule e fissareutilizzando 4% PFA. Macchiare i nuclei con DAPI 16. Registrare l'adesione cellulare mediante scansione laser confocale con un laser di eccitazione 514 nm, modalità z-stack (5 - 12 fette) per ottenere dati grezzi, e massima elaborazione dell'immagine di proiezione per creare immagini per analisi.
  3. analisi quantitativa di cellule magneticamente sensibili e non reattivi.
    1. Trasfettare le cellule HUVEC in una piastra a 24 pozzetti (2,5 pmol / cm 2 SCR-miR, NP 25, e 15-25 ug / mL MNP), incubare per 24 ore, lavate, e raccogliere come descritto in precedenza (fase 6.2.1) . Pre-caldo PBS e cellule buffer di scelta (sterilizzato per filtrazione, vedere l'Elenco materiali) a 37 ° C. Risospendere il pellet cellulare ottenuto da ogni pozzetto con 500 microlitri di tampone smistamento cellulare.
    2. Applicare questa sospensione cellulare a una magnetiche colonne ordinamento fissati dal magnete fornita, lavare le colonne sul magnete 3 volte con tampone di cellule fresche di smistamento, e raccogliere il flusso attraverso il magnetiCally frazione non risponde (MAG).
    3. Rimuovere le colonne del magnete e immediatamente raccogliere la frazione di cellule magneticamente sensibile (MAG +) spingendo tampone fresco cell sorting attraverso la colonna utilizzando uno stantuffo.
    4. Centrifuga sia MAG e MAG + a 300 xg per 10 min. Risospendere il pellet cellulare in PBS, contare le cellule, e valutare la vitalità cellulare con Trypan saggio di esclusione del blu 35. Utilizzare il pellet cellulare ottenuto o per analisi a lungo termine (cioè, ri-seme e valutare dopo 24, 48, e 72 ore in coltura 17) o direttamente per citometria a flusso (passo 4.1.).
  4. Definire il sovraccarico di ferro delle cellule trasfettate.
    NOTA: Durante la preparazione, qualsiasi contatto delle sonde cellulari con materiali e strumenti di ossido di ferro deve essere evitata.
    1. Raccogliere le cellule HUVEC trasfettate e trasfettate controllo (come al punto 4.1.1). Lavare le cellule raccolte due volte in 2% BSA in PBS 36 b y mescolando accuratamente le cellule con 1 ml di questa soluzione di lavaggio e poi centrifugazione a 300 xg per 10 min. Risospendere il pellet cellulare ottenuto in 250 ml di PBS, aggiungere 100 ml di 4% PFA, e incubare per 20 min per fissare le cellule. Lavare 3 volte con PBS, come descritto sopra.
    2. Risospendere il pellet cellulare fisso con conseguente 110 ml di PBS e trasferirlo 100-ml provette PCR.
      1. Prendere aliquote di 10 microlitri per il conteggio delle cellule e utilizzare il campione restante per spettroscopia particella magnetica (MPS).
    3. Eseguire la misurazione su un dispositivo MPS disponibile in commercio. Durante la misurazione, applicare le seguenti impostazioni: campo magnetico di azionamento B = 25 mT e frequenza f 0 = 25 kHz. Per ferro quantificazione dei campioni, normalizzare la terza armonica A 3 della MPS spettro al corrispondente A 3, ref di un campione di riferimento MNP con una quantità di ferro noto di 2,1 ugxref "> 37. Utilizza cellule non trattate come controlli.

7. Limiti Definizione MRI Detection

  1. preparazione cellulare.
    1. HUVEC seme in una piastra a 6 pozzetti e trasfezione (2,5 pmol / cm 2 SCR-miR, NP 25 e 15 - 25 ug / mL MNP) in duplicati o triplicati in conformità con la quantità di cellule (per la preparazione phantom). Incubare le cellule per 24 ore e lavare, raccogliere, e fissarle con 4% PFA, come descritto in precedenza (fase 4).
    2. Contare le cellule ottenute, preparare aliquote con numero di cellule appropriate (ad esempio, 10 3, 10 4, 10 5, etc.), e regolare il volume a 50 microlitri.
  2. Preparazione phantom Agarosio
    1. Preparare diversi strati di 2% agarosio in provette da 50 ml con diverse quantità di cellule transfettate incorporate tra gli strati 38. Durante la preparazione, ultrasuoni e centrifugare l'agarosio caldo 38 adistruggere le bolle d'aria che causano artefatti.
      NOTA: È importante sottolineare che, fantasmi contenenti 5.5 x 10 5 cellule HUVEC trattate con amagnetici complessi miR / PEI dovrebbero essere preparati nello stesso modo per servire come controlli.
  3. Scan La ottenuti in vitro fantocci con un sistema MRI 7.1 T animale dopo aver posizionato il fantasma centralmente nella bobina, parallela alla asse z del campo magnetico.
    1. Applicare i seguenti parametri della sequenza di acquisizione sequenza gradiente-echo: TR = 66 ms; TE 1/2 TE / TE 3 / TE 4/5 TE / TE 6 = 1.44 / 2.88 / 4.51 / 6.11 / 7.60 / 9.01 ms; flip angle = 3 °; matrix = 128 × 128, interpolata a 256 x 256; campo visivo = 42 mm; 100%; medie = 1, eco lunghezza del treno = 1; spessore di strato = 1,5 mm e 16 fette.
    2. Valutare il decadimento di tutti i quattro tempi di eco del segnale e calcolare le mappe R2 * (R2 * = 1 / T2 *) utilizzando il software appropriato, come descritto altrove 39.

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Risultati

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Lo scopo principale del protocollo proposto è di produrre risposte magnetiche cellule miR-modificati e condurre loro caratterizzazione accurata (Figura 1). Di conseguenza, le cellule in modo efficiente trasfettate, sensibili alla selezione magnetica e di orientamento e rilevabili con la risonanza magnetica, devono essere ottenuti.

In primo luogo, le identità di HUVEC isolati sono stati confermati mediante colo...

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Discussione

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La produzione di cellule geneticamente modificate cariche di nanoparticelle superparamagnetiche per la loro guida ulteriormente magneticamente controllato è presentato nel protocollo corrente. L'applicazione di successo di questa strategia consente la risoluzione di alcune difficoltà di terapia cellulare, come la bassa ritenzione e poveri attecchimento nella zona lesa 2, 3, 4, realizzando un prodotto cellulare targeting per...

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Dichiarazioni

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Noi non abbiamo concorrenti interessi finanziari da dichiarare.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare G. Fulda (Microscopia Elettronica Center, Università di Rostock, Germania) per il supporto tecnico ad acquisire immagini TEM di nanoparticelle superparamagnetiche filtrati e nello svolgimento loro analisi ai raggi X. Il lavoro svolto presso la RTC Rostock è stato sostenuto dal Ministero federale dell'Istruzione e della Ricerca Germania (FKZ 0312138A, FKZ 316159 e VIP + 03VP00241) e lo Stato Meclemburgo-Pomerania occidentale con i Fondi strutturali dell'UE (FSE / IV-WM-B34- 0030/10 e FSE / IV-BM-B35-0010 / 12) e dalla DFG (dA 1296-1), l'umidità-Fondazione, e la Heart Foundation tedesco (F / 01/12). Frank Wiekhorst è stato sostenuto dal programma di ricerca dell'UE del 7 ° PQ "NanoMag" FP7-NMP-2013-LARGE-7.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinaThermo Scientific21335
PD-10 Colonne di desalinizzazioneGE Healthcare17085101contenente Sephadex G-25 Soluzione di
reagente di ninidrina media 2%Sigma Aldrich7285
GlycineSigma Aldrich410225
Kit di quantificazione della biotina PierceThermo Scientific28005
Lettore di micropiastre Modello 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Particelle paramagnetichePromegaZ5481
Filtro PVDF Millex-HVMerckSLHV013SL0,45 &; m
Libra 120 microscopio elettronico a trasmissioneZeissTensione di accelerazione 120  Rivelatore
di raggi X kV ZaffiroEDAX-Amatek
Plastica per colture cellulariTPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kitMirus BioMIR 9650
Biotina Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
Collagene Tipo IV GibcoThermo Scientific17104019
Terreno di crescita endoteliale, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
Penicillina/StreptomicinaThermo Scientific15140122100 U/mL, 100 µ g/mL
MatrigelBD Biosciences356234
anticorpo anti-PECAM-1Santa Cruzsc-1506
MS MACS colonneMiltenyi Biotec 130-042-201
Kit per coloranti di cellule vive/morte nel vicino infrarossoThermo ScientificL10119
Cy3 Controllo negativo pre-miR marcato con coloranteThermo ScientificAM17120"Cy3-miR" o "Cyanine-miR3" nel manoscritto
Molecole precursori pre-miRNA pre-miR - Controllo negativo Thermo ScientificAM17110"scr-miR" nel manoscritto
Anti-has-miR92a-3p inibitore sinteticoThermo ScientificAM10916
Sistema LSM 780 ELYRA PS.1Zeiss
ParaformaldeideSigma Aldrich158127soluzione al 4% in
PBS DAPI colorante nucleareThermo ScientificD1306
Kit di isolamento dell'RNA NucleoSpinMachery-Nagel740955
mirVana Kit di isolamento miRNAThermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNAThermo Scientific4366596
StepOnePlus Sistema di PCR in tempo realeApplied Biosystems
trascrizione inversa di cDNA ad alta capacitàThermo Scientific4368814
has-miR-92a TaqMan assayThermo Scientific000431Sequenza miRNA matura: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan assayThermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan assayThermo Scientific001093
18S rRNA Controllo endogenoThermo Scientific4333760F
GelatinaSigma AldrichG7041
CellTrace Calceina Rosso-ArancioThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
tampone MACSMiltenyi Biotec 130-091-221
AgarosioSigma AldrichA9539
7.1 Tesla sistema di risonanza magnetica animaleBruker CorporationA7906
Software ImageJNational Institutes of Healthaggiornato con un dispositivo AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPSSoftware Bruker Biospin
MatlabMathworks
Anello Magnete Neodimo magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm; la rimanenza è ~ 1,3  T, coercitività ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit di imagingThermo ScientificC10340
Reagente FluorSaveMerck345789
Bagno a ultrasuoniBandelin elettronicoTipo: RK 100 SH
Kit di trascrizione inversa Kit di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  3. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
  4. Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  5. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
  6. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27(2012).
  7. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
  8. Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  9. Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
  10. Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
  11. Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
  12. Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
  13. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
  14. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023(2016).
  15. Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  16. Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
  17. Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
  18. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  19. Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
  20. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  21. Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
  22. Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
  23. Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
  24. Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23(1965).
  25. Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
  26. Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
  27. Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
  28. Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159(2015).
  29. Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
  30. Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30(2009).
  31. Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
  32. Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
  33. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  34. Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
  35. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
  36. Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
  37. Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
  38. Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
  39. Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
  40. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
  41. Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85(2008).
  42. Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
  43. Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184(2015).
  44. Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
  45. Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
  46. Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
  47. Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
  48. Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
  49. Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
  50. Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
  51. Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149(2013).
  52. Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
  53. Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
  54. Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  55. Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).

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