La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.
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Articolo metodologico
Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo di strumenti genoma di modifica programmabili ha facilitato l'uso di genetica inversa per comprendere i ruoli specifici sequenze genomiche giocano nel funzionamento delle cellule ed organismi interi. Questa causa è stata enormemente aiutato dalla recente introduzione del CRISPR / sistema-a Cas9 strumento versatile che permette ai ricercatori di manipolare il genoma e trascrittoma al fine di, tra le altre cose, knock out, abbattere, o bussano nei geni in modo mirato maniera. Allo scopo di mettere fuori un gene, CRISPR / Cas9-mediata rotture a doppio filamento reclutano fine-joining non omologhe riparazione del DNA percorso per introdurre l'inserimento frameshift causano o delezione di nucleotidi nel sito rottura. Tuttavia, un individuo RNA guida può causare indesiderati effetti off-target e per escludere questi fuori, l'uso di più RNAs guida è necessario. Questa molteplicità di bersagli significa anche che è richiesto uno screening ad alto volume di cloni, che a sua volta pone l'uso di un efciente tecnica high-throughput al genotipo i cloni eliminazione diretta. tecniche di genotipizzazione correnti sia soffrono di limitazioni intrinseche o comportano costi elevati, quindi rendendoli inadatti per alte produttività. Qui, si dettaglio il protocollo per l'utilizzo fluorescente PCR, che utilizza il DNA genomico da lisato cellulare grezzo come modello, e quindi risolvere i frammenti di PCR mediante gel elettroforesi capillare. Questa tecnica è abbastanza accurata per differenziare differenza una base-pair tra frammenti e quindi è adeguata indicante la presenza o l'assenza di un frameshift nella sequenza codificante del gene bersaglio. Questa conoscenza precisa preclude efficacemente la necessità di una fase di sequenziamento di conferma e permette agli utenti di risparmiare tempo e costi nel processo. Inoltre, questa tecnica ha dimostrato di essere versatile genotipizzazione varie cellule di mammifero di varia origine tessuto mirato da RNA guida contro numerosi geni, come mostrato qui e altrove.
Introduzione
approcci di genetica inversa hanno permesso agli scienziati per chiarire gli effetti delle alterazioni specifiche nel genoma sulla cella o tutto l'organismo. Ad esempio, l'espressione di un particolare gene può essere attenuato di silenziamento genico 1, 2 (riduzione parziale) o gene knockout 3, 4 (ablazione completa) al fine di determinare l'effetto che questo ha sulla funzione della cella o sulla sviluppo dell'organismo.
Esperimenti gene knockout sono più facili dall'introduzione della nucleasi progra....
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Protocollo
1. Ottenere CRISPR / Cas9 mirati cloni singola cella
- cellule HepG2 seme su una piastra da 6 pozzetti a 500.000 cellule per pozzetto in 2 mL di Modified Eagle Medium senza antibiotici di Dulbecco (DMEM) supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS). Incubare per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- cellule trasfezione con il plasmide co-esprimono Cas9 e sgRNA specifica contro il gene di interesse utilizzando un reagente di trasfezione adeguato secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: per esempio, sgRNA può essere clonato nel pSpCas9 (BB) 2A-GFP vettore, come descritto in precedenza 4. - Sostituire il te....
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Risultati
La tecnica gel elettroforesi capillare PCR fluorescente qui descritto è previsto per essere applicabile a qualsiasi regione targetable nel genoma in qualsiasi linea cellulare che è suscettibile di consegna DNA estraneo. Abbiamo già dimostrato la sua applicazione di mira tre geni in una linea di cellule di cancro del colon-retto 12. Qui vi mostriamo la sua efficacia in genotipizzazione una linea di cellule di carcinoma epatocellulare, HepG2, mirata con un CRISPR / .......
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Discussione
Il bussare fuori di un gene specifico in una linea cellulare modello di scelta è diventata routine per chiarire il ruolo che il gene gioca in quel particolare contesto cellulare. Infatti, più schermate genoma sono attualmente disponibili che utilizzano il sistema CRISPR / Cas9 target virtualmente tutti noti geni umani nel genoma 14, 15, 16. Con questi schermi di grandi dimensioni (o anche su piccola scala mira dei singoli geni .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la signora Tan Shi Min, la signora Helen Ong, e il dottor Zhao Yi per aiutare con gli esperimenti di elettroforesi capillare gel. Questo lavoro è stato sostenuto da NMRC / IRG concedere NMRC / 1314/2011 e MOE ACRF Tier 2 Fondo concessione MOE2011-T2-1-051.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule HEPG2 | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetale Siero Bovino Thermo | Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmide | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| tripsina-EDTA (0,5%), senza rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, grado di biologia molecolare | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (senso) | AITbiotech | Nessuno | Sequenza: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR |
| sgRNA insert oligonucleotide (anti-senso) | AITbiotech | Nessuno | Sequenza: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'Primer |
| diretto per amplificazione PCR non marcata | AITbiotech | Nessuno | Sequenza: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; questo primer viene utilizzato anche per sequenziare gli alleli amplificati con PCR |
| 6-FAM Primer diretto fluorescente PCR marcato | AITbiotech | Nessuno | Sequenza: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'Primer |
| diretto PCR fluorescente marcato HEX | AITbiotech | Nessuno | Sequenza: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'Primer |
| inverso PCR non marcato | AITbiotech | Nessuno | Sequenza: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq |
| PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific 4322682 | ||
| MicroAmp Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analizzatore | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| programma 3500 Serie 2 | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 programma | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Anticorpo ( Anticorpo p84 | AP1920b | ||
| [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Perossidasi AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Perossidasi AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
Riferimenti
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312(2016).
- O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014). ....
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Ristampe e permessi
