Tecnica laparoscopica per la raccolta di serie del fegato e linfonodi mesenterica in macachi

Sommario

Qui, si descrive una tecnica laparoscopica minimamente invasivo per il campionamento di serie del fegato e linfonodi mesenterici (MLN) in macachi che permette di aumentare la frequenza di campionamento, e riduce il rischio di complicanze chirurgiche rispetto ad eseguire una laparotomia.

Abstract

I linfonodi mesenterici (MLN) e il fegato sono esposti a microbi e prodotti microbici dal tratto gastrointestinale (GI), che li rende unici immunologicamente. Il tratto GI e MLN associati sono siti di replicazione virale nelle prime fasi dell'infezione umana da virus dell'immunodeficienza (HIV) e la MLN sono probabili importanti siti serbatoio che ospitano cellule latentemente infette anche dopo prolungata terapia antiretrovirale (ART). Il fegato ha dimostrato di svolgere un ruolo significativo nella risposta immunitaria a lentivirus e sembra svolgere un ruolo significativo della clearance del virus dalla circolazione. primate non umano modelli (NHP) per l'HIV e la sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) imitano da vicino questi aspetti di infezione da HIV e di serie campionamento longitudinale siti primari di replicazione virale e le risposte immunitarie associate a questo modello contribuirà a chiarire gli eventi critici in infezione, patogenesi e l'impatto delle varie strategie di intervento su questi eventi. currtecniche ent pubblicato a campione fegato e MLN insieme coinvolgono chirurgia e / o necroscopia principale, che limita la capacità di indagare questi siti importanti in modo seriale nello stesso animale. Abbiamo precedentemente descritto una tecnica laparoscopica per la raccolta dei MLN. Qui, si descrive una tecnica laparoscopica minimamente invasiva per il campionamento longitudinale serie del fegato e MLN attraverso gli stessi due posizioni delle porte necessarie per la raccolta di MLN. L'uso degli stessi due porte minimizza l'impatto agli animali come sono necessarie incisioni aggiuntivi. Questa tecnica può essere utilizzata con aumentata frequenza di campionamento rispetto alla chirurgia addominale e riduce il rischio di complicazioni chirurgiche ed associato risposte infiammatorie locali e sistemici che potrebbero complicare l'interpretazione dei risultati. Questa procedura ha il potenziale per facilitare gli studi che coinvolgono modelli NHP migliorando nel contempo il benessere degli animali.

Introduzione

Il tratto gastrointestinale (GI) è più grande superficie mucosa del corpo ed è esposto ad una miriade di antigeni derivati da alimenti, agenti patogeni, e comunità batteriche endosimbiontica comunemente denominato microbiome ^{1, 2.} linfonodi mesenterici (MLN) fiancheggiano il tratto gastrointestinale e sono un luogo principale della funzione immunitaria per promuovere le risposte infiammatorie o tolerogeniche verso questi diversi antigeni. L'organizzazione fisica del MLN crea un sistema di compartimenti in grado di rispondere ad antigeni localmente senza suscitare risposte sistemiche ^3. Analogamente, il sangue di fogna tratto gastrointestinale al fegato attraverso la vena porta prima di tornare in circolazione, ed è quindi esposto a microbi e prodotti microbici che sono traslocati dal tratto GI nella lamina propria e inseriti nel flusso sanguigno ^4. Il fegato funziona anche come secondaria linfoide organo unnd ha un gran numero di cellule immunitarie, compresi i macrofagi specializzati, per rimuovere i microbi traslocata ^{5, 6.} Così, il MLN ed il fegato sono gli organi immunitarie primarie esposte a commensali e batteri patogeni nel tratto GI, nonché l'ambiente di antigeni da altre fonti, rendendoli unici e importanti dal punto di vista immunologico.

Il MLN sono siti critici per la valutazione degli effetti virologici e immunologici del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) o infezione patogeno virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV), e sono probabilmente coinvolti nella diffusione precoce di SIV seguente sfida intrarettale. Galt è noto per essere un importante sito di persistente replicazione di HIV, nonostante il controllo effettivo della viremia da terapie antiretrovirali moderni (ART) ^7. In modelli di infezione da SIV, MLN hanno dimostrato di essere importanti serbatoi di latent virus e maggioil serbatoio primario ^{8, 9.} Il fegato è importante anche infezione lentivirale come dimostra l'accumulo di specifiche cellule T CD8 ⁺ SIV nei fegati di macachi durante l'infezione acuta SIV ^10. Inoltre, è il principale organo responsabile per la cancellazione del virus dalla circolazione ^11.

HIV e SIV infezione sono associati con alterata microbioti GI, interrotto integrità epiteliale GI, e una maggiore traslocazione di microbi e prodotti microbici dal colon nella periferia e circolazione ^{12, 13.} Questi processi sono associati con l'attivazione immunitaria locale e sistemica, e aumentata morbidità e mortalità in HIV individui infetti ^14. In infezione SIV, batteri traslocati sono stati osservati nel MLN ^15, considerando che l'accumulo di microfonoprodotti robial nel fegato ha dimostrato di causare infiammazione e danni all'organo ^16. Così, nel contesto di HIV e SIV infezioni, il MLN e fegato possono essere altamente informativo per la comprensione dei processi infiammatori guidati da batteri GI residente.

Qui, presentiamo una tecnica laparoscopica minimamente invasivo per il campionamento di serie del MLN e fegato nei primati non umani (NHP). Dimostriamo performance di successo di questa tecnica su due sani macachi rhesus femmina (RMS), il campionamento ogni animale due volte, con 160 giorni tra ogni intervento chirurgico. Andiamo a utilizzare questi esempi per valutare e confrontare chiave leucociti e linfociti popolazioni all'interno di ciascun organo citometria a flusso, e dimostrare dati altamente coerenti tra i due punti di tempo.

Protocollo

Gli animali sono stati alloggiati e curati in Associazione per la valutazione e l'accreditamento del Laboratorio di Animal Care International (AAALACi) strutture accreditate, e tutte le procedure di animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) della Università di Washington e nazionale Primate Research Center di Washington.

1. Preparazione chirurgico, anestesia, e Analgesia

1. Sedazione e induzione
   1. Sedare macaco con un'iniezione intramuscolare di 10 mg / kg di ketamina e 0,015 mg / kg dexmedetomidina (combinati in una siringa). Garantire l'assenza di riflessi recesso prima della rimozione dalla gabbia.
   2. Intubare l'animale, e mantenere l'animale in un piano di anestesia generale con isoflurano (1.0 - 2,5%) e% di ossigeno 100. Vedere riferimenti per ulteriori informazioni riguardanti l'intubazione e l'anestesia generale nei macachi ^17,ref "> ^{18, 19.}
2. Anestesia di sostegno e monitoraggio
   1. Inserire un catetere venoso periferico e fornire fluidi isotonici via endovenosa (come soluzione Ringer lattato) ad una velocità di 5 mL / kg / h per tutta anestesia e chirurgia. Applicare il lubrificante occhio sterile per prevenire la secchezza della cornea.
   2. Fornire analgesia, come una formulazione a rilascio prolungato di buprenorfina (0,2 mg / kg, per via sottocutanea).
      NOTA: un FANS (come meloxicam o ketoprofene) può anche essere fornita durante il recupero anestetico, a condizione che il protocollo sperimentale permette amministrazione FANS e che animale è normotesi e ben idratati durante l'anestesia.
   3. Monitorare profondità dell'anestesia (es tono mandibola), la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, elettrocardiogramma, pressione sanguigna, l'ossigenazione impulso, fine maree CO _2, e la temperatura corporea durante anestesia e chirurgia.
      NOTA: Quando l'addome viene insufflato, l'animale può ipoventilare.Fornire ventilazione meccanica se la frequenza respiratoria diminuisce, o le estremità di marea CO ₂ è superiore ai 45 mmHg.
   4. Dopo la chirurgia, amministrare atipamezolo (0,15 mg / kg, per via intramuscolare) per l'inversione dexmedetomidina.
3. Preparazione chirurgica
   1. Eseguire più clisteri di acqua calda per ridurre il volume di feci nel colon per facilitare la visualizzazione e la manipolazione intestinale durante la procedura ^20.
   2. Utilizzare Clippers con una lama numero 40 per eliminare i peli dal campo operatorio. Shave dalla cresta costale al pube e da sinistra a fianco destro.
   3. Asetticamente preparare il campo chirurgico utilizzando antisettici appropriate, ad esempio alternando clorexidina-alcool o iodio povidone-alcol scrub.
   4. Posizionare l'animale sul tavolo operatorio sul suo dorso, ad un angolo tra metà dorsale e decubito laterale destro. Legare le braccia e gambe con corda in una posizione estesa. Fornire un chlorhexi finalemangiare e alcool prep volta che l'animale si sposta in sala operatoria ed è posizionato per la chirurgia.

2. Chirurgia

Nota: Per ulteriori informazioni della laparoscopia nei piccoli animali, vedi riferimento ^21.

1. Laparoscopica Strumento Preparazione
   1. Telo l'animale con un telo fenestrato sterile.
   2. Con l'aiuto di un assistente non sterile, avvolgere la fotocamera digitale con il telo fotocamera sterile e collegare il cavo alla torre. Fissare la portata rigida alla testa della telecamera.
   3. Collegare il cavo luce sterile alla portata rigido e collegare il cavo alla fonte di luce. Bilanciamento del bianco della fotocamera in base alle istruzioni del produttore.
   4. Collegare il tubo insufflatore sterile per l'insufflatore.
2. laparoscopica Entry
   1. Usando un bisturi # 15, fare una ~ 5 millimetri pugnalata incisione attraverso la pelle per la profondità della muscolatura addominale, approximately 1 - 2 cm a sinistra dell'ombelico.
   2. Usando la mano non dominante, sollevare la parete addominale craniale al sito dell'incisione stab. Con la mano dominante, posizionare la punta dell'ago Veress attraverso l'incisione e l'angolazione dello cranialmente punta.
      NOTA: L'angolo di penetrazione dell'ago di Veress varierà in base alla condizione corporea dell'animale. Ad esempio, in un animale grasso, l'ago Veress dovrà essere inserito quasi perpendicolare alla parete addominale. In un animale sottile, l'ago Veress dovrebbe essere angolato cranialmente per ridurre il rischio di contatto visceri.
      1. Tiene l'albero (non il mozzo) dell'ago Veress, spingere saldamente l'ago per penetrare la parete addominale nella cavità addominale. Un distinto "click" e diminuzione della resistenza sarà percepita come la punta affilata penetra il peritoneo e la punta smussata delle molle a spillo Veress avanti nella cavità addominale.
         NOTA: Se l'ago passa in modo appropriato in the cavità addominale, ci sarà poca resistenza quando è avanzato e ritirato 1 - 2 cm.
   3. Collegare il tubo insufflatore di CO ₂ per l'ago e aprire il rubinetto. Pressurizzare l'addome a non più di 10-12 mmHg per creare un pneumoperitoneo.
      NOTA: L'addome ha raggiunto insufflazione ideale quando si è espansa simmetricamente e c'è una perdita della normale tagliente contorno dei margini costali. La pressione dovrebbe fornire spazio sufficiente per l'inserimento della cannula / trocar senza il rischio di contatto visceri.
3. cannula Placement
   1. Una volta che l'addome è completamente insufflato, fare un ~ 5 - mm incisione 7 con una lama di bisturi # 15 attraverso la pelle dell'addome craniale sinistra alla muscolatura addominale ~ 2-4 cm caudalmente all'ultima costola.
   2. Posizionare un complesso di trequarti-cannula 5 millimetri attraverso l'incisione cutanea e angolazione ~ 45 - 60 gradi caudomedially. Penetrare nella cavità addominale per una profondità di 1-2 cm. Screw la cannula filettata nell'addome ruotando la cannula (~ 0,5 - 1 cm Maggiori) ad una profondità di 1,5 - 3 cm, e rimuovere il trequarti.
   3. Rimuovere il tubo insufflatore dall'ago Veress, spegnere il rubinetto e rimuovere l'ago. Collegare il tubo insufflatore alla cannula e aprire il rubinetto per mantenere un pneumoperitoneo a non più di 10 - 12 mmHg.
   4. Inserire la portata attraverso la cannula rigida e nella cavità addominale.
   5. Sotto visualizzazione fotocamera, continuare a fare una piccola incisione con un # 15 bisturi attraverso la muscolatura addominale e del peritoneo al precedente incisione cutanea utilizzato per l'inserimento dell'ago di Veress. La telecamera è usato per visualizzare il lato addominale dell'incisione per evitare navi e minimizzare il sanguinamento.
      NOTA: Assicurarsi che l'incisione attraverso il muscolo e del peritoneo è abbastanza grande per facilitare l'ingresso della sonda e l'esteriorizzazione del mesentere (~ 0,5 cm). Un grande incisione può essere richiesto di esteriorizzare mesentery in animali con eccesso di grasso mesenterica.
   6. Posto l'animale in posizione Trendelenburg ²¹ con i piedi elevati a circa 15 - 30 gradi sopra la testa. Questo è opzionale, ma può consentire un più facile accesso ai linfonodi mesenterici del colon, come il piccolo tratto intestinale si muoverà in una posizione più cranica.
4. Mesenterica biopsia del linfonodo
   1. Sotto visualizzazione telecamera, inserire una sonda solida attraverso l'incisione addominale praticato al punto 2.3.5.
   2. Posizionare la sonda tra l'omento e intestino e utilizzare un movimento ampio per spazzare delicatamente l'omento fuori l'intestino per permettere la visualizzazione del mesentere sottostante. Continuando a utilizzare il movimento circolare dal caudale dell'addome craniale. L'omento può essere posizionato nell'addome craniale destra in modo che è fuori del campo operatorio.
   3. Utilizzare la sonda per spostare il colon discendente verso la parete addominale sinistra oa destra. Ciò consentirà una migliore visualizzazione di tegli Mesentere per aiutare nella ricerca di linfonodi mesenterici.
   4. Utilizzare la sonda per spazzare attraverso il mesentere per individuare i linfonodi mesenterici lungo i vasi del colon e mesenterici.
      NOTA: i nodi del colon corrono lungo il confine mesenterica del colon, di sinistra i nodi coliche si trova in prossimità dei punti di ramificazione dei vasi, ei nodi mesenterica inferiore si trovano lungo i vasi mesenterica inferiore. linfonodi mesenterici sono facilmente visibili negli animali magri. Quando sepolto nel grasso mesenterico che spesso prestano leggermente rialzata, scintillante apparenza al mesentere sovrastante e può essere più di un colore marrone più grigiastro allora circostante grasso mesenterico. Inoltre, linfonodi mesenterici tendono a giacere lungo linfatici e vascolarizzazione mesenterica.
   5. Una volta che un linfonodo viene identificato, rimuovere la sonda e inserire le pinze Maryland sfogo nella cavità addominale. Utilizzare la pinza per afferrare mesentere adiacente al nodo di destinazione. Tirare il mesentere verso l'incisione, e rimuovere la portata dalla cannula.
   6. Spegnere l'insufflatore e lasciare il rubinetto aperto cannula per depressurizzare l'addome per facilitare l'esteriorizzazione del mesentere. Tirare il mesentere all'esterno del corpo attraverso l'incisione. Una volta esteriorizzato, afferrare il mesentere con emostasi zanzara curvi o pinze pollice per garantire l'accesso attraverso l'incisione.
   7. Identificare il linfonodo (s) all'interno mesentere esteriorizzato palpando per il linfonodo più solida e / o visualizzazione diretta del colore più grigio o l'aspetto nodulare del linfonodo.
      1. Una volta identificato, fare una piccola apertura (~ 3 - 5 mm) nel mesentere vicino al nodo utilizzando emostatici curve. allegati gratuiti per il mesentere con dissezione smussa con i hemostats curvo. Legare la vascolarizzazione con 4-0 non assorbibile sutura monofilamento come necessario. Utilizzare dissezione tagliente con un bisturi per rimuovere il linfonodo. Posizionare i nodi in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sughiaccio.
   8. Esaminare il mesentere esteriorizzata di sanguinamento. Se si nota sanguinamento, fornire adeguata emostasi occludendo le navi con emostatici o legature (4-0 non assorbibile monofilamento sutura), o mediante l'uso di cauterizzazione. Rilasciare il mesentere e insufflare l'addome di nuovo a 10 - 12 mmHg per consentire il mesentere per tornare alla cavità addominale.
   9. Ripetere i passaggi 2.4.1 tramite 2.4.8 per ottenere ulteriori biopsie linfonodali.
5. biopsia epatica
   1. Restituire il tavolo in posizione orizzontale.
   2. Posizionare una cannula filettata nell'addome attraverso l'incisione precedentemente usato per la raccolta linfonodo biopsia (incisione fatta nel passaggio 2.3.5). Assicurarsi che l'incisione è abbastanza grande (~ 5 - 7 mm) per consentire il posizionamento della cannula, senza l'inserimento del trocar. Inserire la portata rigida attraverso questa cannula verso la cavità addominale cranica e visualizzare craniale e fegato.
   3. Sotto visualizzazione telecamera, inserire la biopsia forceps attraverso la cannula precedentemente vincolate nell'addome craniale sinistra (incisione fatta nel passaggio 2.3.1).
   4. Per ottenere biopsie epatiche, posizionare la pinza biopsia sotto il margine lobo epatico selezionato con la parte mobile della mascella fronte al fegato, aprire la pinza, e consentire il margine di cadere nelle ganasce aperte. Assicurarsi che nessun omento è tra il fegato e pinze biopsia. Regolare la posizione della pinza e chiudere lo strumento sopra la regione di campionamento desiderata.
      1. Mantenere la pressione per circa 20 - 30 s per garantire l'emostasi. Con la pinza chiusa, rimuovere l'esempio tirando delicatamente la pinza attraverso la cannula. Questo si strappa delicatamente la biopsia dal fegato. Mettere biopsie epatiche in RPMI 1640 sul ghiaccio.
         NOTA: La dimensione biopsia epatica è circa 5 mm x 2 mm x 2 mm usando 5 mm Pinza biopsia.
   5. Esaminare il sito della biopsia per emorragia utilizzando la visualizzazione della fotocamera. Se si osserva emorragia, posizionare un moistene salinad tampone di cotone sterile attraverso la cannula ed applicare pressione al sito bioptico. In alternativa, imballare i siti di biopsia con schiuma gel sterile per facilitare l'emostasi.
   6. Ripetere i passaggi attraverso 2.5.3 2.5.5 per ottenere biopsie epatiche aggiuntivi.
      NOTA: Qui, 3 biopsie per animale da procedura sono stati raccolti, che è sufficiente per tutte le analisi a valle.
6. chiusura chirurgica
   1. Esaminare la cavità addominale di sanguinamento.
      NOTA: Questo non è avvenuto fino ad oggi. Tuttavia, se si nota sanguinamento eccessivo, determinare il sito di emorragia e fornire adeguata emostasi mediante pressione con tamponi di cotone sterili o l'uso di schiuma gel.
   2. Spegnere l'insufflatore e aprire i rubinetti cannula. Applicare una leggera pressione manuale per l'addome per depressurizzare completamente la cavità peritoneale. Rimuovere le cannule.
   3. Chiudere ciascuna delle incisioni della parete addominale con 1 o 2 semplici punti staccati per sito. Si raccomanda sutura 4-0 assorbibile.
   4. Eseguire un blocco spruzzata posizionando 0,1-0,3 cc bupivacaina in ogni incisione per l'analgesia locale prima della chiusura della pelle.
   5. Chiudere la pelle con 1 - 2 suture interrotte sepolte (si raccomanda sutura 4-0 assorbibile) per sito. tessuto colla può essere applicata.

3. biopsia epatica trasformazione e analisi dei linfociti

1. Memorizzare diversi pezzi di tessuto epatico (circa 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm di dimensione) in tubi crioconservazione, in una soluzione di archiviazione RNA preferita, e il 10% di formalina per future molecolare ed istologica analisi.
   1. Collocare le biopsie epatiche rimanenti in 50 ml di terreno RPMI 1640 supplementato con 1x penicillina / streptomicina, 40 ug / mL di una soluzione di collagenasi commercialmente disponibile, e 4 ug / ml DNAsi in una sterile da 250 ml tazza di plastica con un coperchio. Agitare energicamente usando un'ancoretta magnetica e una piastra di agitazione per 1 ora a 37 ° C.
2. Distribuire uniformemente versando il tessuto digerito. Grind il tessuto digerito (dal punto 3.1.1) su due filtri 70 pm rientrano in due provette da 50 ml conica in una sospensione di cellule singole usando l'estremità di una sterile siringa da 5 ml. Portare il volume di entrambi i tubi a 50 ml in mezzo RPMI 1640 con siero fetale bovino 10% e 1x penicillina / streptomicina (R10).
3. Centrifugare le cellule a 840 xg per 6 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante. Concentrare le cellule in un unico tubo da 50 ml sospendendo le cellule da entrambi i tubi in 5 mL R10 e combinare in un unico tubo da 50 ml conica. Portare il volume a 50 mL con R10. Contare le cellule utilizzando un emocitometro per determinare la resa cellulare.
   1. Centrifugare le cellule a 840 xg per 6 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule in 1 ml R10, distribuire uniformemente in due provette di polistirene 5 ml a fondo rotondo e portare il volume di ciascun tubo di 4 ml con R10, il targeting per> 500.000 cellule in ciascun tubo.
4. Centrifugare le cellule a 840 xg per 6 minuti a 4 ° C. Decantare il supernatant e risospendere il pellet cellulare in 4 mL tampone fosfato salino (PBS). Centrifugare a 840 xg per 6 minuti a 4 ° C.
5. Decantare il surnatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS vortexando delicatamente. Aggiungere 1,5 microlitri di una macchia risolvibile cellula morta. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
6. Aggiungere i seguenti anticorpi di marcatura della superficie non diluito in titoli raccomandati dal costruttore: CD45-PerCP (clone D058-1283), CD3-PE-CF594 (clone SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (clone 2H7), CD4-BV605 ( clone OKT4), CD8-BV570 (clone RPA-T8) e CD14-BV785 (clone M5E2). Incubare a 4 ° C per 20 min.
7. Aggiungere 4 ml di PBS e centrifugare a 840 xg per 6 minuti a 4 ° C. Decantare il surnatante e risospendere le cellule in 250 microlitri di 1% paraformaldeide in PBS.
   Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Indossare dispositivi di protezione adeguati.
8. Analizzare le popolazioni di cellule utilizzando un citometro di flusso come descritto in riferimento ^22.

Risultati

Metodi dettagliati per l'elaborazione di laparoscopicamente raccolto MLN, nonché le rese cellulari e frequenze leucociti in questi organi sono stati precedentemente riportati ^13. La figura 1 mostra resa cellulare e vitalità dati confrontando il MLN e biopsie epatiche raccolti in due punti temporali 160 giorni tranne due RMs sane usando questa tecnica laparoscopica. Abbiamo scoperto che il rendimento cellulare dalla MLN era significativamente superiore dal fegato (p = 0,0021), con una media di 33,5 x 10 ⁶ e 6,74 x 10 ⁶ cellule ottenute, rispettivamente. colorazione delle cellule morte e l'analisi mediante citometria di flusso indicato che> 90% delle cellule isolate da entrambi gli organi erano vitali.

Citometria a flusso, abbiamo valutato e confrontato l'abbondanza di leucociti e linfociti nel MLN e il fegato. Uno schema rappresentativo di gating per il fegato è mostrato in + cellule, e infine le cellule CD3 ^+. Dalla popolazione CD3 ^+, abbiamo valutato abbondanze di cellule CD4 ⁺ e CD8 ^+, mentre abbiamo valutato abbondanze di CD14 ⁺ e cellule CD20 ⁺ dalle popolazioni CD3-. Flusso rappresentante citometria piazzole mostrano CD45 ⁺ e CD3 ⁺ popolazioni dal MLN e fegato di entrambi gli animali a giorno 0 e al giorno 160 sono mostrati in figura 3, mentre la Figura 4 mostra leucociti e linfociti abbondanza per i due campionamenti dei due animali. Il MLN mostrato significativamente più elevati abbondanza di cellule CD45 ⁺ che ha fatto fegato (media 76,9% e 7.66% di cellule vitali, rispettivamente, p = 0,0002). Non sorprendentemente, il MLN mostrava una più alta percentuale di cellule T CD3 ⁺ (P0; 0,0001) e le cellule T CD4 ⁺ (p = 0,0004). Viceversa, il fegato è stata significativamente arricchito per CD14 ⁺ leucociti rispetto al MLN (p = 0,0036). Il MLN ha mostrato una media più alta di cellule T CD8 ^+, ma questo non è stato significativo. Sorprendentemente, questi due animali entrambi gli organi dimostrato abbondanza simili di cellule CD20 ⁺ B. Le rese cellulari e abbondanza di diversi leucociti e linfociti sottoinsiemi dal MLN in questo studio ha confermato precedentemente segnalati valori ^23.

Figura 1. Totale Cellular Yield (in alto) e vitalità cellulare (in basso) da serialmente Raccolta MLN e biopsie epatiche. Il MLN ha mostrato significativamente più elevati rendimenti di cellule che ha fatto il fegato. Tuttavia, entrambi i tipi di campioni forniti ampie cellule per analisi a valle. vitalità cellulare, misurato dal flusso cytometrically utilizzando un fissabile morto macchia ammina cellule, hanno dimostrato che entrambi i tipi di campioni tipicamente diedero> vitalità cellulare 90% dopo dissociazione tissutale. barre di errore rappresentano la deviazione standard tra i campioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Rappresentante Citometria a flusso strategia di gating. In primo luogo, sono stati esclusi le cellule aggregate, seguita dalla selezione di cellule vitali solo dopo colorazione utilizzando un risolvibile morto macchia ammina cellulare. Successivamente, sono stati selezionati leucociti CD45 ^+, seguita da selezione di cellule T CD3 ^+. Dalla popolazione CD3 ^+, CD4 ⁺ e CD8 ⁺ sono stati analizzati. Dal CD3 ^- popolazione CD14 ⁺ e le cellule CD20 ⁺ sono state analizzate. Thi strategia di gating s è stato utilizzato anche per il MLN. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Piazzole citometria di flusso da MLN e Fegato di Due animali longitudinalmente. MLN e campioni di fegato sono stati raccolti 160 giorni l'una dall'altra sia per gli animali. (A). MLN CD45 ⁺ cellule (leucociti); (Cellule B) Fegato CD45 ⁺ (leucociti); ⁺ Cellule (cellule T) (C) MLN ⁺ CD3; Cellule (D) Fegato CD3 ⁺ (cellule T). Sia per gli animali, la MLN mostrato proporzioni maggiori di CD45 ⁺ e le cellule CD3 ⁺ rispetto al fegato. Attraverso il tempo, le frequenze di queste popolazioni erano simili per entrambi gli animali.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Frequenze di CD45 ⁺ cellule (a sinistra) e vari leucociti e linfociti sottopopolazioni (destra) in 23 Samplings individuali. Le mln visualizzati significativamente maggiori frequenze di CD45 ^+, CD3 ⁺ e CD4 ⁺ cellule, mentre il fegato mostrava significativamente maggiori frequenze di leucociti CD14 ^+, dimostrando le uniche funzioni di ogni organo. barre di errore rappresentano la deviazione standard tra i campioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, dimostriamo una tecnica minimamente invasiva per la raccolta di serie MLN e biopsie epatiche che ha avuto un tasso di successo del 100% in questi e altri animali non descritti in questo studio. Inoltre, l'uso di questa tecnica sugli stessi animali attraverso il tempo non è stato associato ad eventi avversi. In effetti, non ci sono state complicazioni derivanti dall'uso di questa tecnica in altre coorti di animali che sono stati infettati con SIV, Simian / virus dell'immunodeficienza umana (SHIV), o il virus Zika (dati non pubblicati). Allo stesso modo, questa chirurgia è dimostrata efficace anche negli animali che avevano precedentemente sottoposti a chirurgia addominale maggiore, e negli animali trombocitopenica (dati non pubblicati). Abbiamo dimostrato che questi campioni possono essere raccolti attraverso gli stessi due porte invertendo la posizione della telecamera quando si passa da MLN al fegato evitando la necessità di incisioni addizionali. Fattori che influenzano la raccolta di MLN sono stati precedentemente segnalati ^13.

Fino a quattro raccolte di 3 MLN e 3 biopsie epatiche ciascuno sono stati effettuati nel tempo sui singoli animali, senza complicazioni, variazioni dei tassi di successo, o modifiche ai dati raccolti. Inoltre, questa tecnica di raccolta / epatica laparoscopica MLN è stato unito con successo con altre procedure come la raccolta di linfonodi periferici, endoscopiche biopsie GI superiore e inferiore, aspirazione del midollo osseo, raccolta del fluido cerebrospinale, e venipuntura allo stesso evento anestetico permettendo di valutare ampiamente virologico e risposte immunologiche in modo seriale (dati non pubblicati).

L'intera procedura richiede in genere 30 - 45 minuti per completare e si realizza attraverso due ~ 0,5 cm incisioni. Negli animali obesi, può essere necessario fare una grande incisione (~ 1-1,5 cm) per recuperare MLN attraverso e può richiedere più tempo per completare. Gli animali con vasta grasso mesenterico richiedono spesso una significativa esperienza a differentiate MLN dal grasso circostante. MLN si trovano spesso lungo la vascolarizzazione mesenterica e sembrano essere più frequenti nei pressi di punti di ramificazione nei vasi. Un aspetto critico di questa tecnica è che richiede l'MLN selezionati per avere una sufficiente mobilità nel mesentere essere esteriorizzato attraverso l'incisione addominale. Di conseguenza, questa tecnica non può essere utilizzata per raccogliere MLN vicino alla radice del mesentere. A causa di ingrandimento, è a volte più facile identificare MLN con la telecamera, e cogliere in prossimità della MLN può aiutare con localizzare e identificare il nodo una volta che è esteriorizzato.

L'uso della posizione di Trendelenburg non può sempre essere necessaria per la raccolta MLN, e se MLN possono essere facilmente recuperate senza l'uso di Trendelenburg può rendere biopsie epatiche facile poiché impedisce gli organi da spostare cranialmente. A volte, dopo il posizionamento nella posizione di Trendelenburg, il fegato è spostata verso l'alto contro il diaframma e mosto essere delicatamente manipolato in posizione prima della raccolta biopsia. Come il posizionamento porta per la raccolta MLN è a sinistra, biopsie epatiche sono tipicamente prelevati dai lobi epatici mediale laterale sinistra e sinistra quanto sono più vicini alla cannula.

Raccolta MLN e biopsie epatiche forniti ampi rendimenti cellulari per una varietà di analisi a valle e mostravano elevata vitalità delle cellule raccolte. Qui, le cellule sono state colorate per l'analisi di citometria di flusso di leucociti e linfociti popolazioni, e le differenze principali tra questi due importanti organi del sistema immunitario sono stati chiariti. Ad esempio, il MLN erano altamente arricchito per le cellule T CD4 ⁺ rispetto al fegato, data l'importanza della MLN come punti centrali di raccolta e di diffusione di risposte immunitarie adattative, nonché l'importanza di CD4 ⁺ T per la gestione infiammatori e risposte tolerogeniche per l'ambiente antigeni derivati ​​dalla dieta e microrganismi GI residentes = "xref"> 24. Tuttavia, il fegato è stata significativamente arricchito per CD14 ⁺ leucociti rispetto al MLN. CD14 è espresso prevalentemente sui monociti e macrofagi ed è un componente chiave del complesso recettore per lipopolisaccaride batterico (LPS) ^25. Infatti, l'aumento delle concentrazioni plasmatiche di CD14 solubile sono associati con traslocazione microbica e attivazione immunitaria HIV e SIV infezioni patogene ^26. Così, frequenze più elevate di CD14 ⁺ leucociti nel fegato probabilmente il risultato di una maggiore carica batterica in questo organo rispetto al MLN.

Qui, dimostriamo una tecnica chirurgica mini-invasiva e rapida per la raccolta di serie del MLN e biopsie epatiche utilizzando solo due piccole incisioni per l'ingresso laparoscopica, che non ha portato ad alcun esito avverso. Questi campioni forniscono un percorso utile per valutare principali processi immunologici, virologici e microbiologici che prendono plaCe nel MLN e fegato, che sono separati e unico da immunità sistemica. Analogamente, biopsie epatiche sono critici per la valutazione a lungo termine degli effetti di HIV / SIV, terapie farmacologiche, e microbi traslocati, che spesso si combinano per indurre danno epatico significativo ^16. Inoltre, poiché la MLN e il fegato sono gli organi del sistema immunitario esposti a GI microbiota, la capacità di valutare l'immunità in questi organi attraverso il tempo fornisce una piattaforma eccellente per la comprensione del ruolo che il microbiome gioca nel mantenere l'omeostasi immunitaria ospite. Nel loro insieme, la valutazione del fegato e MLN è di grande importanza nel contesto del vaccino e efficacia terapeutica, SIV pallone reservoir virale, e l'immunità mucosale generale. La capacità di raccogliere questi campioni attraverso un approccio minimamente invasivo significa che c'è meno rischio di infiammazione correlati alla procedura di esiste con tecniche attualmente pubblicati e minore impatto sulla fisiologia degli animali. Nel Future, sarà valutata la possibilità di combinare la raccolta di MLN e fegato con la raccolta di milza attraverso le stesse due posizioni delle porte per consentire il campionamento di un altro elemento importante e distinta del sistema immunitario che ha dimostrato di giocare un ruolo significativo nel un certo numero di modelli di malattia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Unguento oftalmico lubrificante per lacrime	Patterson Veterinary	97-890-8152
Priority Care Clorexidina 2% Scrub	Patterson Veterinary	07-842-6153
Alcool Vedco, isopropilico 70%	Patterson Veterinary	07-869-6434
Scrub Vedco Vetadine	Patterson Veterinary	07-869-6772
Hospira Lattated Ringer's 250 mL	Patterson Veterinary	07-800-9325
Laparotomia adolescenziale Telo chirurgico	Medline	DYNJP3004
Access 40 L Insufflator	Dyonics	7205832
300XL Xenon Light Source	Dyonics	7206084
460P 3 ... Telecamera digitale CCD con testa	Dyonics	72200086
Telo universale per fotocamera, 7" x 96"	Servizi di supporto per endoscopia	ESS-6920
servizi di supporto per endoscopia	da 7,5 piedi	negli Stati Uniti. Servizi
		TM-102
Cannocchiale rigido multiuso, 2,7 mm x 187,5 mm, 0 gradi	Servizi di supporto per endoscopia	B30-0007-00
Esame e guaina protettiva per cannocchiale da 2,7 mm x 187,5 mm con un rubinetto fisso	Servizi di supporto per endoscopia	B10-0025-00
		B30-0071-00
Ago Veress, 2 mm x 80 mm	Servizi di supporto per endoscopia	8302.08
Sonda solida con marcature, 5 mm x 320 mm	Servizi di supporto per endoscopia	8383.661
Pinza per presa e dissezione Maryland con impugnatura a cricchetto a doppia azione, 3,5 mm x 240 mm	Servizi di supporto per endoscopia	8390.2054
Pinze per biopsia, 3,5 mm x 310 mm	R. Wolf	8391.4063
Cannula filettata in plastica con porta insufflatatrice, 3,5 mm x 60 mm	Servizi di supporto per endoscopia	8903.072
Cannula filettata in plastica con porta insufflata, 5,5 mm x 60 mm	Servizi di supporto per endoscopia	8919.333
con trocar a punta smussata	Servizi di supporto	8903.101
Trocar a punta piramidale	Servizi di supporto per endoscopia	8903.121
CO2	Airgas	CD USPE
RPMI 1640	Fisher Scientific SH30027FS		L-glutammina
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7021
Penicillina-Streptomicina	Sigma Aldrich	P4333
Liberase TM Research Grade	Sigma Aldrich	5401119001	Soluzione di collegamento disponibile in commercio
Dnase I dal pancreas bovino	Sigma Aldrich	D5025
70 &; filtri per cellule	m Morganville Scientific	CSS0200
Siringa da 5 mL	BD	309646
Provette da centrifuga coniche da 50 mL	ThermoFisher Scientific	339652
Siero fetale bovino	Fisher Scientific	SH3007003
Provette in polistirene a fondo tondo da 5 mL	Fisher Scientific	14-959A
PBS	Fisher Scientific	SH3025601
Kit per colorante di cellule morte fissabile Aqua LIVE/DEAD	ThermoFisher Scientific	L34957	Colorante per cellule morte con ammina
CD45-PerCP (clone D058-1283)	BD Biosciences	558411
PE-CF594 Topo anti-Hu CD3 (clone SP34-2)	BD Biosciences	562406
BV605 Topo Anti-Hu CD4 (clone OKT4)	Biolegend	317438
APC-H7 Topo anti-Hu CD8 (clone SK1)	BD Biosciences	560179
PE-Cy5 Topo Anti-Hu CD20 (clone 2H7)	BD Biosciences	555624
BV786 Topo Anti-Hu CD14 (clone M5E2)	BD Biosciences	563698
16% PARAFORMALDEIDE AQ SOLUTN	Fisher Scientific	50-980-487
LSR II Citometro a flusso	BD	NA