L'immunohistochemistry di fluorescenza multiparametrica può essere utilizzato per valutare il numero, la distribuzione relativa e la localizzazione delle popolazioni di cellule immunitarie nel microambiente del tumore. Questo manoscritto descrive l'uso di questa tecnica per analizzare le sottopopolazioni delle cellule T nel cancro orofaringeo.
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Articolo metodologico
Immunohistochemia di fluorescenza a quattro colori delle sottopopolazioni delle cellule T in campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringe umane incorporate in paraffina
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tecnica di immunoistochimica a fluorescenza a quattro colori (IHC) è un metodo per quantificare le popolazioni di cellule interessate tenendo conto della loro distribuzione relativa e della loro localizzazione nel tessuto. Questa tecnica è stata ampiamente applicata allo studio dell'infiltrazione immunitaria in vari tipi di tumore. Il microambiente tumorale è infiltrato da cellule immunitarie che sono attratte dal sito tumorale. Diverse popolazioni di cellule immunitarie sono state trovate a svolgere diversi ruoli nel microambiente tumorale e avere un impatto diverso sull'esito della malattia. Questo manoscritto descrive come esempio l'uso di fluorescenza multiparametrica IHC sul carcinoma a cellule squamose orofaringe (OPSCC). Questa tecnica può essere estesa ad altri campioni di tessuto e tipi di cellule di interesse. Nello studio presentato, abbiamo analizzato il compartimento intraepiteliale e stromale di una grande coorte OPSCC (n = 162). Ci siamo concentrati sui linfociti T totali (CD3 + ), regolazione immunosoppressivaLe cellule T ory (Tregs, cioè FoxP3 + ) e le cellule T helper 17 (Th17) ( cioè, IL-17 + CD3 + ) usando un contatore nucleare per distinguere l'epitelio tumorale dal stroma. Un elevato numero di cellule T è risultato correlato con una sopravvivenza migliorata senza malattia in pazienti con un numero minore di cellule intratumorali IL-17 + non-T. Ciò suggerisce che le cellule non-T di IL-17 + possono essere correlate con una scarsa risposta immunitaria in OPSCC, che è d'accordo con la correlazione descritta tra IL-17 e una scarsa sopravvivenza nei pazienti affetti da tumore. Attualmente, sono state sviluppate nuove tecniche di fluorescenza IHC con parametri multiparametrici utilizzando fino a 7 fluorochromi diversi e consentiranno la caratterizzazione più precisa e la localizzazione delle cellule immunitarie nel microambiente del tumore.
Introduzione
I carcinomi a cellule squamose orofaringe (OPSCC) sono un gruppo eterogeneo di tumori delle cellule squamose originari dell'orofaringe. I fattori di rischio per OPSCC includono l'infezione del papillomavirus umano (HPV) e l'uso di alcool e tabacco 1 , 2 . Il ruolo della risposta immunitaria e come usarlo in un ambiente clinico sta cominciando ad essere esplorato. Il microambiente del tumore è infiltrato da cellule immunitarie che sono attratte dal cancro. Sebbene un citotossico frequenza delle cellule T CD8 + alto è stata correlata con un miglioramento della sopravvivenza in pazienti OP....
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Protocollo
I campioni dei pazienti sono stati trattati secondo le linee guida mediche del medico descritte nel Codice di condotta per un corretto uso secondario del tessuto umano della Federazione olandese delle società scientifiche biomediche (www.federa.org).
1. Preparare le diapositive
- Ottenere materiale tissutale resecato (qualsiasi tipo di tessuto) da un reparto patologico dopo aver ottenuto il permesso del comitato etico medico di utilizzare materiale rescritto.
NOTA: Per l'esperimento attuale, i campioni tumorali di pretrattamento sono stati ottenuti da tumori primari orofaringeo diagnosticati nel Leiden University Medic....
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Risultati
Una serie di campioni tumorali di pretrattamento FFPE ottenuti da tumori primari orofaringei diagnosticati nel Leiden University Medical Center di Leiden, Paesi Bassi tra il 1970 e il 2011, selezionati come precedentemente descritto (n = 162), sono stati macchiati con il protocollo descritto 13 . Sono state analizzate da una a quattro immagini casuali di ogni diapositiva ( Figura 1 ). Sono indicate alcune cellule autofluorescenti, che.......
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Discussione
Per il protocollo descritto, uno dei passaggi più critici è quello di determinare la corretta diluizione degli anticorpi primari utilizzati. La diluizione degli anticorpi secondari etichettati era di 1: 200, come raccomandato dal produttore di questi anticorpi specifici Alexa-etichettati. La diluizione degli anticorpi primari dovrebbe quindi essere determinata da una diluizione seriale, preferibilmente utilizzando due diversi campioni del tipo di tessuto previsto (in questo caso OPSCC). La diluizione ottimale è la dilui.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interesse commerciale o finanziario.
Ringraziamenti
Simone Punt è stato sostenuto dalla borsa UL2010-4801 della Dutch Cancer Society. Vogliamo ringraziare tutti i coautori del documento originale che questo protocollo JoVE è basato su: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter e Sjoerd van Der Burg.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone e Histostar | Processatore automatizzato di tessuti | |
| Histostar | Thermo Scientific | Macchina per l'inclusione di blocchi di tessuto | |
| Formaldeide | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Etanolo | Merck | ||
| milliQ acqua | Elaga Purelab Chorus | ||
| Cera di paraffina/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Porta fazzoletti per microtomo | Leica | RM225 | |
| Flex IHC lato | Dako | Vetrino per tessuti | |
| Tris | Merk-Milipore | 1.083.821.000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Coniglio anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titolare diluizione anticorpale richiesta |
| IgG1 di topo anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titolare richiesto diluizione degli anticorpi |
| IgG di capra anti-IL-17 | R& D Systems | AF-317-NA | Diluizione dell'anticorpo richiesto |
| titolato Anticorpo di controllo dell'isotipo Ig di coniglio | Abcam | ab27472 | Utilizzare alla stessa concentrazione finale dell'anticorpo anti-CD3 |
| di controllo dell'isotipo IgG1 di topo | Abcam | ab91353 | Utilizzare alla stessa concentrazione finale dell'anticorpo anti-FoxP3 |
| per il controllo dell'isotipo IgG di capra | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Utilizzare alla stessa concentrazione finale di anti-IL-17 |
| Asino anti-coniglio IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Diluire 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Asino anti-topo-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Diluire 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Asino anti-capra IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Diluire 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield contenente DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Microscopio a scansione laser confocale LSM700 | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 obiettivo | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | versione 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | versione 4.2.0.121 | Disponibile per il download all'indirizzo www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | versione 20.0 | |
| ImageJ | versione 1.50i | Disponibile per il download all'indirizzo http://rsb.info.nih.gov/ij. |
Riferimenti
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al.
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Ristampe e permessi
