Un nuovo metodo per modellare l&#39;encefalopatia traumatica cronica in<em&gt; Drosophila</em

Sommario

Qui descriviamo un nuovo approccio per infliggere danni traumatici al cervello chiuso a Drosophila melanogaster . Il nostro metodo ha il vantaggio di trasmettere direttamente impatti ripetitivi con forza regolabile solo alla testa. Un'ulteriore esplorazione del sistema invertebrato contribuirà ad illuminare la patogenesi di encefalopatia traumatica cronica.

Abstract

L'encefalopatia traumatica cronica (CTE) è una malattia neurodegenerativa consolidata che è strettamente associata all'esposizione a un mite traumatico (TMT) ripetitivo. I meccanismi responsabili dei suoi complessi cambiamenti patologici rimangono in gran parte sfuggenti, nonostante un recente consenso per definire i criteri neuropatologici. Qui descriviamo un nuovo metodo per sviluppare un modello di CTE in Drosophila melanogaster ( Drosophila ) nel tentativo di identificare i geni chiave e le vie che portano al caratteristico accumulo tau iperfosforilato e alla morte neuronale nel cervello. Impatti di forza di regolazione per infliggere lesioni chiuse lievi vengono consegnati direttamente alla testa di mosca sottoponendo la testa ad accelerazione e decelerazione rapida. Il nostro metodo elimina i problemi potenziali inerenti ad altri modelli moto Drosophila ( ad esempio, la morte animale potrebbe essere indotta da danni aAltre parti del corpo o agli organi interni). La mancanza di manodopera a basso costo e a basso costo, una breve durata di vita e estesi strumenti genetici rendono la frutta ideale per studiare la patogenesi della CTE e rendere possibile la realizzazione di schermi genetici e farmacologici avanzati su vasta scala genomica. Prevediamo che la continua caratterizzazione del modello genera importanti conoscenze meccaniche sulla prevenzione delle malattie e sugli approcci terapeutici.

Introduzione

L'encefalopatia traumatica cronica (CTE) è stata recentemente riconosciuta come un disturbo neurodegenerativo distinto, separato da altre tauopatie come la malattia di Alzheimer ¹ . A differenza della malattia di Alzheimer e di altre tauopatie comuni, i cui fattori di rischio più importanti stanno avanzando l'età e una storia familiare di demenza, la CTE, come indicato dal suo nome, implica una stretta collaborazione con una storia di traumi cerebrali, probabilmente visto in atleti sportivi di contatto, Come pugili e calciatori, così come nei veterani militari ^{2 , 3 , 4 , 5} . Si pensa di essere iniziato da ripetuti colpi concussivi e subconcutici alla testa. I pazienti possono presentare sintomi e segni quali disordini cognitivi, cambiamenti di umore e comportamento e disfunzione di movimento, che si sovrappongono in modo significativo con la malattia di Alzheimer, frontotemporalDemenza, demenza del corpo di Lewy e malattia di Parkinson ⁶ . Al contrario, gli esami post-mortem del tessuto cerebrale rivelano un modello distinto di accumulo di tau per iperfosforilati che circonda i piccoli vasi sanguigni nelle profondità dei sulci corticali, caratteristica patognomonica non osservata nelle altre condizioni degenerative ⁷ . Tuttavia, finora poco si sa sulla patogenesi che conduce alla manifestazione delle malattie. Questo è in gran parte dovuto alla mancanza di un modello animale fedele - solo di recente sono stati generati modelli roditori ^{5 , 8} . Questi organismi di modello hanno gli svantaggi di una terapia intensiva e una durata di vita relativamente lunga, che non sono adatti per studi di malattia neurodegenerativa.

Rispetto alle omologhe di mammiferi, gli animali invertebrati come Drosophila sono un'ottima alternativa, con la loro manutenzione economica,Strumenti estensivi per la dissezione di determinanti genetici e durata relativamente breve ⁹ . Notevolmente, il cervello volante e umano condividono le vie molecolari e cellulari evolutamente conservate, nonché le somiglianze anatomiche ^{10 , 11 , 12} . Due geniali modelli Drosophila per studiare lesioni cerebrali traumatiche sono state riportate in precedenza ^{13 , 14} . Il primo dispositivo "High Impact Trauma" (HIT) progettato da Katzenberger e colleghi conteneva mosche in movimento in una flaconcina di plastica legata all'estremità libera di una molla metallica ^{13 , 15} . Quando il flaconcino di plastica è stato inclinato in verticale e rilasciato, ha colpito un tampone di poliuretano e impartito il trauma alle mosche quando si sono rimbalzati alla parete del flacone e rimbalzato. Al contrario, Barekat e colleghi hanno progettato un diverso metodo di consegnaLa piattaforma omogeneizzatrice Omni Bead Ruptor-24 ¹⁴ . Le mosche sono state inabilitate con CO ₂ e poste in un tubo a vite da 2 mL che è stato fissato all'omogenizzatore e sottoposto a condizioni di scossa preprogrammate. Un vantaggio di utilizzare il sistema di omogeneizzazione dei tessuti è che lo sperimentatore potrebbe modulare l'intensità della lesione, la durata della lesione e il numero di attacchi di lesioni. Tuttavia, entrambi i regimi subiscono lo stesso inconveniente: lesioni primarie alla testa vengono inflitte casualmente in termini di posizione e forza di impatto. Inoltre, entrambi i metodi hanno determinato una notevole mortalità, causata da inevitabili danneggiamenti collaterali ad altre parti del corpo e degli organi interni. Qui descriviamo un nuovo metodo per indurre mTBI nelle mosche di frutta. Il nostro apparecchio è costituito da un impatto balistico a propulsione a gas. Rispetto ai modelli Drosophila ^{14 , 15} , il nostro metodo ha il vantaggio unico di fornire measImpatto urra, diretto solo alla testa di mosca libera, consentendo così il controllo accurato di vari fattori, come la gravità dell'impatto, l'intervallo di tempo tra gli impatti e il numero totale di impatti sostenuti.

Protocollo

1. Montaggio del Dispositivo Strike ( Figura 1 )

1. Rimuovere lo stantuffo da una siringa tubercolina da 1 ml. Tagliare la canna al punto di 1 ml.
2. Rimuovere una barriera aerosol (3 mm di altezza x 4 mm di diametro) da una punta di pipetta da 200 μl e utilizzarla come impattatore. Posizionare l'impatto nell'interno della barra della siringa. Toccare delicatamente il cilindro per spostare l'impattatore all'estremità della punta, con il lato piatto che copre l'apertura dell'ugello.
3. Fissare l'estremità della punta del tubo al tubo di plastica collegato al regolatore di flusso di anidride carbonica (CO ₂ ) di una stazione di anestesia Drosophila .
4. Tenere la barella verticalmente e fissarla a un supporto di supporto standard di bloccaggio in modo che il dispositivo di impatto rimanga in fondo alla canna.
5. Modificare una punta pipetta da 200 μl per realizzare il supporto mosca.
   1. Tagliare 4 mm dalla punta per fare un'apertura di diametro di 0,8 mm, consentendo solo di esporre la testa a mosca.
      NOTA: il thoRax e tutte le altre parti del corpo mosca rimarranno all'interno della punta pipetta.
6. Modificare una punta pipetta da 1000 μL e un tappo ago da 1 ml di siringa per realizzare il connettore.
   1. Tagliare 44 mm dall'apertura della punta. Prendete una lunghezza di 6 mm di un capsula da 1 ml della siringa e spingetela strettamente nel segmento rimanente della punta della pipetta da 1000 μL.

2. Funzionamento del dispositivo Strike

1. Anestetizza una singola femmina adulta di 2 giorni che vola usando CO ₂ su un moscerino.
2. Trasferitelo delicatamente sul supporto di mosca usando una spazzola fine. Toccare delicatamente il supporto in modo che la testa di mosca sia visibile all'esterno dell'estremità della punta. Se la proboscide di mosca è esposta al di fuori della punta, infilate leggermente dentro la punta con un ago sferico da 1 ml sbattuto.
   NOTA: Assicurarsi di mantenere la proboscide di mosca all'interno del supporto. Altrimenti, la mosca può morire da un infortunio alla ventosa.
3. Serrare la moscaSulla barra della siringa con il connettore in modo che la testa di mosca sia rivolta verso il basso.
4. Impostare la pressione del gas a 100 kPa. Regolare la portata secondo il disegno dell'esperimento.
5. Spostare e spegnere rapidamente l'interruttore del regolatore di flusso in modo che l'urto di impatto raggiunga una volta la testa di mosca.
6. Sollevare il supporto mosca e spostarlo su un rilievo di mosca. Invertire il supporto volante e toccare delicatamente il lato per far uscire il volo. Lasciare la mosca in un flacone vuoto per recuperare.

3. Monitoraggio del movimento assistito video

1. Riempire un piatto di Petri da 6 cm con elastomero trasparente al silicio per realizzare l'arena di tracciamento. Lasciare uno spazio di 3 mm tra il silicone e il coperchio del piatto per consentire alle mosche di camminare liberamente ma non di volare.
2. Anestetizzare quattro mosche dal gruppo o dal gruppo trattato ogni volta e piazzarli nell'arena. Lasciare le mosche a 22 ° C per 1 ora.
3. Posizionare una telecamera con dispositivo di accoppiamento (CCD) sopra le arene e registrare per 5 minuti.
4. Analizzare le traiettorie di movimento registrate usando il software Ctrax (liberamente disponibile da Caltech) ¹⁶ . Esportare i dati tracciati in un linguaggio di programmazione (ad esempio, Matlab) -compatibile e analizzare i dati in base alla distanza percorsa per fotogramma ¹⁷ . Calcolare la distanza percorsa media per ogni mosca e combinarla con tutte le altre mosche registrate / gruppo per ottenere una distanza cumulativa media percorsa dalla popolazione di file nello stesso gruppo.

Risultati

Per stabilire un modello CTE con l'adulto Drosophila abbiamo determinato l'efficacia del nostro dispositivo per infliggere una singola lesione alla testa chiusa. Per eliminare le variazioni relative al genotipo, al sesso o all'età, abbiamo usato le mosche femminili Canton-S WT di due giorni nell'esperimento. Potremmo facilmente controllare la resistenza dell'impulso di impatto regolando la portata di CO ₂ ad una pressione costante di 100 kPa. Le mo...

Discussione

I modelli animali che modellano fedelmente le caratteristiche del CTE, comprese le alterazioni neurofisiologiche, i segni neuropatologici e i disordini neurobehaviorali, sono essenziali per scoprire i meccanismi della malattia e per sviluppare obiettivi diagnostici e terapeutici. È comprensibile che nessun modello animale di una malattia umana sia perfetto a imitare tutti gli endpoint clinicamente rilevanti. Tuttavia, riteniamo che un robusto modello CTE dovrebbe soddisfare i seguenti tre requisiti: (1) l'impatto de...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Barriera per aerosol	USA Scientific	1120-8810	Utilizzato come impattatore
200 μ L Puntale per pipetta	USA Scientific	1111-0706	Utilizzato come supporto per testa di mosca
1000 μ L Puntale per pipetta	USA Scientific	1122-1830	Utilizzato come connettore
Siringa per tubercolina da 1 ml	Becton Dickinson	309625
Piastre di Petri da 60 mm	Fisher Scientific	FB0875713A	Utilizzato come arene di tracciamento
Regolatore di flusso	Genesee Scientific	59-122WC
Standard Clamp Holder/supporto	EISCO Scientific	CH0688
Spazzola fine	Genesee Scientific	59-204
Flypad	Genesee Scientific	59-114
Sylgard Elastomero siliconico	Dow Corning	4019862
CCD Camera	Microsoft	HD-5000
Ctrax Walking Fly Tracker	Caltech	Ctrax 0.2.11
MATLAB Cassetta degli attrezzi per l'elaborazione delle immagini	MATLAB	R2015b