Articolo metodologico

Espressione proteica ricombinante, cristallizzazione e studi biofisici di a Bacillus -conservato nucleotide pirofosforilasi, BcMazG

DOI:

10.3791/55576

⸱

16 maggio 2017

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

In questo articolo

Sommario

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Bacillus anthracis è il patogeno obbligato di antrace fatale inalatorio, per cui studi di geni e proteine ​​sono strettamente regolamentati. Un approccio alternativo è quello di studiare geni ortologi. Descriviamo studi biofisicochimici di un B. ortologo di B. anthracis in B. cereus , bc1531, che richiede una minima quantità di apparecchiature sperimentali e mancano gravi preoccupazioni di sicurezza.

Abstract

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Per superare le restrizioni e le normative di sicurezza nello studio di geni e proteine ​​da veri agenti patogeni, è possibile studiare i loro omologhi. Bacillus anthracis è un patogeno obbligato che provoca l'antrace fatale inalatorio. Bacillus cereus è considerato un utile modello per studiare B. anthracis a causa della sua stretta correlazione evolutiva. Il cluster gene ba1554 - ba1558 di B. anthracis è altamente conservato con il cluster bc1531 - bc1535 in B. cereus , così come con il cluster bt1364 - bt1368 in Bacillus thuringiensis, indicando il ruolo critico dei geni associati nel genere Bacillus . Questo manoscritto descrive metodi per preparare e caratterizzare un prodotto proteico del primo gene ( ba1554 ) dal cluster di gene in B. anthracis utilizzando una proteina ricombinante del suo ortologo in B. cereus , bc1531.

Introduzione

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L'espressione della proteina ricombinante è ampiamente utilizzata per superare i problemi associati a fonti di proteine ​​naturali, quali limitate quantità di proteine ​​e contaminazioni nocive. Inoltre, negli studi sui geni patogeni e sulle proteine, può essere utilizzato un ceppo di laboratorio alternativo che non richiede ulteriori precauzioni di sicurezza. Ad esempio, Bacillus cereus è un modello utile per studiare Bacillus anthracis a causa della loro stretta relazione evolutiva 1 .

B. anthracis è un patogeno obbligatorio che provoca l'antrace fatale per via inalatoria negli esseri umani e nel bestiame e può essere potenzialmente utilizzato come bioweapon 2 . Pertanto, gli studi di laboratorio su B. anthracis sono strettamente disciplinati dai centri statunitensi per il controllo delle malattie, che richiedono pratiche di livello di biosicurezza 3 (BSL-3), che prevedono che l'area di laboratorio sia segregata con una pressione negativa della stanza. A differenza di B. anthracis , B. cereus è classificato come agente BSL-1 e quindi ha minime preoccupazioni di sicurezza. B. cereus è un patogeno opportunistico che, dopo l'infezione, provoca avvelenamenti alimentari che possono essere trattati senza assistenza medica. Tuttavia, poiché B. cereus condivide molti geni critici con B. anthracis , le funzioni delle proteine ​​di B. anthracis possono essere studiate utilizzando gli omologhi corrispondenti di B. cereus 1 .

Il cluster di gene ba1554 - ba1558 di B. anthracis è altamente conservato con il cluster bc1531 - bc1535 Di B. cereus , così come con il cluster bt1364-bt1368 di Bacillus thuringiensis , in termini di organizzazione e sequenza del gene. Inoltre, i primi geni ( ba1554 , bc1531 e bt1364 ) dei rispettivi cluster sono assolutamente conservati ( cioè l' identità della sequenza nucleotidica del 100%), implyiUn ruolo critico del prodotto genico nelle specie di Bacillus . A causa della sua collocazione in questi cluster di geni, ba1554 è stato erroneamente identificato come un regolatore di trascrizione supposto 3 . Tuttavia, l'analisi della sequenza di aminoacidi del prodotto ba1554 indica che appartiene alla famiglia MazG, che ha attività di pirofosfosforrolasi nucleotidica e non è associata all'attività del fattore di trascrizione 4 , 5 . Sebbene le proteine ​​appartenenti alla famiglia MazG siano diverse rispetto alla sequenza e alla lunghezza complessiva, condividono un dominio MazG con un residuo di 100 residui caratterizzato da un motivo EXXE 12-28 EXXD ("X" indica qualsiasi residuo di aminoacidi e il numero Indica il numero di residui X).

Il dominio MazG non sempre rappresenta direttamente una certa attività catalitica. Un membro MazG di Escherichia coli (EcMazG) possiede due domini MazG, ma suIl dominio C-terminale MazG è enzimaticamente attivo 6 . Inoltre, la specificità del substrato degli enzimi MazG varia da non-specifici nucleosid trifosfati (per EcMazG) a specifici dCTP / dATP (per MazG associati all'integrina) e dUTP (per dUTPasi) 6 , 7 , 8 , 9 . Pertanto, sono necessarie analisi biofisico-chimiche della proteina BA1554 per confermare l'attività NTPase e decifrare la sua specificità del substrato.

Qui forniamo un protocollo passo dopo passo che la maggior parte dei laboratori senza un impianto BSL-3 può seguire per caratterizzare il prodotto proteico del gene B. cereus bc1531 , che è un ortologo di B. anthracis ba1554 , a livello molecolare. Brevemente, il ricombinante BC1531 (rBC1531) è stato espresso in E. coli e purificato utilizzando un tag di affinità. Per gli esperimenti cristallografici a raggi X, i cristalliZione delle proteine ​​rBC1531 sono state proiettate e ottimizzate. Per valutare l'attività enzimatica del rBC1531, l'attività di NTPase è stata monitorata in modo colorimetrico per evitare nucleotidi etichettati radioattivamente che sono stati convenzionalmente utilizzati. Infine, le analisi dei dati biofisicochimici ottenuti ci hanno permesso di determinare lo stato di oligomerizzazione e i parametri catalitici di rBC1531, così come ottenere dati di diffrazione dei raggi X dal cristallo rBC1531.

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Protocollo

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1. Produzione e purificazione della proteina ricombinante di rBC1531

  1. Preparazione di un plasmide di espressione ricombinante BC1531 (rBC1531)
    1. Preparare il DNA genomico di B. cereus 10 .
    2. Amplificare il gene bc1531 da un template del DNA genomico B. cereus mediante reazione a catena polimerica (PCR), utilizzando primer avanti e indietro (vedi Elenco materiali) per creare siti di enzimi di restrizione Bam HI e Sal I rispettivamente 10 .
    3. Digestare il prodotto PCR e un vettore pET49b modificato (pET49bm) utilizzando Bam HI e Sal I, come descritto 11 .
    4. Mescolare il prodotto PCR digerito e il vettore (rapporto 3: 1) dal punto 1.1.3 utilizzando ligasi di T4 DNA in una reazione di 10 μL, come descritto 11 . Incubare a 18 ° C per 30 min.
    5. Pipettare 3 μL della reazione di legatura in 50 μL di chemicaLe cellule E. coli DH5α competenti in un tubo. Mescolare delicatamente pipettando su e giù e posto sul ghiaccio per 30 minuti. Scossa termica per 45 s a 42 ° C. Aggiungere 1 ml di mezzo Luria-Bertani (LB) e coltivare le cellule mentre si agita vigorosamente (250 rpm, 37 ° C, 45 min).
    6. Prendere 100 μL delle cellule trasformate dal punto 1.1.6 e spargerle sulle piastre LB-agar con 100 μg / mL kanamicina (Kan). Incubare per ~ 18 h a 37 ° C.
    7. Raccogliere le colonie utilizzando una punta sterile e coltivare le cellule in 3 ml di mezzo LB con 100 μg / mL Kan; Agitare energicamente (250 giri / min, 37 ° C, 18 h).
    8. Preparare il DNA del plasmide utilizzando un metodo di lisi alcalino-SDS, come descritto 10 .
    9. Confermare la sequenza nucleotidica del costrutto di espressione rBC1531 utilizzando il sequenziamento del DNA 12 .
  2. Sovrapressione della proteina rBC1531
    1. Ri-trasformare il ceppo E. coli BL21 (DE3) con rBC1531-expPlasmide di rase, come descritto nei passaggi 1.1.5-1.1.6, per sovraespressione.
    2. Selezionare una colonia e svilupparla in 10 ml di mezzo LB contenente 50 μg / mL Kan (LB + Kan); Agitare energicamente per 18 ore a 37 ° C.
    3. Inoculare 10 ml di coltura durante la notte in 1 L di LB + Kan media e crescere a 37 ° C fino a quando il OD 600 (densità ottica a 600 nm) raggiunge ~ 0,7.
    4. Immergere la coltura in acqua ghiacciata per ~ 15 min per raffreddare la temperatura a 18 ° C e aggiungere isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) alla coltura a una concentrazione finale di 1 mM per l'espressione della proteina ricombinante. Crescere la coltura a 18 ° C per un ulteriore ~ ​​16-18 h.
  3. Purificazione di rBC1531
    1. Raccogliere le cellule per centrifugazione (5.000 xg, 4 ° C, 30 min). Scartare con attenzione il surnatante in modo da non disturbare le cellule. Riassemblare le cellule in 50 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) contenente 10 mM imidazolo.
    2. Lyse le cellule due volte per sonicazione su ghiaccio per evitare il sovratemperatura dei lisati delle cellule (tempo: 2 min 30 s; ciclo: 5 s; ciclo spento: 10 s; ampiezza: 38%).
    3. Eliminare il lisato cellulare per centrifugazione (~ 25.000 xg, 4 ° C, 30 min).
    4. Mescolare 3 mL di branelli di nichel e 60 mL di PBS contenente 10 mM imidazolo e portare a gravità il tampone supplementare per sistemare i branchi di nichel equilibrati in una colonna di vetro di cromatografia di 2,5 x 10 cm.
    5. Pipettare per trasferire il surnatante dal punto 1.3.3 alla colonna con branelli di nichel pre-equilibrati e incubare a 4 ° C per 2 ore su una ruota di filatura a bassa velocità (~ 20 rpm).
    6. Lasciare che il surnatante venga scaricato per gravità e lavare le colonne di nickel nella colonna tre volte con 100 ml di PBS contenente 10 mM imidazolo.
    7. Elute rBC1531 proteina applicando 4 x 5 ml di PBS contenente 250 mM imidazolo.
    8. Prendere 15 μL dell'eluzione dal punto 1.3.7 e farla funzionare sul 15% SDS-PAGE. Visualizzare le bande proteicheIl gel con colorazione blu di Coomassie 10 .
  4. Rimozione dei tag di affinità della proteina rBC1531 mediante proteolisi di trombina
    1. Pipettare le frazioni nel tubo di dialisi (peso molecolare tagliato: 3 kDa) e collocare il tubo in un bicchiere contenente 4 l di tampone compatibile a tamponi di tampone (20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl e 1,5 mM β-mercaptoetanolo) A 4 ° C per una notte.
    2. Pipettare le frazioni e trasferirle in un tubo conico.
    3. Misurare l'assorbanza a 280 nm e stimare la concentrazione proteica rBC1531, come descritto 13 .
    4. Prendere 50 μg di rBC1531 in un tubo da 0,5 ml e aggiungere varie quantità di trombina ( ossia 2, 1, 0,6 e 0,3 unità). Incubare le reazioni di rBC1531 e trombina a 20 ° C per ~ 3 h per determinare la minima quantità di trombina necessaria per eliminare il tag N-terminale di affinità.
    5. Eseguire le reazioni rBC1531 e trombina su un 15%SDS-PAGE e determinare la minima quantità di trombina ( ad esempio, 0,3 unità di trombina per 50 μg di rBC1531) che digerisce completamente il tag N-terminale di affinità e produce un tag senza rBC1531.
    6. Aggiungere 10 mg di proteina rBC1531 e 60 unità di trombina a un tubo da 15 mL e incubare a 20 ° C per circa 3 ore per la reazione di trombina-proteolisi.
    7. Applicare gli standard di filtrazione del gel a una colonna di cromatografia di esclusione (SEC) per preparare una curva standard dei pesi molecolari e dei volumi di eluizione, come descritto 13 .
    8. Posizionare la proteina rBC1531 digerita da trombina dal punto 1.4.6 in un tubo filtrante centrifugo (peso molecolare tagliato: 3 kDa) e centrifugare a 3.000 g a 4 ° C per ridurre a un volume inferiore a 5 ml.
    9. Applicare la proteina concentrata rBC1531 alla colonna SEC e raccogliere 60 frazioni eluite in 0,5 mL per tubo 13 .
    10. Prendere 15 μL di ciascuna frazione, eseguirli su una SDS-PAGE del 15% e staiN il gel utilizzando la soluzione di colorazione Coomassie (0,15% (w / v) blu brillante Coomassie, 40% (v / v) metanolo e 10% (v / v) acido acetico glaciale) come descritto 10 .
    11. Pipettate le frazioni che contengono rBC1531 e li raccolgono in un tubo.

2. Screening e ottimizzazione di cristallizzazione di rBC1531

  1. Condizioni di screening per la cristallizzazione della proteina rBC1531
    1. Concentrare il rBC1531 dal punto 1.4.11 fino a ~ 18,5 mg / mL utilizzando un tubo filtrante centrifugo, come descritto nel passaggio 1.4.8.
    2. Aggiungere 50 μL di ciascuna soluzione di screening di cristallizzazione (vedere la sezione 2.2) 14 ai pozzetti delle piastre di cristallizzazione a sedere a 96 pozzetti. Posizionare 0,5 μL della soluzione proteica rBC1531 da 18,5 mg / ml su un letto seduto. Mescolare la soluzione proteica con 0,5 μL della soluzione del pozzetto, ripetendo il processo per l'intera piastra.
    3. Coprire la piastra con una pellicola adesiva chiara.Posizionare le piastre a 96 pozzetti a 18 ° C e consentire la diffusione del vapore.
    4. Scansione delle gocce a ingrandimento 20-40X utilizzando un microscopio leggero per monitorare la formazione di cristallo ogni giorno per 2-3 settimane.
    5. Raccogliere i dati di diffrazione dei raggi X utilizzando i cristalli ottenuti con rBC1531 proteina.
  2. Ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione rBC1531
    1. Preparare 500 μl della soluzione di condizione di cristallizzazione iniziale selezionata ( es. 0,1 M sodio cacodilato, pH 6,5 e 1,0 M citrato di sodio) e riempire una piastra di cristallizzazione a 24 pozzetti per la caduta di seduta.
    2. Aggiungere 0,5 μL della soluzione proteica rBC1531 da 18,5 mg / ml a un letto seduto, mescolare con 0,5 μL della soluzione di pozzetto e coprire immediatamente la piastra con un film adesivo chiaro. Mettere la piastra a 18 ° C.
    3. Osservate la crescita del cristallo sotto un microscopio leggero per una settimana.
    4. Ottimizzare varie condizioni di cristallizzazione variando il pH ( es, PH 5,5-6,8) di 0,1 M cacodilato e modificando la concentrazione di sale ( cioè 0,9-1,2 M) di citrato di sodio per ottenere singoli cristalli. Monitorare la crescita del cristallo per ~ 1 settimana e raccogliere i dati di diffrazione dei raggi X 12 .

3. Caratterizzazione dell'attività di trifosfatasi nucleosidica (NTPase) di rBC1531

  1. Validazione dello studio colorimetrico inorganico fosfato-dipendente
    1. Preparare uno stadio di pirofosfato (100 mM) e diluire fino a concentrazioni finali di 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 e 250 μM in 200 μl di tampone di reazione (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 MM NaCl e 2 mM MgCl2) in duplicati a 96 pozzetti. Utilizzare la prima piastra come un controllo (questo non contiene pirofosfatasi). Assicurarsi che la seconda piastra contiene pirofosfatasi come piastra di lavoro, come indicato nella fase 3.1.2.
    2. Aggiungere 0,01 unità di Saccharomyces cerevisiae inorganico pYrofosfatasi (1 μL) ai pozzetti della piastra di lavoro e incubare a 20 ° C per 30-60 minuti.
    3. Preparare la soluzione di acido molibdato mescolando le soluzioni di molibdato di ammonio (0,86% v / v) e acido ascorbico (14% v / v) in un rapporto 7: 3. Aggiungere 16 μL di soluzione di acido molibdato a entrambi i pozzetti di lavoro e di controllo e attendere 15 min.
    4. Leggere la densità ottica a 690 nm (OD 690nm ).
  2. Analisi colorimetrica NTPase
    1. Preparare uno strato di substrato nucleosidico trifosfato (NTP) di 100 mM e diluire fino alla concentrazione desiderata ( es. 0, 0,2, 4,4,11,22,44,88, o 132 μM) in 180 μl di tampone di analisi (20 mM HEPES, PH 7,4, 150 mM NaCl e 2 mM MgCl2).
    2. Aggiungere 20 μg di rBC1531 (1,5 mM) e i substrati NTP dalla fase 3.2.1 fino a 200 μL per reazione in una piastra a 96 pozzetti e pipettare verso l'alto e verso il basso per mescolare bene. Coprire la piastra con il suo coperchio e posizionarla in un incubatore a 37 ° C per 30 minPer eseguire la reazione di idrolisi del substrato.
    3. Trasferire la piastra a un bagno d'acqua di 70 ° C e lasciare riposare per 15 minuti per fermare reazioni catalitiche mediate da rBC1531.
    4. Aggiungere ogni 0.01 unità di S. cerevisiae pirofosfatasi inorganica (1 μL) ad ogni pozzetto della piastra di reazione (dalla fase 3.2.3) e incubare a 20 ° C per 30 min. Aggiungere 16 μL di soluzione di acido molibdato alla piastra di reazione per sviluppare il colore (~ 15 min). Leggete a OD 690nm .
    5. Analizzare utilizzando l'equazione di Michaelis-Menten, come descritto 12 .

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Risultati

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La caratterizzazione della proteina di interesse in questo studio è iniziata con la preparazione di una quantità sufficiente di proteina B. cereus bc1531 (rBC1531) ricombinante, preferibilmente più di alcuni milligrammi. Il frammento di DNA che codifica la proteina BC1531 è stato preparato mediante PCR utilizzando il DNA genomico di B. cereus come un template, in quanto contiene geni ortologi identici a ba1554 . RBC1531 è stato sovraespresso come una proteina s...

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Discussione

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Gli studi sui veri agenti patogeni sono limitati a causa delle restrizioni di sicurezza e delle normative. In alternativa, i patogeni possono essere studiati utilizzando specie non patogene evolutivamente correlate o meno patogene. Il gene ba1554 è considerato un gene critico in B. anthracis. Fortunatamente, un gene identico è presente in B. cereus non clinico. Pertanto, senza gravi problemi di sicurezza, la proteina ricombinante BC1531 può essere utilizzata per la caratterizzazione biofisica e...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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I set di dati di diffrazione dei raggi X sono stati raccolti nel beamline 7A del laboratorio Accelerator Pohang (Corea). Questo studio è stato sostenuto dal programma di ricerca scientifica di base amministrato dalla Fondazione Nazionale di Ricerca della Corea (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT e pianificazione futura (2015R1A1A01057574 a MH).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bacillus cereus ATCC14579Collezione coreana per la coltura tissutale3624
Kit di preparazione del DNA genomicoGeneAll106-101Preparazione del DNA genomico
Primer direttoMacrogenGAAGGATCCGGAAGCAAAAA
CGATGAAAGATATGCA		em>BamHI il sito è sottolineato
Primer inversoMacrogenCTTGTCGACTTATTCTTTCTCT
CCCTCATCAATACGTG		SalI il sito è sottolineato
nPfu-ForteEnzynomicsP410PCR polimerasi
BamHIEnzynomicsR003S
SalIEnzynomicsR009S
pET49b vettore di espressioneNovagen71463Il vettore di espressione è stato modificato per aggiungere tag di affinità e siti BamHI/SalI10
T4 DNA ligasiEnzinomiM001S
Memebrana per dialisiThermofisher18265017
Riscaldatore a blocchi secchiJSRJSBL-02T
LB broth (Luria-Bertani)Soluzione LPSLB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton, Dickinson and Company
KanamicinaLPSKAN025
Kit mini-preparazioneFavorgenFAPDE300Preparazione del DNA plasmidico
BL21 (DE3) Cellula competenteNovagen69450-3CN
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)Fisher BioReagents50-213-378
Cloruro di sodioDaejung7548-4100Materiale PBS
Cloruro di potassioDaejung6566-4405Materiale PBS
Fosfato di potassioBio Basic IncPB0445Materiale PBS
Fosfato di sodioBio Basic IncS0404Materiale PBS
ImidazoleBio Basic IncIB0277
SonicatorSonicsVCX 130
Ni-NTA agarosQiagen30210Rotatore di perline di nichel
FinepcrAG
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-rad1610374SDS-PAGE protein standard
Coonmassie Brilliant Blue R-250Fisher BioReagentsBP101-25Soluzione colorante Coomassie
Alcool metilicoSamchun chimicoM0585Soluzione colorante Coomassie
Acido aceticoDaejung1002-4105Soluzione colorante Coomassie
Memebrane per dialisiThermofisher68035
2-MercaptoetanoloSigma-aldrichM6250
TrombinaMerckmillipore605157-1KUCNPreparare aliquote da 20 μ L (1 Unità per μ L) e conservare a 70 gradi C e scongelare prima dell'uso
Superdex 200 16/600General Electric28989335 Cromatografia ad esclusione dimensionale
Standard di filtrazione su gelBio-rad151-1901
Filtro centrifugoAmiconUFC800396
Piastre di cristralizzazioneHampton researchHR3-083Piastra a goccia a 96 pozzetti
La suite principale JCSG I-IVQiagen130924-130927Soluzione di secreening di cristallizzazione
MicroscopioNikonSMZ745T
Piastre CryschemHampton researchHR3-158Piastra a goccia seduta a 24 pozzetti
Pirofosfatasi inorganicaSigma10108987001
Soluzione di molibdato di ammonioSigma13106-76-8
Acido L-ascorbicoSubstrato NTP Sigma50-81-7
Startagene200415-51
SpettrofotometroBiotekSynergyH1lettore di micropiastre
GraphPad Prism 5GraphPadPrism 5 per finestra
<Soluzione di

Riferimenti

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