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Articolo metodologico

Estrazione e purificazione di polifenoli da polvere di bacche congelata per il trattamento di cellule muscolari lisce vascolari

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DOI:

10.3791/55605

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5 luglio 2017

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1Department of Dietetics and Nutrition, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Nutrition, Food and Exercise Sciences, Florida State University, 3Center for Advancing Exercise and Nutrition Research on Aging (CAENRA), Florida State University

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro descrive un metodo passo-passo per preparare estratti ricchi di polifenoli dalla polvere di bacche congelata. Inoltre, fornisce una descrizione approfondita di come utilizzare questi estratti ricchi di polifenoli nella coltura cellulare in presenza dell'ormone peptidico angiotensino II (Ang II) utilizzando cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs).

Abstract

Gli studi epidemiologici indicano che l'aumento dell'assunzione di flavonoidi è correlato alla diminuzione della mortalità dovuta a malattie cardiovascolari (CVD) negli Stati Uniti (Stati Uniti) e in Europa. Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno un elevato contenuto polifenolico. I polifenoli hanno dimostrato di interagire con molti obiettivi molecolari e di esercitare numerose funzioni biologiche positive, inclusi gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e cardioprotettivi. I polifenoli isolati dalla mora (BL), dal lampone (RB) e dal lampone nero (BRB) riducono lo stress ossidativo e la senescenza cellulare in risposta all'angiotensina II (Ang II). Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata del protocollo utilizzato per preparare gli estratti di polifenoli da bacche congelate. Le estrazioni di polifenoli dalla polvere di bacche congelata sono state eseguite utilizzando l'etanolo acquoso al 80% ed un metodo di estrazione ad ultrasuoni. L'estratto grezzo è stato ulteriormente purificato e frazionato utilizzando cloroformio e acetato di etile,rispettivamente. Gli effetti di entrambi gli estratti grezzi e purificati sono stati testati su cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) in coltura.

Introduzione

I polifenoli sono composti che contengono almeno un anello fenolico nella loro struttura e sono abbondantemente presenti nel regno vegetale 1 . Gli esseri umani hanno consumato piante per millenni per scopi medicinali senza essere consapevoli dell'esistenza di tali composti 2 . Molti frutti e verdure hanno alcuni composti polifenolici condivisi, anche se con quantità diverse, tra cui flavonoidi, stilbene e acidi fenolici 3 . Anche se i polifenoli sono spesso associati a frutta e verdura colorati, questo non è strettamente vero. Ad esempio, zeaxantina e xantina sono presenti nelle verdure che non sono molto colorate, come le cipolle e l'aglio, provenienti dalla famiglia di scalloni e sono associati a numerosi benefici per la salute 4 . Oltre ad essere associati a numerosi vantaggi sanitari 5 , i polifenoli servono anche le piante proteggendole dagli insettiD radiazione ultravioletta 2 . I polifenoli si trovano comunemente nella dieta umana e sono considerati potenti antiossidanti, in quanto possono scavare le specie reattive di ossigeno (ROS) 6 , 7 , 8 . Hanno anche antinfiammatori 9 , antimicrobici 10 , antipertensivi 11 e 12 , 13 proprietà anti-cancerogene.

Gli studi epidemiologici dimostrano un'associazione inversa tra il consumo di flavonoidi e la malattia cardiovascolare (CVD) 16 , 17 e la mortalità 14 , 15 . Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno elevate quantità di polifenoli, compresi i flavonoidi. Ad esempio, il consumo di succo di mora (BL) (300 Ml / d) per otto settimane ha significativamente ridotto la pressione sistolica nei pazienti dislipidemici 18 . Jeong et al. 19 riportarono che gli uomini e le donne pre-ipertensivi che consumavano 2,5 g di estratto di lampone nero (BRB) al giorno avevano una pressione arteriosa più bassa di 24 ore e di notte rispetto a quelle che consumavano un placebo. Raspberries (RB) ha ridotto la pressione sanguigna mentre aumenta l'espressione di superossido dismutasi (SOD) in ratti spontaneamente ipertensivi 20 . Recentemente è stato dimostrato che BL, RB e BRB riducono i livelli di ROS e senescenza indotti da angiotensina II (Ang II) in cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) 21 . Inoltre, la frazione di antocianina dall'estratto BL ha ridotto l'espressione di sintesi dell'ossido nitrico induttivo (iNOS) e ha inibito l'attività del fattore nucleare kappa B (NF-κB) e della chinasi extracellulare-regolata (ERK) nel lipopolisaccaride (LPS) stimolata J774 celluleAss = "xref"> 22. Gli estratti BRB hanno ridotto l'attivazione di NF-κB e l'espressione cicloossigenasi 2 (COX-2) in vitro 23 , ha migliorato il profilo lipidico e ha impedito la formazione di lesioni aterosclerosi nei topi alimentati ad una dieta ad alto contenuto di grassi 24 . Le antocianine, considerate i flavonoidi più abbondanti nelle bacche, modulano la risposta infiammatoria nei macrofagi RAW 264.7 stimolati da LPS diminuendo la produzione di alfa TNF-α 25 e diminuendo la proliferazione e la migrazione di VSMCs 26 .

Dal momento che è cresciuto interesse a capire il ruolo dei polifenoli nella salute umana e nelle malattie, è importante ottimizzare il metodo di estrazione. L'estrazione del solvente è ampiamente utilizzata per questo scopo, in quanto è conveniente e facilmente riproducibile. In questo studio, è stata utilizzata un'estrazione di solvente con l'etanolo, insieme ad un estratto ad ultrasuoniN, che è stato adattato da Kim e Lee 27 . La purificazione e la frazionamento di estratti grezzi (CE) utilizzando cloroformio e acetato di etile sono state eseguite per ottenere la frazione di estratto purificato (PE) che è stato adattato da Queires et al 28 . Inoltre, sono stati confrontati l'efficacia degli estratti di polifenoli grezzi e purificati da BL alla riduzione della fosforilazione basale di ERK1 / 2 e sono stati forniti esempi rappresentativi dell'effetto inibitorio dell'estratto policifenolo BL purificato sulle riduzioni di segnalazione induciate da Ang II in VSMCs.

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Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

  1. Preparare l'etanolo 80% (100 mL) mescolando 80 mL di etanolo assoluto (grado di biologia molecolare) e 20 mL di acqua sterile a coltura cellulare.
  2. Per preparare l'estratto di polifenolo (10 mg / ml), pesare 10 mg di CE o PE. Aggiungere 1 ml di pianta Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sotto un cofano di cultura cellulare. Vortice la soluzione. Aliquota in porzioni da 200 μl e conservare a -20 ° C.
  3. Preparare il buffer di lisi.
    1. Aggiungere 5 ml di soluzione 1 M di base di HEPES (pH 7,4, 50 mM finale), 1 ml di soluzione a base di 5 M NaCl (finale di 50 mM), 1 ml di 0,5 M soluzione EDTA (5 mM finale), 2 ml di 0,5 Soluzione finale di M NaF (10 mM finale), 286 μL di 700 mM soluzione a base di Na 3 VO 4 (finale di 2 mM), 5 ml di soluzione a base di 200 mM Na 4 P 2 O 7 (10 mM finale) e 5 ml di Soluzione di stock di 20% Triton-X-100 preparata in acqua (finale 1%). Aggiungere acqua per raggiungere un volume di 100 mL. Tenere a 4 ° C.
    2. Aggiungere 10 μL / mL di cocktail inibitore della proteasi. Aggiungere fresco quando le cellule sono pronte per la lisi.
  4. Preparare il buffer di campionamento Laemmli (4x).
    1. Aggiungere 31,25 ml di soluzione a base di 2 M Tris (pH 6,8), 100 ml di glicerolo, 50 ml di una soluzione di sodio dodecil solfato (SDS) al 20% preparata in acqua e 50 ml di β-mercaptoetanolo. Aggiungere acqua fino a 250 ml. Tenere a 4 ° C.
  5. Per preparare il tampone Tris-Buffered Saline (TBS), pesare 3 g di Tris (25 mM finale), 0,18 g di KCl (2,5 mM finale) e 8,76 g di NaCl (150 mM finale). Regolare il pH a 7,4 e aggiungere acqua fino a 1 L. Tenere a RT.
  6. Per preparare TBS-T, aggiungere 997,5 ml di TBS e 2,5 ml di una soluzione al 20% di Triton-X-100 preparata in acqua. Tenere a RT.

2. Preparazione degli estratti di Blackerry

  1. Preparazione di estratto grezzo dalla polvere di bacche congelata.
    1. Pesare 10 g di polvere di mirtillo congelato (o 5 g di polvere fresca). Se viene utilizzato frutto congelato, tagliarlo iIn pezzi molto piccoli prima di iniziare l'estrazione.
    2. Mescolare la polvere di frutta con 100 ml di etanolo acquoso 80% in un pallone Erlenmeyer da 1 litro rotondo.
    3. Sonicare la miscela per 20 minuti a 42 kHz, 135 W utilizzando un bagno a ultrasuoni a 25 ° C, senza intervallo di tempo tra. Effettuare la sonicazione con continuo azoto azionato in luce sottomessa. Per la frutta congelata, aumentare il tempo di incubazione a 4 ore.
    4. Filtrare la miscela attraverso una carta filtrante # 2 utilizzando un imbuto raffreddato Buchner con aspirazione a vuoto.
      NOTA: Alla fine di questo passaggio, i residui del campione appaiono sulla carta del filtro; Questo è chiamato torta di filtro.
    5. Sciacquare la torta filtrante con 50 ml di etanolo al 100%. Salvare il filtrato e aggiungere la torta filtrante a una tazza da 1 L contenente 100 mL di etanolo acquoso 80%.
    6. Ripetere il processo di estrazione del residuo (punti 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Combinare i due filtrati in un pallone a tondo con un ulteriore 50 mLDel 80% di etanolo acquoso.
      NOTA: Il volume finale deve essere di circa 300 ml.
    8. Utilizzare un evaporatore rotativo a 62 ° C e 50 giri / min per evaporare il solvente. Continuare questo processo fino a quando l'etanolo non si evapora più.
      NOTA: Questo processo dura circa 45 minuti.
    9. Trasferire il campione in un tubo conico da 50 ml. Evaporare l'etanolo iniettando gas azoto nella parte superiore del tubo per 10 min.
      NOTA: Questo passaggio è necessario per garantire l'evaporazione completa dell'etanolo. Il volume del campione a questo punto è di circa 20 ml.
    10. Freeze il campione a -80 ° C per almeno 24 h.
      NOTA: questo passaggio è necessario per consentire un più efficiente processo di essiccazione a congelamento.
    11. Asciugare il campione a -50 ° C per circa 8 ore. Conservare i campioni a -20 ° C.
      NOTA: L'essiccatore a congelatore crea un vuoto potente a -50 ° C all'interno della camera per asciugare i campioni ma conserva la maggior parte dei composti, come il polipheNOLS.
  2. Preparazione di estratti polifenolici purificati da estratti grezzi.
    1. Pesare i campioni estratti congelati.
      NOTA: Il volume dell'estratto a questo punto è di circa 10 ml.
    2. Aggiungere due volumi (~ 20 mL) di cloroformio all'estratto grezzo e agitare la soluzione per 5 minuti in una mescola.
    3. Versare la miscela in un imbuto separatore. Lasciare decantare l'estratto grezzo per 1 h in RT per ottenere la frazione purificata.
      NOTA: A questo passo si forma una miscela a due fasi.
    4. Scartare lo strato inferiore (fase di cloroformio) dall'imbuto di separazione e raccogliere lo strato acquoso in un bicchiere pulito.
    5. Aggiungere due volumi di acetato di etile alla frazione acquosa e utilizzare una barra magnetica per mescolare la miscela per 5 minuti a RT.
    6. Filtrare la miscela con carta filtrante # 2 usando un imbuto raffreddato Buchner con aspirazione sotto vuoto.
    7. Raccogliere il campione filtrato e trasferirlo in un pallone a tondina per essere noiCon l'evaporatore rotativo.
    8. Impostare l'evaporatore rotativo a 62 ° C e 50 rpm ed evaporare l'acetato di etile per circa 30 minuti.
    9. Asciugare il campione a -50 ° C per circa 8 ore. Trasferire il campione in un tubo conico da 50 ml e conservarlo a -20 ° C.

3. Trattamento di VSMC con estratti di Berry

  1. VSMCs cultura.
    1. Isolare VSMC dalle aortas toraciche dei ratti di Sprague-Dawley eseguendo una digestione enzimatica, come descritto in precedenza 29 . Coltivare i VSMC come descritto 29 .
    2. Preparare un mezzo completo per la coltura di VSMC usando DMEM contenente 1 g / L di glucosio e completato con 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 100 U / mL penicillina, 100 mg / mL streptomicina e 2 mM L-glutamina. Conservare il supporto completo a 4 ° C.
  2. Incubazione di VSMC con estratti di polifenoli.
    1. Per dividere i VSMC, scartare il cultuRe e lavare le cellule due volte con soluzione salina fosfatizzata (PBS). Aggiungere 4 mL di PBS e 2 mL di EDP 0,25% di tripsina. Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C in un incubatore di CO 2 .
      1. Raccogliere le cellule, mescolarle con 2 ml di mezzo completo in un tubo centrifugo da 15 ml e centrifugare a 1100 g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 ml di PBS. Conta le cellule usando un emocitometro.
      2. Sezionare 50.000 VSMCs per pozzetto in piastre di coltura a 6 pozzetti e svilupparle in un mezzo completo contenente il 10% di FBS fino a raggiungere il 90% di confluenza (circa 3 d). Mantenere i VSMC a 37 ° C in un incubatore di umidità del 5% CO 2 .
    2. Preparare il mezzo per il trattamento utilizzando un mezzo di DMEM contenente 1 g / L di glucosio, 100 U / mL di penicillina, 100 mg / mL di streptomicina, 2 mM di L-glutammina e 0,5% di FBS. Conservare il supporto di trattamento a 4 ° C.
      NOTA: Estratti di polifenoli e Ang II vengono aggiunti direttamente alle cellule utilizzando questo medium.
    3. Preparare una soluzione di base di 10 mg / ml di estratto grezzo (CE) o di estratto purificato (PE) di polifenoli sciogliendo 10 mg di estratto in 1 ml di mezzo DMEM normale. Conservare le azione in aliquote da 200 μL a -20 ° C.
    4. Incubare i VSMC con 2 ml di terreno di trattamento contenente 0,5% di FBS e aggiungere estratti CE o PE per ottenere una concentrazione di 50-500 μg / ml. Cambiare il supporto ogni 24 h aggiungendo estratti di polifenoli freschi. Trattare le cellule per 3 d.
    5. Per il trattamento con Ang II o altri ormoni e fattori di crescita, affamati le cellule per almeno 24 ore incubando le cellule con terreno di trattamento contenente 0,5% di FBS prima dell'aggiunta di Ang II (100 nM).
      NOTA: Si raccomanda l'incubazione con e senza CE e PE nel mezzo di trattamento FBS di 0,5% prima dell'aggiunta di Ang II.
      1. Dopo 24 ore di fame, aggiungere 100 nM Ang II. Sostituire il terreno di trattamento con fresco CE, PE o Ang II ogni 24 ore per 3 d.
  3. Preparazione di campioni di cellule.
    1. Lavare le cellule trattate due volte in PBS freddo e lipezzare con 200 μl di tampone di lisi sul ghiaccio.
    2. Raccogli i lisati delle cellule usando i raschiatori di cellule e trasferendo i lisati in tubi di microcentrifuga da 1,5 mL. Incubare i lisati cellulari totali per 20 minuti su ghiaccio e vortex ogni 5 min.
    3. Sonicare l'estratto delle cellule con tre bursts a 125 W per 10 s ciascuno, con una pausa di 2 s in mezzo. Tenere i campioni in ghiaccio per tutta la sonicazione.
    4. Misurare la concentrazione proteica utilizzando un reagente di analisi proteica a 595 nm.
    5. Conservare i campioni a -20 ° C per l'analisi mediante blot western.
  4. Western blot.
    1. Mescolare uguali quantità di proteine ​​(circa 50 μg) dai campioni trattati non trattati e trattati con polifenoli o trattati con Ang II con tampone di lisi per ottenere un volume totale massimo di 50 μL. Aggiungere 16 μl di un tampone di campione 4x Laemmli. Riscaldare i campioni per 5 minuti a 75 ° C.
    2. Separare il campioneIn 10% di gel SDS-PAGE e trasferirli a membrane PDVF a 10 V per 75 minuti in un sistema di trasferimento semi-secco per analisi Western blot con anticorpi specifici.
    3. Bloccare la membrana con 2% di latte in TBS 0.05% Triton-X100 buffer (TBS-T) per 20 minuti.
    4. Rimuovere il latte lavando la membrana almeno tre volte con TBS (5 min ciascuno) e incubare con anticorpi primari per 1 h a RT o O / N a 4 ° C.
    5. Lavare la membrana tre volte, 10 minuti ciascuno, con TBS-T e incubare con un anticorpo secondario collegato HRP per 45 min.
    6. Lavare la membrana tre volte, 10 minuti ciascuno, con TBS-T e sviluppare mediante chemiluminescenza aumentata (ECL).

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Risultati

È stato dimostrato in precedenza che gli estratti di polifenoli isolati da BL, RB e BRB hanno ridotto la senescenza dei VSMC in risposta a Ang II 21 . È stato dimostrato che questi estratti polifenolici purificati modulano la segnalazione di Ang II riducendo la fosforilazione di Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL impedisce la senescenza riducendo l'espressione della NADPH ossidasi (Nox) 1, un enzima che produce anioni superossidich...

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Discussione

I polifenoli isolati dalle bacche contengono composizioni distinte. Il protocollo di estrazione a base di etanolo qui descritto ha permesso di identificare diversi livelli di acidi fenolici e flavonoidi presenti nei grezzi e purificati estratti polifenolici di BL ( Tabella 1 ). CE è stata arricchita in acido gallico, acido ferulico, acido 4-O-caffeoilchinico e acido 5-O-caffeoilchinico. Il processo di purificazione non alterava significativamente i livelli di acido gallico e acido p-cumarico. Tuttavia, ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dall'American Heart Association (14GRNT20180028) e dal Florida State University Council sulla ricerca e la creatività (COFRS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Angiotensina IISigma-Aldrich, Inc.A9525-10MGTrattamento di VSMCs
β-actinaSigma-Aldrich, Inc.A2228Anticorpo primario (1:5000)
Mora fruttoMercer FoodsMora liofilizzata in polvere
Catalasi Calbiochem219010Anticorpo primario (1:1000)
CloroformioBiotech Grd, Inc.97064-678Preparazione di estratti di polifenoli purificati
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM )Mediatech, Inc.10-014-CVColtura di etanolo VSMC
(grado assoluto di biologia molecolare)Sigma-Aldrich, Inc.E7023-500MLPreparazione di estratti di polifenoli 
Acetato di etileSigma-Aldrich, Inc.439169Preparazione di estratti di polifenoli purificati
ERK1/2Cell Signaling Technology, Inc.9102SAnticorpo primario (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0Teknova, Inc.E0306Tampone di lisi
LiofilizzatoreLabconcoVirTis Benchtop KPreparazione di estratti di polifenoli
Siero fetale bovino (FBS)Seradigm1400-500Coltura cellulare
HEPESSigma-Aldrich, Inc.H3375Tampone di lisi 
NaClEMD Millipore, Inc.7760Tampone di lisi
NaFJ.T.Baker, Inc.3688-01 Tampone di lisi
Na3VO4Sigma-Aldrich, Inc.450243Tampone di lisi
Na4P2O7 , decaidratoSigma-Aldrich, Inc.S-9515Tampone di lisi
fosfo ERK1/2 Tecnologia di segnalazione cellulare, Inc.9101SCocktail di inibitori della proteasi (1:1000) anticorpi primari
Sigma-Aldrich, Inc.P8340-5mlTampone di lisi
Reagente colorante per il dosaggio delle proteineBio-Rad Laboratories, Inc.500-0006Misurazione della concentrazione di proteine
Membrana di trasferimento PVDFThermo Scientific, Inc.88518Western blots
Evaporatore rotatorioBuchi LabortechnikRotavapor
R3000		Preparazione di estratti di polifenoli
Acqua sterileMediatech, Inc.25-055-CVPreparazione di estratti di polifenoli
SonicatorQSonica, LLCQ125Preparazione di estratti cellulari
SOD2Enzo Life Sciences, Inc.ADI-SOD-110-FAnticorpo primario (1:1000)
Triton-X-100Sigma-Aldrich, Inc.X100Western blots
Whatman #2 carta da filtroGE Healthcare, Inc.28317-241Preparazione di estratti di polifenoli

Riferimenti

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