Articolo metodologico

Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

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DOI:

10.3791/55609

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31 maggio 2017

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1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Science, University of Pennsylvania, 2Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 4School of Biomedical Engineering, Drexel University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto specifica la realizzazione di reti neurali rivelate micro-tessuto: costruzioni tridimensionali di dimensioni microniche costituite da tratti longitudinali allineati allineati che comprendono la popolazione neuronale aggregata racchiuse in un idrogel tubolare. Questi impalcature viventi possono servire come relè funzionali per ricostruire o modulare la circuiteria neurale o come test-letti biofidelici che imitano la neuroanatomia della materia grigio-bianca.

Abstract

Il recupero funzionale si verifica raramente dopo lesioni o degenerazioni causate da malattie all'interno del sistema nervoso centrale (CNS) a causa dell'ambiente inibitorio e della limitata capacità di neurogenesi. Stiamo sviluppando una strategia per affrontare simultaneamente la perdita di percorso neuronale e axon all'interno del CNS danneggiato. Questo manuale presenta il protocollo di fabbricazione per reti neurali (micro-TENN) progettate da micro-tessuti, costruzioni impiantabili costituiti da neuroni e tratti assonali allineati che attraversano il lumen di matrice extracellulare (ECM) di un cilindro idrogelizzato preformato centinaia di micron di diametro che può estendere centimetri in lunghezza. Gli aggregati neuronali sono delimitati agli estremi dell'incasso tridimensionale e sono allineati da proiezioni assonali. Le micro-TENN sono in una posizione unica come strategia per la ricostruzione del CNS, che emulano aspetti della cytoarchitettura del connettore del cervello e potenzialmente forniscono mezzi per la sostituzione della rete. Il neuGli aggregati ronalmente possono sinaptare con il tessuto ospite per formare nuovi relè funzionali per ripristinare e / o modulare i circuiti mancanti o danneggiati. Questi costrutti possono anche agire come "scaffolds viventi" pro-rigenerativi capaci di sfruttare meccanismi di sviluppo per la migrazione cellulare e la percorrenza axonale, fornendo segnali strutturali e solubili sinergici basati sullo stato di rigenerazione. Le micro-TENN sono fabbricate versando idrogel liquido in uno stampo cilindrico contenente un ago centrato longitudinalmente. Una volta che l'idrogelo ha gellato, l'ago viene rimosso, lasciando una micro-colonna vuota. Una soluzione ECM viene aggiunta al lumen per fornire un ambiente adatto per l'adesione neuronale e l'espansione assonica. I neuroni dissociati vengono aggregati meccanicamente per una precisa semina all'interno di una o entrambe le estremità della micro-colonna. Questa metodologia crea in modo affidabile i costrutti miniaturizzati indipendenti con tratti assonali prolungati che possono ricapitolare le caratteristiche della neuroanatomia cerebrale. Synaptic immGli indicatori di calcio non codificati e codificati geneticamente suggeriscono che le micro-TENN posseggano un'ampia distribuzione sinaptica e un'attività elettrica intrinseca. Di conseguenza, le micro-TENN rappresentano una strategia promettente per la ricostruzione neurochirurgica mirata dei percorsi cerebrali e possono anche essere applicati come modelli biofidelici per studiare i fenomeni neurobiologici in vitro .

Introduzione

Una caratteristica comune dei disturbi e delle malattie del sistema nervoso centrale (CNS) come la lesione traumatica del cervello (TBI), lesioni del midollo spinale (SCI), ictus, malattia di Alzheimer e la malattia di Parkinson è la disconnessione dei percorsi assonali e delle cellule neuronali Perdita 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Ad esempio, quando un colpo ischemico non viene trattato, si stima che gli assoni siano persi a una velocità di 7 miglia di assoni al minuto 5 . Nel caso di TBI, che circa 1,7 milioni di persone sperimentano ogni anno negli Stati Uniti, la degenerazione assonale può continuare a verificarsi anni dopo il trauma, in quanto il pregiudizio iniziale precipita uno stato neurodegenerativo a lungo termine 4 . Aggravatando questi effetti deleteri, il CNS ha una capacità fortemente limitataCittà per la rigenerazione 1 , 7 , 8 , 9 . Dopo la lesione, si sviluppa un ambiente inibitorio caratterizzato da una mancanza di guida diretta a bersagli distanti, nella presenza di inibitori associati alla mielina che ostacolano la crescita del neurite e la formazione di una cicatrice gliale mediante astrociti reattivi 8 , 10 , 11 , 12 . La cicatrice gliale serve come barriera biochimica e fisica alla rigenerazione, con molecole come proteoglicani di condroitina solfato che ostruiscono la crescita dell'assone 8 , 11 . Inoltre, anche se le cellule staminali neurali sono state trovate nel CNS adulto, la produzione di nuovi neuroni è limitata, in quanto una prova consistente di neurogenesi è stata trovata solo nel bulbo olfattivo, l'ippocampoZona subgranulare, zona periventricolare e canale centrale del midollo spinale 13 , 14 . Questi ostacoli impediscono il recupero funzionale dei neuroni perduti e dell'architettura della materia bianca dopo lesioni o malattie, con conseguente effetto spesso alterato e prolungato di queste condizioni.

Nonostante la mancanza di capacità rigenerativa nel CNS adulte, è stato dimostrato che la rigenerazione assonale è possibile se vengono presentati adeguati suggerimenti ambientali ai neuroni ospiti 15 , 16 , 17 , 18 . I ricercatori hanno cercato di trasportare e manipolare fattori di crescita ( ad esempio, fattore di crescita del nervo, fattore di crescita epidermico, fattore di crescita dipendente dagli ialti e fattore neurotrofico 3) e altre molecole di guida per stimolare la plasticità e la rigenerazione dell'assone 14 ,/ Sup> 18 , 19 . Anche se questi studi hanno confermato che gli assoni adulti sono in grado di rispondere ai fattori di crescita, queste strategie sono limitate dalla bassa permeabilità della barriera emato-sangue e dalle specifiche sfumature spaziali e temporali necessarie per promuovere la rigenerazione 14 , 18 e 19 . Altri approcci hanno affidato l'iperattivazione dei fattori di trascrizione correlati alla rigenerazione nei neuroni del CNS. Ad esempio, la sovraespressione del fattore di trascrizione Stat3 stimola la rigenerazione assonale nel nervo ottico 20 . Tuttavia, sia la consegna della biomolecola che la sovraespressione dei fattori di trascrizione non riescono a sostituire le popolazioni neuronali perse. Le strategie cellulari sono state principalmente incentrate sul trapianto di cellule staminali neurali (NSC) nel CNS, sfruttando la loro capacità di sostituire i neuroni CNS, rilasciare fattori trofici,E sostenere i tentativi di neurogenesi che si verificano dopo lesioni 17 . Nonostante ciò, ci sono ancora pressanti sfide che ostacolano questo approccio, compresa la capacità ostacolata delle cellule neurali trapiantate per sopravvivere, integrarsi con l'ospite e rimanere spazialmente limitati all'area ferita 6 , 14 , 17 , 21 . Inoltre, la sola consegna cellulare non è in grado di reintegrare la citoarchitettura di percorsi axonal danneggiati o persi. Un approccio alternativo che affronta i problemi che si trovano ad affrontare le strategie di consegna di cellule e droga / chimica sta combinando questi approcci con l'uso dei biomateriali 14 , 22 , 23 . I biomateriali come gli idrogeli sono in grado di emulare le proprietà biochimiche e fisiche della matrice extracellulare (ECM), aiutando la distribuzione cellulare eD all'interno dell'area ferita e fornendo fattori di crescita e altre molecole bioattive con rilascio controllato 22 . Le caratteristiche interessanti di queste strategie basate su biomateriali hanno portato alla prova della rigenerazione assonica in vivo dopo il trapianto di scaffolds alla zona lesionata 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Tuttavia, le strategie biomateriali acellulari non sostituiscono le popolazioni neuronali perse; Quando vengono utilizzati come veicoli di erogazione per cellule precursori neuronali, gliali o neuronali, i biomateriali non sono in grado di ricostituire reti assonali a lunga distanza. La sfida di sviluppare un approccio che affronta sia la degenerazione del percorso assonale che la perdita neuronale associati a lesioni e malattie del CNS rimangono ancora 31.

Il nostro gruppo di ricerca ha riportato in precedenza lo sviluppo di reti neurali (micro-TENN), progettate da micropagnetismi impiantabili, che sono un tipo di "scaffold vivente" costituito da corpi cellulari neuronali limitati a una o entrambe le estremità di una micro-colonna idrogel-ECM agarosio , Con tratti assonali allineati in tutto l'interno di questo incasso tridimensionale (3D) 1 , 10 , 31 , 32 . Una delle principali differenze tra questa tecnica e gli approcci precedenti è che la citoarchitettura delle micro-TENNs è stata completamente creata in vitro e viene poi trapiantato dopo 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . La fabbricazione in vitro offre un ampio controllo spaziale e temporale del fenotipo cellulare e dell'orientamento, delle proprietà meccaniche / fisiche, dei segnali biochimici e dei fattori esogeni, che beneficiano dell'integrazione di questi scaffolds con l'ospite dopo l'impianto 41 , 42 . Le micro-TENN sono ispirate anatomicamente perché emulano la neuroanatomia del cervello, mostrando tracce assonali simili a quelle che ponte le distinte aree funzionali del cervello ( Figura 1A ) 1 . Pertanto, questa strategia potrebbe essere in grado di sostituire fisicamente i tratti di tessuti bianchi persi e neuroni dopo l'impianto in una regione lesionata. Questa tecnica è ispirata anche da meccanismi di sviluppo in cui "scaffolds viventi naturali" formati da cellule gliali radiali e assoni pionieristici agiscono come guide di percorrenza per celluleMigrazione dalla zona subventricolare e outgrowth axon, rispettivamente 43 . Questi meccanismi sono ricapitolati nei tratti assonali allineati di micro-TENN, che possono presentare percorsi di vita per la migrazione delle cellule neurali e la rigenerazione assonale mediante una crescita assonale mediata dall'assone ( Figura 1C ) 43 . Inoltre, questa strategia sfrutta l'integrazione sinaptica tra i neuroni micro-TENN e il circuito nativo, formando nuovi relè che possono contribuire al recupero funzionale ( Figura 1B ) 43 . La capacità di formazione di sinapsi può anche concedere a questo approccio la capacità di modulare il CNS e di rispondere al tessuto dell'ospite in base ai feedback di rete. Ad esempio, i neuroni ottogeneticamente attivi nei montanti viventi possono essere stimolati per modulare i neuroni dell'ospite attraverso interazioni sinaptiche ( Figura 1D ).

Inoltre, il costruttore tubolare a base biomaterialeLa presenza di micro-TENN offre un ambiente adeguato per l'adesione, la crescita, l'estensione del neurite e la segnalazione delle cellule, mentre le dimensioni in miniatura dei costrutti potenzialmente consentono l'impianto minima invasivo e forniscono un microambiente parzialmente sequestrato per una graduale integrazione nel cervello. Infatti, le pubblicazioni recenti hanno dimostrato il potenziale delle micro-TENN per imitare i percorsi neurali dopo l'impianto nel cervello del topo. A seguito di microinjection stereotassiale, abbiamo precedentemente riportato prove di sopravvivenza neuronale micro-TENN, mantenimento dell'architettura del tratto assonale e estensione del neurite nella corteccia ospite per almeno 1 mese in vivo 10 , 31 . Inoltre, l'etichettatura con la sinapsina ha fornito prove istologiche dell'integrazione sinaptica con il tessuto nativo 10 , 31 . Nel complesso, le micro-TENN possono essere particolarmente adattate per ricostruire e modulare danniCNS sostituendo i neuroni perduti, integrando sinapticamente con il circuito ospite, ripristinando la citoarchitettura assonale persa e, in alcuni casi, fornendo assoni rigeneranti con gli opportuni segnali di percorrenza.

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Figura 1: Principi e ispirazione dietro lo sviluppo di reti neurali innovative (micro-TENN). ( A ) Le micro-TENN simulano la citoarchitettura del connettore del cervello (viola), in cui regioni funzionalmente distinte sono collegate da tratti assonali lunghi e allineati in modo unidirezionale (rosso, verde) o bidirezionale (blu). Come esempio, le micro-TENN potrebbero ricostituire le connessioni perse in percorsi corticotalamici e nigrostriatali o nel percorso perforante dalla corteccia entorilina all'ippocampo (adattato da Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Diagramma di una unidirezioneL e bidimensionale micro-TENN (rosso e blu) sinapticamente integranti con il circuito ospite (viola) per servire come relè funzionale tra le due estremità di una lesione. ( C ) Schema dei tratti assonali di un micro-TENN unidirezionale (verde) che funge da guida per la rigenerazione degli assoni ospitanti (viola) facilitati dall'assone verso un obiettivo con cui il micro-TENN interagisce. ( D ) Schema concettuale dell'utilizzo di micro-TENNS attivo-otticamente attivi come neuromodulatori, sfruttando l'integrazione sinaptica con neuroni eccitatori o inibitori (in basso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'attuale manoscritto illustra la metodologia utilizzata per la realizzazione di micro-TENN utilizzando i neuroni corticali cerebrali embrionati. In particolare, le micro-TENN potrebbero essere fabbricate con altri tipi di cellule neurali. Per esAmpiamente, i primi rapporti di sviluppo micro-TENN di successo hanno caratterizzato i neuroni del ganglio radicale dorsale (DRG) 32 . Le micro-colonne idrogel possono essere generate ( Figura 2A ) aggiungendo agarosio liquido ad una matrice cilindrica a taglio laser su misura oa tubi capillari, entrambi contenenti aghi allineati di agopuntura. L'ago forma il lumen e determina il diametro interno (ID) della micro-colonna, mentre l'ID tubo capillare e il diametro dei cilindri nel dispositivo taglio laser dettano il diametro esterno (OD) dei costrutti. L'OD e l'ID possono essere scelti in base all'applicazione desiderata selezionando diametri differenti per i tubi del dispositivo / capillare e gli aghi di agopuntura rispettivamente. La lunghezza delle micro-colonne può anche essere variata; Ad oggi, abbiamo riportato la costruzione di micro-TENN fino a 20 mm di lunghezza 10 e perseguono attivamente lunghezze ancora più lunghe. Dopo i gel agarosici e l'agopuntura nLe eedle vengono rimosse, una soluzione ECM generalmente costituita da collagene di tipo I e laminina viene aggiunta al lumen dei costrutti ( figura 2C ). Il nucleo ECM fornisce un ponteggio per supportare l'adesione delle cellule neuronali e l'espansione assonica. Inizialmente i neuroni corticali primari del ratto venivano placcati nelle micro-colonne utilizzando sospensioni cellulari dissociate 10 , 31 , 32 . Tuttavia, questo approccio non ha prodotto la citoarchitettura target in tutti i casi, definita come i corpi delle cellule neuronali limitati alle estremità delle micro-colonne, con il lumen centrale costituito da tratti assonali puri allineati. Da allora, l'uso di un metodo di aggregazione neuronale forzata (basato su protocolli adattati da Ungrin e altri ) ha permesso una più affidabile e coerente fabbricazione di micro-TENNs con la struttura ideale ( figura 2B ) 44 . Oltre a descrivere la correnteMetodo, questo articolo mostrerà rappresentativi di fase-fase e immagini confocali di micro-TENN che dimostrano la formazione di tratti assonali nel tempo, così come la citoarchitettura finalizzata. Questo manoscritto si espanderà anche sugli aspetti degni di nota del protocollo e sulle sfide e sulle future direzioni della tecnologia micro-TENN.

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Figura 2: Diagramma schema del processo di fabbricazione micro-TENN a tre stadi. ( A ) Sviluppo dell'idrogel agarosico: (i) Inizialmente, un piccolo aghi di agopuntura ( ad esempio , diametro di 180-350 μm) viene inserito nei canali cilindrici di uno stampo a taglio laser su misura o di un capillare ( ad es. , Diametro 380-700 μm). Nella fase successiva, l'agarosio liquido in DPBS viene introdotto nei canali cilindrici o nei tubi capillari. (Ii) Dopo i gel di agarosio, l 'ago viene rimosso eLo stampo viene smontato per produrre le micro-colonne cave agarose. (Iii) Questi costrutti vengono poi sterilizzati e memorizzati in DPBS. ( B ) La cultura neuronale primaria e il metodo aggregato: (i) L'aggregazione neuronale viene eseguita in matrici di micro-pozzi piramidali, stampate da stampi stampati in 3D, che si inseriscono nei pozzetti di una piastra di coltura a 12 pozzetti. (Ii) Le micro-TENN includono i neuroni primari di ratto dissociati dai cervelli fetali dei ratti embrionali-giorno-18. Dopo la dissociazione tissutale con trypsina-EDTA e DNasi I, viene preparata una soluzione cellulare di densità 1,0-2,0 x 106 cellule / mL. Iii) 12 μL di questa soluzione vengono trasferiti a ciascun pozzetto nella matrice piramidale a micro-pozzetto. La piastra contenente questi micro-pozzetti viene centrifugata per produrre aggregati cellulari. (Iv) Questi vengono quindi incubati durante la notte prima della placcatura nelle micro-colonne. ( C ) Fabbricazione del nucleo ECM e sementi cellulari: (i) Prima della semina cellulare, una soluzione ECM contenente 1 mg / ml di collagene di tipo I e 1 mg / mlIl laminino viene trasferito all'interno delle micro-TENN e permesso di polimerizzare. (Ii) A seconda che si producano micro-TENN unidirezionali o bidirezionali, un aggregato viene posto rispettivamente in uno o entrambi gli estremi della micro-colonna. (Iii) Dopo un periodo di incubazione per promuovere l'adesione, le micro-TENN vengono coltivate in piatti Petri inondati con un mezzo basale neuronale embrionale integrato. (Iv) Dopo 3-5 giorni di coltura, la struttura finale del micro-TENN dovrebbe dimostrare gli aggregati di cellule agli estremi della micro-colonna, con tracce assonali che coprono la sua lunghezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

Tutte le procedure relative agli animali sono state approvate dai comitati istituzionali di cura degli animali presso l'Università di Pennsylvania e dal Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center e rispettano le linee guida stabilite dalla NIH Politica del Servizio Sanitario Pubblico sulla Humane Care and Use of Laboratory Animali (2015).

1. Sviluppo dell'idrogelo di agarosio (componente acellulare di micro-TENN)

  1. Preparazione della soluzione di agarosio
    1. All'interno di un cabinet per la biosicurezza, preparare i serbatoi per le micro-colonne trasferendo 20 ml di Dulbecco's fosfato-tamponato salina (DPBS) ad ognuno dei due piatti Petri da 10 cm. Sterilizzare pinze fine e microscalpelli con uno sterilizzatore a caldo.
    2. Pesare 3 g di agarosio e trasferirlo in un bicchiere sterile all'interno dell'armadio di biosicurezza. Aggiungere 100 mL di DPBS per una concentrazione finale del 3% in peso / volume (w / v). Includere un bar magnetico pulito e coprire il bicchiere con alumiNum foil.
    3. Con un piatto caldo / agitatore, scaldare il bicchiere a 100 ° C e mescolare a 120-200 giri / min per dissolvere completamente l'agarosio (la soluzione si trasformerà da nuvoloso a chiaro). Tenere il riscaldamento e mescolare in seguito per evitare la gelazione e modificare la temperatura di riscaldamento, se necessario, per evitare di bruciare l'agarosio.
      NOTA: La fabbricazione con il dispositivo di taglio laser e con i capillari è riportata di seguito nelle sezioni 1.2 e 1.3. Procedere alla sezione 1.4 dopo aver completato i passaggi descritti in una delle sezioni. Per entrambi i metodi di fabbricazione di micro-colonna, aggiungete velocemente l'agarosio liquido, poiché l'agarosio si solidifica velocemente in fase di raffreddamento. Quando si sterilizza con un autoclave in uno dei seguenti passaggi, utilizzare le condizioni standard applicate alle vetrerie.
  2. Preparazione a micro-colonna utilizzando un dispositivo tagliato a laser
    NOTA: il dispositivo tagliato a laser è tagliato da un acrilico trasparente utilizzando un tagliatore laser commerciale CO 2 . Il fabriLa cationizzazione di strutture e dispositivi mediante taglio laser è ben documentata per una vasta gamma di applicazioni di ingegneria e ricerca 45 , 46 , 47 . Questo stampo ( figura 3 ) è costituito da una serie di cinque canali cilindrici, ognuno con un diametro di 398 μm e una lunghezza di 6,35 mm. Queste matrici cilindriche sono formate lungo la loro lunghezza da due pezzi: una metà inferiore (lunghezza: 25,4 mm, larghezza: 6,35 mm, altezza: 6,0 mm) e una metà superiore (lunghezza 31,5 mm, larghezza: 6,35 mm, altezza: 12,7 mm ), Come mostrato nelle figure 3A e 3B rispettivamente. Le due metà possono essere bloccate insieme dai cappucci anteriori e posteriori osservati in Figura 3C (lunghezza: 31,5 mm, larghezza: 6,35 mm, altezza: 12,7 mm), che presentano quattro fori di allineamento coincidenti con due fori ciascuno in alto e in basso Pezzi e che aiutano a fissare tutte le parti insieme quando avvitate. Questi cappellini anche incCupi cinque fori, concentrici ai canali cilindrici, in cui gli aghi di agopuntura possono essere inseriti per formare il lumen delle micro-colonne.
    1. Sterilizzare il dispositivo mostrato in Figura 3 , rivestendolo con foglio di alluminio e autoclave. Montare il dispositivo come mostrato in Figura 3D allineando i tappi anteriori e posteriori con solo la parte inferiore inferiore e fissando i tre pezzi con due viti e dadi (diametro filo: 3,05 mm) delle viti 4-40 nei fori di allineamento inferiori.
    2. Introdurre completamente un ago agopuntura (diametro 180 μm, lunghezza 30 mm) nei fori dell'ago sul lato anteriore o posteriore del dispositivo ( Figura 3D ). Con una micropipetta, versare abbastanza agarosio liquido (~ 1 mL per i cinque canali) sulla parte inferiore inferiore per riempire completamente le metà dei canali cilindrici.
    3. Immediatamente posizionare la parte superiore superiore del dispositivo sopra la metà inferiore e applicare pressione fino a quando non è saldamente dentroPosto per completare i canali cilindrici (l'attrito tra i tappi e il pezzo superiore manterrà il secondo posto). Aspetta ~ 5 min a temperatura ambiente dopo l'aggiunta di agarosio per consentire la sua gelazione all'interno dei canali del dispositivo.
    4. Estrarre manualmente l'ago da ciascuno dei fori sui tappi del dispositivo. Rimuovere le viti e separare manualmente i due cappellini e la metà superiore dal pezzo inferiore, dove quest'ultima terrà le micro-colonne idrogel.
    5. Utilizzare pinze fine per rimuovere delicatamente le micro-colonne dai canali sul metà inferiore e posizionarli nel piatto Petri preparato in precedenza contenente DPBS (punto 1.1.1). Riutilizzare il dispositivo per un altro ciclo di fabbricazione a micro-colonna. Procedere alla sottosezione 1.4.
  3. Fabbricazione a micro-colonna con tubi capillari
    1. Trasferire tubi capillari di vetro (diametro: 398,78 μm, lunghezza: 32 mm) all'interno dell'armadio della biosicurezza. Interrompere manualmente(Diametro 180 μm, lunghezza 30 mm) in ogni frammento ( Figura 2A ).
    2. Trasferire 1 ml di agarosio liquido dal bicchiere alla superficie di un piatto Petri vuoto. Tenendo il tubo capillare e l'ago introdotto, posizionare un'estremità del tubo a contatto con la piscina di agarosio liquido per riempirla mediante azione capillare. Agitare il tubo per promuovere l'aumento capillare.
      NOTA: Riempire i tubi capillari con agarosio liquido quanto l'azione capillare consente; Successivamente, queste micro-colonne possono essere tagliate in costruzioni più piccole a seconda della lunghezza desiderata. La piscina di agarosio da 1 ml viene utilizzata tipicamente per un solo tubo, poiché l'agarosio raffredda e gel rapidamente, impedendo un'ulteriore azione capillare.
    3. Quando il liquido cessa di salire, rimuovere il tubo capillare dalla piscina e posizionarlo orizzontalmente sulla superficie di un piatto di Petri. Attendere 5 min per lasciare il gel agarosio all'interno dei tubi/ Li>
    4. Posizionare il pollice e il dito indice su entrambi i lati del tubo e premere contro di esso. Usate l'altra mano per estrarre rapidamente l'ago usando il pollice e il dito indice per evitare che la micro-colonna scivoli fuori dal tubo. Inserire un ago da 30 gauge nel tubo capillare per spingere lentamente la micro-colonna in un piatto contenente DPBS (punto 1.1.1).
  4. Taglio e sterilizzazione a micro-colonna
    1. Trasferire delicatamente una micro-colonna da DPBS a un piatto vuoto utilizzando pinze fine. Aggiungere 10 μL di DBPS alla parte superiore della micro-colonna con una micropipetta per evitare l'essiccazione. Posizionare quest'ultimo piatto sotto uno stereoscopio per una guida visiva.
      NOTA: Durante il protocollo, l'essiccazione a micro-colonna o la disidratazione si riferisce all'acquisizione di una struttura sgualcita che è visivamente distinguibile dall'aspetto tipico e idratato di questi costrutti. Le micro-colonne disidratate fissano saldamente alla superficie dei piatti di Petri e cSi può facilmente spostare, mentre i costrutti idratati tendono a scivolare attraverso la superficie dopo essere stati manipolati con pinze. Un'immagine a contrasto di fase di una micro-colonna completamente seccata è mostrata nella Figura 8A .
    2. Tagliare la micro-colonna con un microscalpello per abbreviarlo alla lunghezza desiderata (qui, 2-5 mm). Trasportare la microcassetta tagliata con pinze fine per l'altro piatto Petri di DPBS preparato al punto 1.1.1.
    3. Ripetere i passaggi 1.4.1 e 1.4.2 per ogni micro-colonna fabbricata.
    4. Sterilizzare le micro-colonne nei piatti Petri contenenti DPBS con luce ultravioletta (UV) per 1 h. Conservare i piatti di Petri a 4 ° C prima dell'aggiunta di ECM e della placcatura delle cellule.

2. La cultura dei neuroni primari e il metodo di aggregazione delle cellule forzate

  1. Preparazione della matrice piramidale a micro-pozzetto
    NOTA: Questa sezione utilizza uno stampo stampato in 3D costituito da una base cilindrica (diametro 2,2 cm, altezza 7,0 mm) a9 piramidi quadrati in cima (lunghezza laterale: 4,0 mm, angolo inclinato: 60 °), organizzati in un array 3 x 3, come mostrato nella Figura 3E . Il processo di fabbricazione degli additivi che utilizza stampanti 3D in commercio è ben documentato. Il software di progettazione computerizzato può essere utilizzato per progettare lo stampo. Il file di disegno risultante può quindi essere convertito digitalmente in un percorso utensile per una stampante 3D. Ogni stampante ha specifiche differenti e le istruzioni per l'impostazione e l'utilizzo di una stampante 3D variano di conseguenza.
    1. Utilizzare un foro da 3/32 "per forare 16 fori in un array 4 x 4 (lunghezza laterale: 4 cm, separazione fori: 1 cm), centrato nel coperchio di un piatto di Petri da 10 cm. Il pezzo inferiore del piatto di Petri per pesare 27 g di polidimetilsilossano (PDMS) e 3 g di agente di tintura (per un rapporto di 1:10). Mescolare con una micro spatola per distribuire uniformemente l'agente.
    2. Coprire il PDMS / agente di polimerizzazione con il coperchio forato. Collegare un'estremità di un tubo al vuotoInserire l'altra estremità nello stelo di un imbuto (diametro della bocca: 10 cm, lunghezza del gambo: 3 cm, diametro del gambo: 1,5 cm).
    3. Fate un'apertura con una punta da 3/32 "nella parte superiore di una lampadina a pipetta da 1 ml e inserire e fissare una punta di micropipetta da 1000 μL nell'apertura (con l'estremità appuntita verso l'alto). Mettere la lampadina e la punta nel tubo e tirare Il tubo verso l'alto fino a quando la lampadina non chiude il tubo nello stelo dell'imbuto.
    4. Posizionare l'imbuto sul coperchio piatto forato e fissare il tubo con un supporto robusto disponibile. Aprire la valvola a vuoto per 5 minuti per aspirare e portare le bolle d'aria sulla superficie.
    5. Chiudere la valvola, rimuovere l'imbuto e colpire il piatto di Petri contro la superficie del cappuccio fumo ~ 3 volte per scoppiare le eventuali bolle d'aria rimanenti.
    6. Posizionare uno stampo stampato in 3D a tre piani in ciascuno dei pozzetti in una piastra di coltura a 12 pozzetti, con le piramidi rivolte verso l'alto. Versare il PDMS / agente di polimerizzazione sopra gli stampi fino ad ogni pozzetto di tIl piatto è riempito. Coprire la piastra a 12 pozzetti con il suo coperchio e trasferirla in forno per 1 ora a 60 ° C per asciugare.
    7. Rimuovere con cautela ogni matrice micro-pozzetto PDMS ( Figura 3F ) dalla piastra con una micro-spatola. Coprire le matrici PDMS con foglio di alluminio e sterilizzare mediante autoclave. All'interno di un armadietto di biosicurezza, inserire una matrice di micro-pozzo in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti ( Figura 2B ).
  2. Isolamento dei neuroni corticali dai feti del ratto
    1. Aggiungere circa 20 ml di soluzione equilibrata di Hank (HBSS) a ciascuno di quattro o sei piatti di Petri da 10 cm (uno per ogni tessuto sezionato) all'interno di un armadio per la biosicurezza. Trasferire questi piatti in una capsula di dissezione e metterli in ghiaccio. Sterilizzare strumenti di dissezione, come microscalpelli, forbici e pinze, con uno sterilizzatore a caldo.
    2. Medio basale pre-caldo del neurone embrionale + supplemento senza serum al 2% + 0.4 mM L-glutamina (indicato come "mezzo di coltura" qui di seguitoR) e 0,25% di trysina + 1 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA) a 37 ° C. Sciogliere la deossiribonucleasi (DNase) I collocandola a temperatura ambiente. Preparare 1,5 ml di una soluzione DNAse I da 0,15 mg / ml in HBSS e mantenere la soluzione su ghiaccio.
    3. Eutanizzare un ratto di embryonic-day-18 in gravidanza mediante inalazione di anidride carbonica e confermare la morte per decapitazione. Trasferire la carcassa ad una cappa di dissezione sterile e posizionarla verso l'alto con l'estremità ventrale. Sciacquare bene l'addome con il 70% di etanolo.
    4. Aprire l'utero e rimuovere i feti (di solito 11) dai sacchi amniotici con forbici e trasferirli con pinze a un piatto di Petri contenente HBSS freddo, come descritto 48 . Posizionare un blocco di granito refrigerato (-20 ° C) sotto lo stereoscopio. Posizionare il piatto di Petri sulla superficie di questo blocco freddo per conservare la bassa temperatura dell'HBSS durante la procedura di dissezione.
    5. Sciacquare i cuccioli swishing HBSS intorno e poi trasferirli al piatto successivo pulitoContenente HBSS. Con l'aiuto dello stereoscopio e degli strumenti di dissezione, rimuovono in sequenza le teste, gli emisferi cerebrali e i cortici dei feti e trasferiscono ciascun tessuto con pinze a un nuovo piatto pieno di HBSS dopo ogni dissezione 48 .
    6. Aspirare solo i cortici con una pipetta Pasteur e collocare il tessuto in un tubo centrifugo sterile da 15 ml. Scartare gli altri tessuti sezionati. Sciacquare i cortici tre volte aggiungendo e rimuovendo in sequenza ~ 5 ml di HBSS con una pipetta sierologica. Mettere il tubo sul ghiaccio quando non è in uso.
    7. Trasferire i cortici con una pipetta Pasteur a un tubo da 15 mL contenente trypsin-EDTA pre-riscaldato (4-6 cortici per 5 mL di trypina-EDTA). Agitare manualmente il tubo una volta e posizionarlo a 37 ° C. Invertire il tubo ogni 3 minuti per evitare che il tessuto si blocchi.
    8. Fermare l'esposizione a trypsina dopo ~ 10 minuti rimuovendo il tessuto con una pipetta Pasteur e trasferendola a una centrifuga pulita da 15 mltubo. Aggiungere la soluzione da 0,15 mg / ml DNasi I (1,5 mL) al tubo con una pipetta.
    9. Utilizzare una pipetta Pasteur per rompere manualmente i grumi di tessuto e quindi vortice (~ 30 s) finché la soluzione non appare omogenea e non ci sono frammenti di tessuto rimanenti nel liquido. Se non è possibile completamente omogeneizzare la soluzione, estrarre i frammenti insolubili tirandoli nella punta di una pipetta Pasteur.
    10. Centrifugare la soluzione di cellule omogenea ottenuta nel punto 2.2.9 a 200 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur, facendo attenzione a non disturbare le cellule pelletate. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura con una pipetta sierologica e vortice per risospendere le cellule.
    11. Contare il numero di cellule nella soluzione preparata al punto 2.2.10 utilizzando un emocitometro; La resa prevista è 3,0-5,0 x 10 6 cellule / emisfero corticale. Preparare 1 mL o più di sospensione cellulare in mezzo di coltura, con una densità di 1,0-2,0 x 106 cellule / mL.
  3. Formazione di aggregati di cellule neuronali
    1. Con una micropipetta, aggiungere 12 μL della sospensione cellulare da 1,0-2,0 x 10 6 / mL in ciascun micro-pozzetto dell'array PDMS (che è stato inserito nella piastra nel punto 2.1.7).
      NOTA: la concentrazione cellulare può essere regolata in base all'ID ID micro-colonna e alla dimensione dell'aggregato cellulare desiderato, poiché le concentrazioni superiori producono aggregazioni maggiori.
    2. Centrifugare la piastra a 200 xg per 5 minuti per forzare l'aggregazione delle cellule in fondo ai micropiuma ( Figura 2B ). Aggiungere accuratamente 2 ml di terreno di coltura alla cima di ogni matrice PDMS per coprire tutti i micropiumini seminati, facendo attenzione a non disturbare le cellule aggregate.
    3. Se le cellule non saranno trasdurate con un vettore virale, incubare la piastra per 12-24 ore a 37 ° C e 5% CO 2 e quindi procedere alla sezione 3. Se gli aggregati saranno trasdotti, saltare l'incubazione e procedere alla sezione 2.4 .
  4. TranSduction con un vettore virale per osservare la segnalazione del calcio
    Nota: Queste fasi vengono eseguite per trasduzione di neuroni con un vettore virale contenente un indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI). I risultati mostrati in questo articolo sono stati ottenuti utilizzando un virus adeno associato commercialmente (AAV) (serotipo 1) con GCaMP6f, un GECI con rapida cinetica costituita da proteine ​​fluorescenti verdi (GFP), calmodulina (CaM) e peptide M13, Guidato dal promotore di Synapsin I umano. La soluzione vettoriale virale può richiedere la diluizione in DPBS sterile prima della trasduzione, a seconda della concentrazione della soluzione stock. La salute delle cellule / morfologia e la forza del segnale GCaMP6f devono essere osservate nel tempo per un intervallo di concentrazioni di vettori. Questa procedura di ottimizzazione deve essere eseguita da ogni investigatore per determinare il titolo appropriato per le proprie colture cellulari. Il tempo tipico di espressione di GCaMP6f è di 7-8 giorni dalla trasduzione che si verifica durante l'incubazione effettuata in stEp 2.4.2.
    1. Con una micropipetta, aggiungere il volume richiesto di soluzione virale vettoriale (per una concentrazione finale di ~ 3,0 x 10 9 copie genomiche per aggregato) al terreno di coltura, coprendo gli aggregati. Lentamente pipetta su e giù per assicurare che la soluzione vettoriale sia distribuita omogeneamente in tutto il mezzo di coltura.
    2. Incubare la piastra con i micropiumini piramidali seminati per 24 h a 37 ° C e 5% CO 2 per consentire la trasduzione virale di GCaMP6f.

3. Sviluppo del componente cellulare delle micro-TENN

  1. Fabbricazione di base ECM
    1. Dopo l'incubazione aggregata, aggiungere il collagene di tipo I e la laminina al terreno di coltura (per una concentrazione di 1 mg / mL ciascuna) in un tubo di microcentrifuga per preparare la soluzione ECM. Eseguire le fasi 3.1.2-3.1.4 a temperatura ambiente ma mantenere il tubo con ECM sul ghiaccio quando non è in uso per prevenire la gelazione precoce.
      NOTA: La spesa tipica è di 4 μL di soluzione ECM per ogni micro-colonna (lunghezza: 5 mm, ID: 180 μm).
    2. Regolare il pH della soluzione ECM trasferendo 1-2 μL in carta di lucido per verificare il pH iniziale, se necessario, aggiungendo 1 μl di idrossido di sodio 1 N (NaOH) e / o 1 N acido cloridrico (HCl) E ripetendo fino al pH 7,2-7,4. Assicurare l'omogeneizzazione della soluzione ECM pipettando su e giù evitando la formazione di bolle d'aria.
    3. Trasferire le microcollezioni con le pinze sterilizzate dai piatti nel punto 1.4.3 per vuotare i piatti Petri da 35 o 60 mm. Lavorare su 4-5 micro-colonne alla volta per prevenire la disidratazione. Fissare una punta da 10 μl attaccata ad una punta da 1000 μl a una micropipetta. Utilizzando lo stereoscopio per la guida visiva, posizionare la punta ad una estremità delle micro-colonne e aspirazione per estrarre il DPBS residuo e le bolle d'aria dal lumen.
    4. Creare velocemente 4-5 μL di ECM in una micropipetta. Osservando sotto uno steReoscopio, posizionare la punta della micropipetta in una delle estremità delle micro-colonne e scaricare abbastanza ECM per riempire il lumen. Confermare l'assenza di bolle d'aria nel lumen, in quanto potrebbero inibire l'espansione assonica attraverso l'ECM. Se esistono bolle d'aria, rimuovere l'ECM come descritto nel passaggio 3.1.3 e aggiungere nuovamente l'ECM.
    5. Per prevenire la disidratazione, aggiungere circa 2 μL di ECM attorno ad ogni micro-colonna. Incubare le micro-colonne idrogel / ECM nei piatti di Petri a 37 ° C e 5% di CO 2 per 25 min. Procedere alla coltura delle cellule immediatamente dopo l'incubazione.
      NOTA: Il periodo di incubazione nel punto 3.1.5 è destinato a consentire tempo per la polimerizzazione del collagene e della laminina all'interno delle micro-colonne.
  2. Seminazione delle cellule neuronali nelle micro-colonne
    NOTA: Per cambiare il mezzo di coltura degli aggregati trasduttori, inclinare la piastra, utilizzare una micropipetta per rimuovere il mezzo che si passa alla parete del pozzetto e poi aggiungere lentamente ~ 1 ml contro il(Per evitare disturbi degli aggregati nei micropiumini piramidali). Ripetere questo mezzo cambia una seconda volta.
    1. A seguito del periodo di incubazione nel punto 3.1.5, trasferire circa 10-20 μL di terreno di coltura in due aree libere nei piatti Petri in possesso delle micro-colonne. Utilizzare una micropipetta per trasferire singolarmente gli aggregati sul piatto di Petri contenente i costrutti e spostarli con pinze a una delle piccole piscine di terreno di coltura per preservare la salute delle cellule.
    2. Mentre osserva sotto un stereoscopio, inserire un aggregato ad ogni estremità delle micro-colonne per micro-TENN bidirezionali o, ad una estremità, per un'architettura unidirezionale (a piacimento) usando le pinze. Confermare il posizionamento degli aggregati all'interno delle micro-colonne utilizzando lo stereoscopio. Utilizzare pinze per spostare le micro-colonne seminate nell'altra piccola piscina di terreno di coltura per evitare la disidratazione e per preservare la salute aggregata.
    3. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 45 minuti aConsentire agli aggregati di aderire all'ECM. Verificare che gli aggregati rimangano alle estremità delle micro-colonne utilizzando lo stereoscopio; Reintrodurre gli aggregati delle cellule e ripetere la fase di incubazione come necessario.
    4. Inumidire con cura i piatti Petri contenenti le micro-TENN con mezzo di coltura (3 o 6 ml per un piatto di Petri da 35 o 60 mm), utilizzando una pipetta sierologica. Posizionare i piatti in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 per la coltura a lungo termine.
    5. Eseguire le modifiche half-media ogni 2 giorni con il mezzo di coltura. Rimuovere con cautela la metà del vecchio mezzo con una pipetta e utilizzare lo stereoscopio per una guida visiva per evitare di aspirare le micro-TENN. Sostituire aggiungendo lentamente il mezzo fresco e pre-riscaldato con una pipetta.
    6. Per riutilizzare le matrici di micro-pozzetto PDMS, rimuovere il mezzo di coltura, bollire gli array in acqua deionizzata per 30 minuti e sterilizzare in autoclave per un altro ciclo di formazione e coltura dell'aggregato.
      NOTA: nei timepoints desiderati, ilLa citoarchitettura delle micro-TENN può essere verificata utilizzando microscopia a fase di contrasto. Qui sono stati utilizzati dei tempi di esposizione di 5-8 ms e 10X (0,64 μm / pixel) e 20X (0,32 μm / pixel) per catturare le immagini a contrasto di fase. La fluorescenza associata a cambi di concentrazione di calcio nelle micro-TENN viralmente trasdurate è stata catturata utilizzando un microscopio a fluorescenza ad alta velocità con un tempo di esposizione di 50 ms, un obiettivo 10x (0,64 μm / pixel) e una luce a stato solido con filtri a passa- Nm e ~ 510 nm per rispettivamente l'eccitazione ed emissione, per visualizzare il segnale di fluorescenza GCaMP6f.

4. Immunocitochimica per studi in vitro

Nota: Per le immagini qui mostrate, sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: tubulina anti-Tuj-1 / beta-III (1: 500) e anti-sinapsina-1 coniglio (1: 500) per l'etichettatura degli assoni e pre Rispettivamente. Gli anticorpi secondari erano anti dolore- mouse 568 (1: 500) e asino anti-coniglio 488 (1: 500). I volumi necessari delle soluzioni anticorpali primarie e secondarie preparate, così come i volumi della formaldeide, del siero di cavallo e delle soluzioni detergenti, dipendono dal volume richiesto per interamente coprire i costrutti. Questi volumi possono essere minimizzati utilizzando una penna barriera idrofobica per limitare l'area circostante ogni micro-colonna.

ATTENZIONE: Questa sezione utilizza formaldeide e Hoechst. La formaldeide è un composto tossico noto per essere cancerogeno e Hoechst è un mutageno noto. Pertanto, questi composti devono essere smaltiti in un apposito contenitore di rifiuti. Tratti sempre in un cappuccio chimico usando attrezzature adeguate per la protezione personale, come un cappotto da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti.

  1. Preparare una soluzione di formaldeide di volume / volume (v / v) del 4,0% in soluzione salina fosfato-tamponata (PBS) all'interno di una cappa chimica chimica.
  2. Rimuovere il mezzo di coltura dai contenitori PetriLe micro-TENN con una micropipetta. Aggiungere abbastanza volume della soluzione di formaldeide ai piatti per coprire completamente le micro-TENN. Immergere le micro-TENN nella soluzione di formaldeide per 35 minuti a 18-24 ° C per fissare le cellule all'interno delle micro-colonne.
  3. Rimuovere la soluzione di formaldeide al 4.0% dai piatti di Petri con una pipetta e scartare seguendo le appropriate linee guida per lo smaltimento dei materiali pericolosi.
  4. Eseguire due risciacqui rapidi aggiungendo abbastanza PBS per interamente coprire le micro-TENN fisse e quindi rimuovere il PBS con una pipetta. Effettuare un terzo lungo risciacquo ammollando i costrutti nel PBS per 10 min.
    ATTENZIONE: scartare il PBS utilizzato per il risciacquo come eventualmente contenente tracce di formaldeide.
  5. Preparare una soluzione di 0,3% v / v di detergente non ionico nel siero di cavallo del 4% v / v in PBS. Rimuovere il PBS dai piatti Petri contenenti le micro-TENN fisse e aggiungere un volume sufficiente della soluzione detergente del 0,3% per coprire i costrutti. Immergi per 60 minuti a 18-24 & #176; C permeabilizzare le cellule.
  6. Rimuovere la soluzione detergente con una pipetta. Eseguire due risciacqui rapidi aggiungendo e rimuovendo successivamente il PBS. Successivamente, eseguire tre risciacqui più lunghi imbevando i costrutti in PBS per 5 minuti durante ogni risciacquo.
  7. Diluire gli anticorpi primari nel 4% di siero di cavallo. Rimuovere il PBS dai piatti Petri contenenti le micro-TENN fisse e permeabilizzate. Aggiungere abbastanza soluzione anticorpale primaria alle micro-colonne per coprirle completamente. Sigillare i piatti Petri con il parafilm per evitare l'evaporazione e incubare durante la notte (12-16 h) a 4 ° C.
  8. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria dai piatti e risciacquare come descritto nel passaggio 4.6. Al buio, preparare la soluzione anticorpale secondaria in 4,0% cavallo di cavallo. Aggiungere abbastanza soluzione anticorpale secondaria per coprire completamente i costrutti, coprire i piatti con foglio di alluminio e incubare per 2 ore a 18-24 ° C.
  9. Preparare la soluzione Hoechst (1: 10.000) in PBS per macchiare i nuclei.
  10. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e incubare le micro-TENNS nella soluzione Hoechst per 10 minuti a 18-24 ° C. Eseguire cinque risciacqui con PBS, ciascuno per 5-10 min. Inondare il piatto di Petri con PBS per coprire le micro-TENN macchiate, avvolgere il piatto in fogli di alluminio e conservare a 4 ° C fino all'esecuzione dell'immagine.
    NOTA: Le immagini per le micro-TENN immunologiche sono state prese con un microscopio confocale laser con una risoluzione di 2.048 (~ 8 s / frame), un obiettivo di 10x (0.64 μm / pixel), eccitazione 487 nm e lunghezze d'onda di emissione di ~ 525 nm La fluorescenza verde, l'eccitazione di 561 nm e lunghezze d'onda di emissione ~ 595 nm per la fluorescenza rossa e ~ 3,22 μm / fetta con ~ 60 fette in media per le z-stack.

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Risultati

Le micro-TENN sono state monitorate usando la microscopia a fase-fase per valutare la loro citoarchitettura e la loro crescita assonale ( Figura 4 ). All'interno di micro-TENN unidirezionali di lunghezza di 2 mm, gli aggregati neuronali sono stati limitati ad una estremità della micro-colonna e hanno proiettato un fascio di assoni attraverso il nucleo interno. Axons ha percorso l'intera lunghezza della colonna di 5 giorni in vitro (DIV) ( Figura ...

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Discussione

La lesione e la malattia del CNS causano in genere la perdita o la disfunzione dei percorsi assonali a lunga distanza che comprendono il connettore del cervello, con o senza la degenerazione neuronale concomitante. Questo è aggravato dalla limitata capacità del CNS per promuovere la neurogenesi e la rigenerazione. Nonostante il perseguimento di strategie di riparazione come fattori di crescita, cellule e consegna biomateriali come approcci individuali o combinatoriali, queste tecniche non riescono contemporaneamente a r...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Il sostegno finanziario è stato fornito dall'Istituto Nazionale di Sanità U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) e F31-NS090746 (Katiyar), la Fondazione Michael J. Fox (Programma Therapeutic Pipeline # 9998 (Cullen) Il Premio pilota del centro di neuropsicologia Penn Medicine (Cullen), la National Science Foundation (DGE-1321851 (Struzyna e Adewole)), il Dipartimento per gli Affari dei Veterani (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), Dei Chirurghi Neurologici e del Congresso dei Chirurghi Neurologici (2015-2016 Codman Fellowship in Neurotrauma e Critical Care (Petrov)) e l'US Army Medical Research and Materiel Command (# W81XWH-13-207004 (Cullen) e W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Laser cutterUniversal Laser SystemsPLS4.75Utilizzato per fabbricare lo stampo a microcanali tagliato al laser.
Dispositivo di fabbricazione di microcolonne tagliate al laserSu misura--------------Contatta il nostro gruppo di ricerca se interessato. Dimensioni e progetti forniti nel manoscritto.
Viti----------------------------#4-40 con un diametro della filettatura di 3,05 mm
Dadi----------------------------#4-40 con un diametro della filettatura di 3,05 mm
Ago per agopuntura (180 µ Ildiametro può essere variato in base alla dimensione desiderata per il lume della microcolonna.
Piastra di PetriFisher08772B
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)Invitrogen14200075
Pipetta sierologica monouso in polistireneFisher13-678-11D
AgarosioSigmaA9539-50G
Tubo capillare (398 µ m diametro)Fisher21170DIl diametro può essere variato in base alla dimensione desiderata per il guscio della microcolonna.
Piastra riscaldanteFisherSP88857200
Barra magneticaFisher1451352
MicropipettaSigmaZ683884-1EA
Ago calibro 25 mmFisher14-826-49
MicrobisturiRoboz SurgicalRS-6270
ForbiciFine Science Tools14081-09
PinzeWorld Precision Instruments501985
Sterilizzatore a perline caldeSigmaZ378550-1EA
StereoscopioNikonSMZ800NUtilizzato per tutte le fasi di dissezione e per la fabbricazione di micro-TENN.
Coda di ratto tipo I collageneCorning354236Mantenere a 4 º C e rimuovere solo quando necessario. Usa il ghiaccio per preservarne la temperatura quando è in uso.
Provetta per microcentrifugaFisher02-681-256
Lamina di topoCorning354232Mantenere a 4 º C e rimuovere solo quando necessario. Usa il ghiaccio per preservarne la temperatura quando è in uso.
Terreno neurobasaleInvitrogen21103049Terreno basale per la coltura di cellule neuronali prenatali ed embrionali. Negozio a 4º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
Idrossido di sodio (NaOH)FisherSS2661
Acido cloridrico (HCl)FisherSA48-1
Cartina di tornasoleFisher09-876-18
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)Invitrogen14170112Conservare a 4 ºC.
0,25% Tripsina-EDTAInvitrogen 25200056Negozio a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
Desossiribonucleasi pancreatica bovina (DNase) ISigma10104159001Store a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
B-27 SupplementInvitrogen12587010Integratore aggiunto al terreno neurobasale per la coltura di neuroni ippocampali e corticali. Negozio a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
L-glutammina Negozio Invitrogen35050061a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
Sprague Dawley embrionale giorno 18 rattiCharles RiverCeppo 001
Pipetta PasteurFisher22-042816
Provetta da centrifuga da 15 mlEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
CentrifugaFisher05-413-115
EmocitometroFisher02-671-6
Stampante 3D Objet30Stratasys --------------Utilizzato per fabbricare gli stampi piramidali per micropozzetti.
Stampo piramidale per pozzi stampato in 3DSu misura--------------Contatta il nostro gruppo di ricerca se interessato. Dimensioni e progetti forniti nel manoscritto.
Polidimetilsilossano (PDMS) e agente indurenteFisherNC9285739Viene fornito in kit con elastomero e agente indurente. Utilizzare all'interno di una cappa chimica.
ImbutoFisher10-348C
Pipetta da 1 ml BulboSigmaZ509035
Micro-spatolaFisherS50821
Piastra di coltura a 12 pozzettiEMESCO1194-353043
FornoFisher11-475-154
IncubatriceFisher13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40UPenn Vector Core36373Conservare a -80ºC. Virus adeno-associato (AAV) disponibile in commercio con l'indicatore di calcio GCaMP6f.
Formaldeide 40%FisherF77P-4La formaldeide è un composto tossico noto per essere cancerogeno e deve essere smaltito in un contenitore separato.
Triton X-100SigmaT8787Tensioattivo non ionico utilizzato per permeabilizzare le membrane cellulari.
Siero di cavalloGibco16050-122
Anticorpo primario di tubulina anti-Tuj-1/beta-III di topoSigmaT8578-200ULConservare a -20ºC.
Anticorpo primario anti-sinapsina 1 di coniglioSynaptic Systems106-001Conservare a -20ºC.
Asino anti-topo 568 anticorpo secondarioInvitrogenA10037Negozio a 4ºC.
Asino anti-coniglio 488 anticorpo secondarioInvitrogenA21206Store a 4ºC.
Hoechst 33342, TricloridratoInvitrogenH3570Negozio a 4ºC.  Hoechst è un noto mutageno che dovrebbe essere trattato come cancerogeno. Pertanto, deve essere smaltito in un contenitore separato.
Microscopio confocale a scansione laser A1RSI Nikon--------------Utilizzato per eseguire le ricostruzioni confocali di costrutti immunomarcati.
Microscopio Eclipse Ti-S Nikon--------------Utilizzato per scattare le immagini a contrasto di fase. Con acquisizione di immagini digitali tramite fotocamera QiClick interfacciata con il software Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
Microscopio a fluorescenza ad alta velocitàMicroscopio Nikon--------------Nikon Eclipse Ti abbinato a una fotocamera ANDOR Neo/Zyla per l'imaging del calcio.
NIS Elements AR 4.50.00 SoftwareNikon Instruments--------------Utilizzato per identificare i transienti di calcio dalle registrazioni effettuate con il microscopio a fluorescenza ad alta velocità.

Riferimenti

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16 (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67 (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27 (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. , at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31 (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48 (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27 (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26 (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11 (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6 (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106 (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6 (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11 (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3 (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20 (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. , Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14 (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23 (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. , (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116 (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24 (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25 (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44 (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5 (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).

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