Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Summary

Questo manoscritto specifica la realizzazione di reti neurali rivelate micro-tessuto: costruzioni tridimensionali di dimensioni microniche costituite da tratti longitudinali allineati allineati che comprendono la popolazione neuronale aggregata racchiuse in un idrogel tubolare. Questi impalcature viventi possono servire come relè funzionali per ricostruire o modulare la circuiteria neurale o come test-letti biofidelici che imitano la neuroanatomia della materia grigio-bianca.

Abstract

Il recupero funzionale si verifica raramente dopo lesioni o degenerazioni causate da malattie all'interno del sistema nervoso centrale (CNS) a causa dell'ambiente inibitorio e della limitata capacità di neurogenesi. Stiamo sviluppando una strategia per affrontare simultaneamente la perdita di percorso neuronale e axon all'interno del CNS danneggiato. Questo manuale presenta il protocollo di fabbricazione per reti neurali (micro-TENN) progettate da micro-tessuti, costruzioni impiantabili costituiti da neuroni e tratti assonali allineati che attraversano il lumen di matrice extracellulare (ECM) di un cilindro idrogelizzato preformato centinaia di micron di diametro che può estendere centimetri in lunghezza. Gli aggregati neuronali sono delimitati agli estremi dell'incasso tridimensionale e sono allineati da proiezioni assonali. Le micro-TENN sono in una posizione unica come strategia per la ricostruzione del CNS, che emulano aspetti della cytoarchitettura del connettore del cervello e potenzialmente forniscono mezzi per la sostituzione della rete. Il neuGli aggregati ronalmente possono sinaptare con il tessuto ospite per formare nuovi relè funzionali per ripristinare e / o modulare i circuiti mancanti o danneggiati. Questi costrutti possono anche agire come "scaffolds viventi" pro-rigenerativi capaci di sfruttare meccanismi di sviluppo per la migrazione cellulare e la percorrenza axonale, fornendo segnali strutturali e solubili sinergici basati sullo stato di rigenerazione. Le micro-TENN sono fabbricate versando idrogel liquido in uno stampo cilindrico contenente un ago centrato longitudinalmente. Una volta che l'idrogelo ha gellato, l'ago viene rimosso, lasciando una micro-colonna vuota. Una soluzione ECM viene aggiunta al lumen per fornire un ambiente adatto per l'adesione neuronale e l'espansione assonica. I neuroni dissociati vengono aggregati meccanicamente per una precisa semina all'interno di una o entrambe le estremità della micro-colonna. Questa metodologia crea in modo affidabile i costrutti miniaturizzati indipendenti con tratti assonali prolungati che possono ricapitolare le caratteristiche della neuroanatomia cerebrale. Synaptic immGli indicatori di calcio non codificati e codificati geneticamente suggeriscono che le micro-TENN posseggano un'ampia distribuzione sinaptica e un'attività elettrica intrinseca. Di conseguenza, le micro-TENN rappresentano una strategia promettente per la ricostruzione neurochirurgica mirata dei percorsi cerebrali e possono anche essere applicati come modelli biofidelici per studiare i fenomeni neurobiologici in vitro .

Introduction

Una caratteristica comune dei disturbi e delle malattie del sistema nervoso centrale (CNS) come la lesione traumatica del cervello (TBI), lesioni del midollo spinale (SCI), ictus, malattia di Alzheimer e la malattia di Parkinson è la disconnessione dei percorsi assonali e delle cellule neuronali Perdita ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Ad esempio, quando un colpo ischemico non viene trattato, si stima che gli assoni siano persi a una velocità di 7 miglia di assoni al minuto

Protocol

Tutte le procedure relative agli animali sono state approvate dai comitati istituzionali di cura degli animali presso l'Università di Pennsylvania e dal Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center e rispettano le linee guida stabilite dalla NIH Politica del Servizio Sanitario Pubblico sulla Humane Care and Use of Laboratory Animali (2015).

1. Sviluppo dell'idrogelo di agarosio (componente acellulare di micro-TENN)

1. Preparazione della soluzione di agarosio
   1. All'interno di un cabinet per la biosicurezza, preparare i serbatoi per le micro-colonne trasferendo 20 ml di Dulbecco's fosfa....

Results

Le micro-TENN sono state monitorate usando la microscopia a fase-fase per valutare la loro citoarchitettura e la loro crescita assonale ( Figura 4 ). All'interno di micro-TENN unidirezionali di lunghezza di 2 mm, gli aggregati neuronali sono stati limitati ad una estremità della micro-colonna e hanno proiettato un fascio di assoni attraverso il nucleo interno. Axons ha percorso l'intera lunghezza della colonna di 5 giorni in vitro (DIV) ( Figura 4A

Discussion

La lesione e la malattia del CNS causano in genere la perdita o la disfunzione dei percorsi assonali a lunga distanza che comprendono il connettore del cervello, con o senza la degenerazione neuronale concomitante. Questo è aggravato dalla limitata capacità del CNS per promuovere la neurogenesi e la rigenerazione. Nonostante il perseguimento di strategie di riparazione come fattori di crescita, cellule e consegna biomateriali come approcci individuali o combinatoriali, queste tecniche non riescono contemporaneamente a r.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser cutter	Universal Laser Systems	PLS4.75	Utilizzato per fabbricare lo stampo a microcanali tagliato al laser.
Dispositivo di fabbricazione di microcolonne tagliate al laser	Su misura	--------------	Contatta il nostro gruppo di ricerca se interessato. Dimensioni e progetti forniti nel manoscritto.
Viti	--------------	--------------	#4-40 con un diametro della filettatura di 3,05 mm
Dadi	--------------	--------------	#4-40 con un diametro della filettatura di 3,05 mm
Ago per agopuntura (180 µ Il			diametro può essere variato in base alla dimensione desiderata per il lume della microcolonna.
Piastra di Petri	Fisher	08772B
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Invitrogen	14200075
Pipetta sierologica monouso in polistirene	Fisher	13-678-11D
Agarosio	Sigma	A9539-50G
Tubo capillare (398 µ m diametro)	Fisher	21170D	Il diametro può essere variato in base alla dimensione desiderata per il guscio della microcolonna.
Piastra riscaldante	Fisher	SP88857200
Barra magnetica	Fisher	1451352
Micropipetta	Sigma	Z683884-1EA
Ago calibro 25 mm	Fisher	14-826-49
Microbisturi	Roboz Surgical	RS-6270
Forbici	Fine Science Tools	14081-09
Pinze	World Precision Instruments	501985
Sterilizzatore a perline calde	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscopio	Nikon	SMZ800N	Utilizzato per tutte le fasi di dissezione e per la fabbricazione di micro-TENN.
Coda di ratto tipo I collagene	Corning	354236	Mantenere a 4 º C e rimuovere solo quando necessario. Usa il ghiaccio per preservarne la temperatura quando è in uso.
Provetta per microcentrifuga	Fisher	02-681-256
Lamina di topo	Corning	354232	Mantenere a 4 º C e rimuovere solo quando necessario. Usa il ghiaccio per preservarne la temperatura quando è in uso.
Terreno neurobasale	Invitrogen	21103049	Terreno basale per la coltura di cellule neuronali prenatali ed embrionali. Negozio a 4º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
Idrossido di sodio (NaOH)	Fisher	SS2661
Acido cloridrico (HCl)	Fisher	SA48-1
Cartina di tornasole	Fisher	09-876-18
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)	Invitrogen	14170112	Conservare a 4 ºC.
0,25% Tripsina-EDTA	Invitrogen 25200056		Negozio a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
Desossiribonucleasi pancreatica bovina (DNase) I	Sigma	10104159001	Store a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
B-27 Supplement	Invitrogen	12587010	Integratore aggiunto al terreno neurobasale per la coltura di neuroni ippocampali e corticali. Negozio a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
L-glutammina	Negozio Invitrogen	35050061	a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
Sprague Dawley embrionale giorno 18 ratti	Charles River	Ceppo 001
Pipetta Pasteur	Fisher	22-042816
Provetta da centrifuga da 15 ml	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuga	Fisher	05-413-115
Emocitometro	Fisher	02-671-6
Stampante 3D Objet30	Stratasys	--------------	Utilizzato per fabbricare gli stampi piramidali per micropozzetti.
Stampo piramidale per pozzi stampato in 3D	Su misura	--------------	Contatta il nostro gruppo di ricerca se interessato. Dimensioni e progetti forniti nel manoscritto.
Polidimetilsilossano (PDMS) e agente indurente	Fisher	NC9285739	Viene fornito in kit con elastomero e agente indurente. Utilizzare all'interno di una cappa chimica.
Imbuto	Fisher	10-348C
Pipetta da 1 ml Bulbo	Sigma	Z509035
Micro-spatola	Fisher	S50821
Piastra di coltura a 12 pozzetti	EMESCO	1194-353043
Forno	Fisher	11-475-154
Incubatrice	Fisher	13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Conservare a -80ºC. Virus adeno-associato (AAV) disponibile in commercio con l'indicatore di calcio GCaMP6f.
Formaldeide 40%	Fisher	F77P-4	La formaldeide è un composto tossico noto per essere cancerogeno e deve essere smaltito in un contenitore separato.
Triton X-100	Sigma	T8787	Tensioattivo non ionico utilizzato per permeabilizzare le membrane cellulari.
Siero di cavallo	Gibco	16050-122
Anticorpo primario di tubulina anti-Tuj-1/beta-III di topo	Sigma	T8578-200UL	Conservare a -20ºC.
Anticorpo primario anti-sinapsina 1 di coniglio	Synaptic Systems	106-001	Conservare a -20ºC.
Asino anti-topo 568 anticorpo secondario	Invitrogen	A10037	Negozio a 4ºC.
Asino anti-coniglio 488 anticorpo secondario	Invitrogen	A21206	Store a 4ºC.
Hoechst 33342, Tricloridrato	Invitrogen	H3570	Negozio a 4ºC.  Hoechst è un noto mutageno che dovrebbe essere trattato come cancerogeno. Pertanto, deve essere smaltito in un contenitore separato.
Microscopio confocale a scansione laser A1RSI	Nikon	--------------	Utilizzato per eseguire le ricostruzioni confocali di costrutti immunomarcati.
Microscopio Eclipse Ti-S	Nikon	--------------	Utilizzato per scattare le immagini a contrasto di fase. Con acquisizione di immagini digitali tramite fotocamera QiClick interfacciata con il software Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
Microscopio a fluorescenza ad alta velocità	Microscopio Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti abbinato a una fotocamera ANDOR Neo/Zyla per l'imaging del calcio.
NIS Elements AR 4.50.00 Software	Nikon Instruments	--------------	Utilizzato per identificare i transienti di calcio dalle registrazioni effettuate con il microscopio a fluorescenza ad alta velocità.