Immunohistochemia di fluorescenza a quattro colori delle sottopopolazioni delle cellule T in campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringe umane incorporate in paraffina

I carcinomi a cellule squamose orofaringe (OPSCC) sono un gruppo eterogeneo di tumori delle cellule squamose originari dell'orofaringe. I fattori di rischio per OPSCC includono l'infezione del papillomavirus umano (HPV) e l'uso di alcool e tabacco ^{1 , 2} . Il ruolo della risposta immunitaria e come usarlo in un ambiente clinico sta cominciando ad essere esplorato. Il microambiente del tumore è infiltrato da cellule immunitarie che sono attratte dal cancro. Sebbene un citotossico frequenza delle cellule T CD8 ⁺ alto è stata correlata con un miglioramento della sopravvivenza in pazienti OPSCC ^3, il ruolo degli altri sottoinsiemi T-cellulari, comprese le cellule Tregs e Th17, è ancora chiaro ^4. Mentre le cellule Th1 e Th17 sono supposte per aiutare nella risposta immunitaria targeting cellule tumorali, Tregs sono ben noti per le loro capacità di sopprimere l'attività di altre cellule T ⁵ . Tuttavia, la presenza di TRegs è stato trovato correlato con entrambe le reazioni favorevoli e sfavorevoli nei diversi tipi di tumore ⁶ . Poiché non tutte le cellule immunitarie presenti nel sangue infiltrano il tumore nella stessa misura, studiare il microambiente tumorale locale fornisce la misura più affidabile della risposta immunitaria diretta contro il tumore. Lo scopo di questo studio è quello di determinare la correlazione tra i numeri e le tipologie di cellule immunitarie e il risultato clinico. Abbiamo utilizzato l'imaging IHC a fluorescenza a quattro colori per analizzare il numero e la localizzazione di diverse sottopopolazioni delle cellule T nell'uomo OPSCC.

Ci siamo concentrati sui linfociti totali T (CD3 ⁺ ), sulle cellule Th17 e sugli immunosoppressivi FoxP3 ⁺ Tregs, il cui percorso di differenziazione è strettamente correlato alle cellule Th17. Le cellule Th17 sono caratterizzate dalla combinazione di CD3 e IL-17. La citochina IL-17 può essere prodotta anche da cellule non-T ⁷ . Abbiamo determinato la distribuzione dell'in-epitCellule T elicoide e stromali, Tregs, Th17 e IL-17 ⁺ cellule non T in una grande serie di casi OPSCC e analizzavano le correlazioni con la sopravvivenza del paziente. La fluorescenza multicolore IHC è stata usata per identificare l'espressione di CD3, Foxp3 e IL-17 in combinazione con un contatore di DAPI. Questo test ha consentito l'identificazione facile e chiara di entrambe le cellule tumorali (utilizzando la colorazione nucleare DAPI) e delle infiltrazioni delle cellule T (utilizzando una combinazione di marcatori differenti). Dopo la preparazione del campione e la colorazione, sono stati utilizzati un microscopio fluorescente e un software di imaging per separare i diversi colori fluorescenti utilizzati e per determinare il numero e il tipo di cellule presenti sia nell'epitelio tumorale che nello stroma associato al tumore.

Un test alternativo per quantificare e fenotipizzare le popolazioni di cellule immunitarie è l'analisi della citometria di flusso, o la citometria per il tempo di volo (CyTOF), dei tumori o dei campioni periferici ( cioè il sangue o le ascite). Utilizzando questoTecnica, tutte le informazioni relative alla localizzazione e alla relativa distribuzione dei diversi tipi di cellule vengono persi. L'utilizzo e l'analisi dei campioni periferici non fornisce anche informazioni sulle cellule in grado di infiltrarsi nel microambiente tumorale. Le analisi di cellule immunitarie di sangue e ascite sono state dimostrate per non riflettere il fenotipo e la frequenza di infiltrazione delle cellule immunitarie del tessuto tumorale ^{8 , 9} .

Un'altra alternativa è l'uso di microscopia a campo luminoso. Un vantaggio di questa tecnica sulla formazione di immagini a fluorescenza è l'assenza di autofluorescenza dei tessuti. Anche se alcuni campioni contengono più autofluorescenza, in particolare gli eritrociti, ma anche altri tipi di cellule, inclusi i granulociti neutrofili, queste aree possono essere facilmente rimosse nell'analisi di quasi tutti i campioni. L'immunofluorescenza offre il vantaggio di analizzare marcatori multipli in un campione utilizzando un pannello di fluorescenza mirataNt lunghezze d'onda. Questo è attualmente impossibile nella stessa misura per la microscopia a campo luminoso a causa della mancanza di un numero sufficiente di etichette e di isotipi anticorpali commercialmente disponibili per un determinato antigene.

La tecnica IHC a fluorescenza multicolore descritta qui è stata utilizzata in diversi tipi di cancro e combinazioni anticorpali per studiare diverse popolazioni di cellule immunitarie, così come molecole espresse dalle cellule tumorali, quali antigeni di leucociti umani (HLA) e PD-L1 ^{10 , 11 , 12} . Il protocollo è stato stabilito e convalidato utilizzando molti diversi tipi di campioni e anticorpi.

I campioni dei pazienti sono stati trattati secondo le linee guida mediche del medico descritte nel Codice di condotta per un corretto uso secondario del tessuto umano della Federazione olandese delle società scientifiche biomediche (www.federa.org).

1. Preparare le diapositive

1. Ottenere materiale tissutale resecato (qualsiasi tipo di tessuto) da un reparto patologico dopo aver ottenuto il permesso del comitato etico medico di utilizzare materiale rescritto.
   NOTA: Per l'esperimento attuale, i campioni tumorali di pretrattamento sono stati ottenuti da tumori primari orofaringeo diagnosticati nel Leiden University Medical Centre di Leiden, Paesi Bassi tra il 1970 e il 2011, selezionati come descritto precedentemente (n = 162) ¹³ . La dimensione del tessuto è stata limitata solo dall'esigenza di una quantità sufficiente di tessuti tumorali per ottenere in modo affidabile 4 immagini microscopiche all'interno del tumore.
2. Fissare il tessuto in formalina tamponata al 4% per un minimo di 12 h. Dehidrate il tessuto in agSerie di etanolo. Lavare in xilene e inserirlo in cera di paraffina utilizzando un processore di tessuto automatizzato.
3. Tagliare sezioni 4 μm di tessuto rigonfiato a base di formalina, paraffina (FFPE) su vetrini in vetro utilizzando un microtomo. Posizionare il blocco di tessuto nel supporto del tessuto microtelefono utilizzando procedure standard.
   1. Tagliare i nastri di tessuto e posarli sulla superficie di un bagno d'acqua contenente acqua deionizzata a 45 ºC. Utilizzare uno scivolo adatto per la colorazione immunohistochemical per pescare una sezione posizionando il vetrino nell'acqua direttamente sotto la sezione. Spostare con cautela la slitta ad angolo, prendendo la sezione fuori dall'acqua e attaccandola sullo scivolo.
4. Lasciare asciugare le diapositive durante la notte a 37 ° C.
5. Deparaffinare le diapositive FFPE immersandole completamente in xilene al 100% fresco, tre volte per 5 minuti ciascuno. Ridaldare le diapositive immersandole due volte in etanolo fresco al 100%, etanolo al 70% ed etanolo al 50% per 5 minuti ciascuno.

2. Eseguire il recupero di antigen

1. Lavare le diapositive in acqua deionizzata per 5 min.
2. Preriscaldare il tampone Tris-etilendiamintetraoacetico (EDTA) (10 mM Tris più 1 mM EDTA, pH 9,0) a temperatura di ebollizione usando un forno a microonde. Eseguire il recupero dell'antigene sommersando le diapositive nel tampone EDTA preriscaldato e mantenendo il tampone a questa temperatura per 10 minuti nel forno a microonde.
   NOTA: è possibile utilizzare qualsiasi forno a microonde con una potenza di 900 W.
3. Lasciare raffreddare le diapositive nel buffer per 2 ore.

3. Scivolare i tessuti del tessuto

1. Lavare le vetrate due volte con soluzione salina fosfatizzata (PBS) per 5 minuti ciascuno.
2. Disegnare un cerchio intorno al tessuto con una penna idrofoba per impedire che gli anticorpi diluiti sfilano la diapositiva. Lavare ancora una volta con PBS; Questo è facoltativo.
3. Incubare il tessuto con anticorpi primari (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 e anti-IL-17 1:50) diluiti in 1% in peso di siero bovino aLbumina (BSA) in PBS a temperatura ambiente durante la notte.
   NOTA: Il volume per diapositiva dipende dalla dimensione del tessuto, ma è tipicamente 50 - 150 μL. Sostituire gli anticorpi primari con gli anticorpi della stessa classe isotipo con una specifica ignota per i vetrini di controllo negativo alla stessa diluizione degli anticorpi CD3, CD8 e FoxP3 (ad esempio, anticorpi anti-isotipo coniglio Ig, IgG1 anticorpi anti-isotipo e capra Anticorpo anti-isotipo IgG).
4. Lavare le diapositive tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
5. Incubare il tessuto con una combinazione di anticorpi secondari etichettati a fluorescenza che si rivolgono alle specie e / o agli isotipi primari ( cioè 1: 200 IgA Alexa 488 anti-capra, anti-coniglio IgG A546 e anti-mouse A647) 1% di BSA in PBS a temperatura ambiente per 1 h.
   NOTA: Il volume per diapositiva dipende dalla dimensione del tessuto, ma è tipicamente 50 - 150 μL.
   1. DopoAggiungendo l'anticorpo secondario, mantenendo le diapositive protette dalla luce il più possibile immagazzinandole in una scatola scura o avvolgendo la scatola in fogli di alluminio.

4. Scivolare i supporti del tessuto di montaggio e di conteggio

1. Lavare le diapositive tre volte in PBS per 5 minuti ciascuna.
2. Montare le diapositive utilizzando un supporto di montaggio antifumo acquoso contenente un contatore nucleare ( es. DAPI). Analizzare le diapositive utilizzando un microscopio fluorescente non appena possibile (entro due settimane). Conservare le diapositive al buio a 4 ° C fino all'analisi.

5. Analizzare le vetrate macchiate del tessuto

1. Ottieni quattro immagini di ciascuna diapositiva usando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo 20-25x. Prendere le immagini in località casuali per tutta la zona tumorale totale inclusa nella diapositiva per catturare una frazione rappresentativa del tumore.
   NOTA: È necessario utilizzare un ingrandimento standard di 250X. Qualsiasi fluorescente oPuò essere utilizzato il microscopio di scansione laser a condizione che disponga dei filtri e dei laser necessari per visualizzare i fluorochromi utilizzati.
   1. Per la visualizzazione di Alexa 488, utilizzare un massimo di eccitazione di 490 e un'emissione massima di 525; Per la visualizzazione di Alexa 546, utilizzare un massimo di eccitazione di 556 e un'emissione massima di 573; Per la visualizzazione di Alexa 647, utilizzare un massimo di eccitazione di 650 e una massima emissione di 665; E per la visualizzazione di DAPI, utilizzare un massimo di eccitazione di 358 e un massimo di emissione di 461.
   2. Salvare le immagini come file di immagine (ad esempio, jpeg e tiff) nel software disponibile all'utente.
2. Discriminazione tra epitelio tumorale e aree di stroma tumorale basate sulle forme nucleari e cellulari delle cellule epiteliali del tumore rispetto alle cellule stromali dopo aver consultato un patologo.
   1. Per determinare la superficie totale dello stromo, disegnare una linea intorno a tutte le aree occupate dalle cellule stromali (piuttosto che dalle cellule tumorali) e ricorrereD la superficie usando il software di analisi delle immagini fornito dal produttore del microscopio.
      1. Fai clic sulla scheda "Sovrapposizione" sotto l'immagine; Scegliere la forma "Poly-line chiusa" e cliccare su di esso. Demarcare il confine tra campi epiteliali e stromali del tumore facendo clic sull'area fino a raggiungere nuovamente il primo punto; Questo fornisce una misura per quella zona.
         NOTA: una volta che la forma è chiusa, apparirà un numero accanto alla forma che circonda l'area di superficie dell'immagine selezionata (A = x μm ² ).
   2. Sottrarre questa superficie dalla superficie totale dell'immagine (fornita nelle proprietà dell'immagine) per calcolare l'area epiteliale. Escludi aree vascolari, necrotiche e autofluorescenti tracciando una linea intorno a loro, registrando la dimensione dell'area fornita e sottraendola alla superficie epiteliale.
   3. Salvare tutti i numeri di superficie in un foglio di calcolo per calcolare le superfici superficiali eNumeri di cella per diapositiva.
   4. Utilizzando il software di analisi delle immagini, determinare se le celle sono singole, doppie o triple-positive controllando la fluorescenza di tutti e quattro i canali.
      1. Conte le celle singole, doppie e triple-positive in ogni immagine usando ImageJ.
         1. Scarica ImageJ. Apri un'immagine facendo clic su "File" e "Apri" e selezionando l'immagine da analizzare. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul "Tool Point" (un quadrato rosso al centro di quattro righe) e selezionare il "Multi-Point Tool". Fare doppio clic sul "Multi-Point Tool" e contare il numero di tipi di celle differenti nell'immagine selezionando un diverso numero di contatore per ciascun tipo di cella.
            NOTA: contare tutte le celle di ciascun tipo di cella differente, come individuato dalla presenza di uno, due o tutti i tre colori fluorescenti. Escludi DAPI, poiché questo contatore nucleare è presente in tutte le cellule e viene utilizzato per discriminare le cellule tumorali dalle cellule immunitarie. Ogni tipo di cella viene conteggiatoUtilizzando un diverso numero di contatore. Contare i numeri di cella di ciascun tipo di cellula separatamente nelle aree tumorali epiteliali e stromali scegliendo ogni volta un diverso numero di contatori. Non contate le cellule entro vasi sanguigni e aree largamente autofluorescenti.
         2. Registrare il numero di celle analizzate in ciascuna banconota per ogni immagine in un file di foglio di calcolo.
         3. Dividere il numero totale di cellule per ogni tipo di cellula sulla superficie totale dell'epitelio tumorale e dello stroma tumorale analizzato.

6. Analisi statistica

NOTA: Tutte le analisi statistiche dovrebbero essere discusse con uno statista per garantire la qualità dei dati. Per le statistiche generali, utilizzare qualsiasi guida statistica medica ¹⁴ .

1. Prova le correlazioni tra le frequenze delle cellule usando una rho test di correlazione di rango di Spearman.
2. Prova le differenze statistiche nei numeri di positiva celLs tra i pazienti usando il test Wilcoxon Mann-Whitney.
3. Prova le correlazioni tra i numeri di cellule e la sopravvivenza libera da malattie ( vale a dire, il tempo dalla diagnosi fino alla recidiva locale o remota della morte o della malattia) dividendo i pazienti in gruppi basati su un numero di cellule cut-off utilizzando la generazione della curva Kaplan-Meier e il log Analisi di rango ¹⁵ .
4. Eseguire analisi multivariate utilizzando l'analisi della regressione di rischio proporzionale Cox.

Una serie di campioni tumorali di pretrattamento FFPE ottenuti da tumori primari orofaringei diagnosticati nel Leiden University Medical Center di Leiden, Paesi Bassi tra il 1970 e il 2011, selezionati come precedentemente descritto (n = 162), sono stati macchiati con il protocollo descritto 13 . Sono state analizzate da una a quattro immagini casuali di ogni diapositiva ( Figura 1 ). Sono indicate alcune cellule autofluorescenti, che possono essere chiaramente distinte per il loro aspetto giallo completo. In questo caso, le cellule veramente doppie o triple-positive positivi solo per un particolare anticorpo nella localizzazione attesa, che è alla membrana cellulare o al nucleo. Le diapositive di controllo negativo non mostrano nessuna colorazione specifica sopra l'autofluorescenza dei tessuti di sfondo ( Figura 2 e Figura 4 ), confermando che tutto il segnale è specifico per i bersagli riconosciuti dal primarioanticorpi. Tutti i campioni tumorali sono stati infiltrati da cellule CD3 + T a variazioni estese. FoxP3 + Tregs ha sempre espresso CD3 ed è stata una delle principali infiltrazioni di cellule T. Le cellule CD3 che esprimono IL-17 (cellule Th17) erano una popolazione minore delle cellule T infiltranti. IL-17 espresso da CD3 - cellule era un'altra popolazione di cellule infiltranti abbondanti. Le cellule IL-17 + FoxP3 + comprendevano non più di 0,01% di tutte le cellule di FoxP3 + .

Tutte le prove statistiche erano due facce e valori p inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi 14 . Sono state presentate le correlazioni tra i numeri di cellule intraepiteleli o totali e la sopravvivenza, in quanto le correlazioni tra i numeri di cellule stromali o totali e la sopravvivenza del paziente erano simili. Un elevato numero di cellule CD3 + T infiltranti hanno mostrato una tendenza verso una correlazione con una sopravvivenza migliorata senza malattia (0.086, Figura 5A ) rispetto a un basso numero di cellule T ( cioè quartile minore). Quando studio specifico di pazienti con un numero minore di cellule IL-17 + , un elevato numero di cellule T infiltranti totali è stato correlato con una sopravvivenza migliorata senza malattia (p = 0.012, figura 5B ). L'effetto prognostico delle cellule T infiltranti tumorali è stato perso nel gruppo di pazienti con un elevato numero di cellule IL-17 + infiltranti tumorali (dati non mostrati). Pertanto, l'effetto delle cellule T infiltranti tumorali in OPSCC può essere correlato al basso numero di cellule IL-17 + presenti.

Figura 1: FFPE Tumore Orofaringeo Cancer macchiato da Fluorescenza a quattro colori IHC. Immagine rappresentativa di una macchia immunofluorescenti per CD3 ( A , rosso), IL-17 ( B Ong>, verde) e FoxP3 ( C , blu), così come l'immagine unita combinata con DAPI (grigio) ( D ). Due celle autofluorescenti sono indicate dalle frecce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Controllo negativo per CD3. Immagine rappresentativa del tessuto cancro orofaringeo FFPE, macchiato come descritto nel protocollo, sostituendo l'anticorpo anti-CD3 con un anticorpo anti-isotipo con IgG con con specificità sconosciuta. Non viene mostrata nessuna colorazione per il coniglio Ig ( A , rosso) combinata con la colorazione per IL-17 ( B , verde), FoxP3 ( C , blu) e DAPI ( D , grigio).2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Controllo negativo per IL-17. Immagine rappresentativa del tessuto tumorale orofaringeo FFPE, macchiato come descritto nel protocollo, sostituendo l'anticorpo anti-IL-17 con un anticorpo anti-isotipo Ig IgA con specificità sconosciuta. Non viene mostrata nessuna colorazione per la goccia Ig ( B , verde) combinata con la colorazione per CD3 ( A , rosso), FoxP3 ( C , blu) e DAPI ( D , grigio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

FIgure 4: controllo negativo per FoxP3. Immagine rappresentativa del tessuto del cancro orofaringeo FFPE, macchiata come descritto nel protocollo, sostituendo l'anticorpo anti-FoxP3 con un anticorpo anti-isotipo IgG1 di topo con specificità sconosciuta. Non viene mostrata nessuna colorazione per mouse IgG1 ( C , blu) combinata con la colorazione per CD3 ( A , rosso), IL-17 ( B , verde) e DAPI ( D , grigio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Curve di sopravvivenza Kaplan-Meier. Per i pazienti con un numero medio di cellule IL-17 + / mm 2 , le curve di sopravvivenza senza malattia sono mostrate per un livello molto basso ( cioè il quartile più basso) rispetto ad un elevato numero di totaLe cellule T ( A ) e un basso ( cioè, al di sotto del mediano) rispetto al numero elevato di cellule T totali ( B ) nell'area tumorale totale. Riprodotto con l'autorizzazione della rivista Immunologia del Cancro 13 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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