Articolo metodologico

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

DOI:

10.3791/55621

⸱

22 aprile 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 2Department of Molecular Cardiology, Cleveland Clinic Foundation, 3Department of Cancer Biology, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo una tecnica per utilizzare le cellule staminali embrionali murine per generare due o tre corpi embrionali tridimensionali. Abbiamo poi spiegato come indurre la differenziazione neuronale delle cellule del corpo embrionali di acido retinoico, e come analizzare il loro stato di differenziazione dal marcatore di cellule progenitrici immunofluorescenza e immunoblotting.

Abstract

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Le cellule staminali embrionali di topo (CES) isolati dalla massa interna della blastocisti (tipicamente a giorno E3.5), può essere utilizzato come sistema modello in vitro per lo studio sviluppo embrionale precoce. In assenza di fattore inibitorio della leucemia (LIF), CES differenziano per default in cellule precursori neurali. Essi possono essere ammassati in una tridimensionale (3D) aggregato sferico definito corpo embrioide (EB) a causa della sua somiglianza con l'embrione in fase iniziale. EBs possono essere seminati su vetrini fibronectina rivestite, dove si espandono coltivando due estensioni (2D) dimensionali, o impiantati in matrici di collagene 3D dove continuano a crescere come sferoidi, e si differenziano in tre strati germinali: endodermica, mesoderma e ectodermica. La cultura collagene 3D simula l'ambiente in vivo più da vicino di EBS 2D. La cultura 2D EB facilita l'analisi per immunofluorescenza e immunoblotting per monitorare differenziazione. Abbiamo sviluppato una differenziazione neuronale in due fasiprotocollo zione. Nella prima fase, EBs sono generati dalla sospensione tecnica-drop, e, contemporaneamente, vengono indotte a differenziarsi da esposizione all'acido retinoico (RA). Nella seconda fase, neurali procede differenziazione in formato 2D o 3D in assenza di RA.

Introduzione

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CES provengono dalla massa cellulare interna della blastocisti. Queste cellule sono pluripotenti, cioè hanno la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula dell'organismo di origine. ESC differenziazione in vitro è di grande interesse, come un sistema sperimentale per studiare percorsi e meccanismi di sviluppo. Offre un potente e flessibile sistema modello per la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici per la correzione della disfunzione delle cellule e dei tessuti. EBs ricapitolano molti aspetti della differenziazione cellulare durante l'embriogenesi precoce. In particolare, EBs possono essere utilizzati quando letalità em....

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Protocollo

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1. Cultura di fibroblasti embrionali di topo (MEF)

  1. Preparare mezzo MEF, mezzo di Dulbecco modificato da Eagle (DMEM, high-glucosio), supplementato con siero fetale bovino 15% (FBS).
  2. Cappotto 100 mm piatti di coltura di cellule con soluzione di gelatina allo 0,5% per 30 min a temperatura ambiente (RT).
  3. Conte MEF usando un citometro. Rimuovere la soluzione di gelatina e versare immediatamente medio MEF pre-riscaldato a 37 ° C. Scongelare rapidamente fiale di mitomicina C MEF trattata in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2 minuti, quindi seminare 2,8 x 10 6 MEF per ogni 100 mm piatto di gelatina rivestita. Regolare il numero di ....

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Risultati

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Oct4, Nanog, e SOX2 sono i fattori di trascrizione fondamentali che conferiscono ESC auto-rinnovamento e pluripotenza. Abbiamo applicato il protocollo di cui sopra per confrontare la differenziazione neuronale dei CES da wild type e da un ceppo di topi geneticamente modificati in cui Syx, un gene che codifica per il fattore di scambio RhoA-specifica Syx, è interrotta. Avevamo implicati Syx nell'angiogenesi 18. Abbiamo notato differenze nei comportamenti d.......

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Discussione

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In questo protocollo vi presentiamo un metodo relativamente semplice e accessibile per studiare la differenziazione neuronale dei CES murini. In precedenti protocolli, RA è stato aggiunto al mezzo al giorno 2 o 4 giorni della EB hanging-goccia 8 o coltura in sospensione 7, rispettivamente, o immediatamente dopo l'EB appeso aggregazione goccia 21. Nel protocollo abbiamo ideato, RA è stato aggiunto in precedenza. Nonostante l'introduzione anti.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione o finanziari

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto da NIH concedere R01 HL119984 AH

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiali
MEFsEMD MilliporePMEF-CFStrato di alimentazione ESC
EMD MilliporeCMTI-2
Piatto per colture cellulari (60 mm)Eppendorf30701119Piastra per colture cellulari
(100 mm)Falcon353003per colture cellulari
(100 mm)Corning351029Gocce sospese
Piastra a 24 pozzettiGreiner Bio-One6621602D EBs
Piastra a 6 pozzettiEppendorf30720113Transfection
Dark 1,5 mL provetta per centrifugaCelltreat Scientific Products229437RA soluzione madre
Vetro di copertura per microscopioFisherbrand12-545-80Circolare, diametro 12 mm
Vetrini per microscopio Superfrost-plus Fisherbrand12-550-15
Kit per coltura di collagene 3DEMD MilliporeECM675Coltura 3D
Reagente per trasfezioneQiagen301427Trasfezione di cellule staminali
Microcon  Filtri centrifughi (10 kDa)EMD MilliporeMRCPRT010Concentrazione proteica
Nome  AziendaNumero di catalogoComments
Reagents
DMEMLonza12-709FMEFs coltura
IMDMGibco12440-046ESCs coltura
Fetale Siero bovino fetale (FBS)EMD MilliporeES-009-BGelatina di coltura ESC
Sigma-AldrichG2625Rivestimento per piatti
LIFR& D Systems8878-LF-025Per mantenere la pluripotenza delle ESC
MEM Soluzioni di aminoacidi non essenzialiGibco11140050Coltura cellulare
2-MercaptoetanoloGibco21985023Coltura cellulare
Penicillina-StreptomicinaGibco15140122Coltura cellulare
GentamicinaGibco15750060Coltura cellulare
MycoZap Plus-PRLonzaVZA-2022Coltura cellulare
0,25% Tripsina-EDTAGibco25200-072Coltura cellulare
DMSOSigma-AldrichD2650
Acido all-trans-retinoicoSigma-AldrichR2625-50MGInduzione della differenziazione neurale
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA7030-50GBlocco e diluizione degli anticorpi 
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-100MLPermeabilizzazione della membrana cellulare
Filtro cellulareCorning352360
Reagente anti-sbiadimento Prolong Gold con DAPILife Tech.P36931Reagente di montaggio
16% ParaformaldeideScienze della microscopia elettronica15710Fissazione cellulare
FibronectinaR & D Systems1030-FNRivestimento per piatti
PBSGibco10010049
Collagenasi tipo IWorthington Biochem. CorpLS004196EB dissociazione
Nome  AziendaNumero di catalogoComments
Anticorpi primari
Nestin (Rat-401)Santa Cruz Biotechsc-33677Rilevamento della differenziazione neurale
Oct4Santa Cruz Biotechsc-5279Rilevamento di differenziazione neurale
NanogBethyl LaboratoriesA300-398ARilevamento della differenziazione neurale
Sox2Cell Signaling3579Rilevamento della differenziazione neurale
Tubulina b3 (AA10)Santa Cruz Biotechsc-80016Rilevamento della differenziazione neurale
Nome  AziendaNumero di catalogoComments
Anticorpi secondari
Donkey anti-Mouse-Alexa555Life Tech.A31570Immunofluorescenza
Asino anti-topo-Alexa488 Tecnologia della vita.A21202Immunofluorescenza
Nome  AziendaNumero di catalogoComments
Instruments
Microscopio a campo largoNikonEclipse TS100Imaging per colture cellulari
Microscopio confocaleNikonC2Imaging in immunofluorescenza
Piastra Petri

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  2. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromis....

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Differenziamento con acido retinoicoformazione di corpi embrioiditecnica della goccia sospesacolture 2D e 3Dpolimerizzazione del gel di collageneanalisi di immunofluorescenzaanalisi della secrezione proteicaespressione della Nestina

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