Method Article

LERLIC-MS / MS per approfondita caratterizzazione e quantificazione di glutammina e asparagina deamidazione in Fucile Proteomics

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

 ,  , 
1Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui vi presentiamo un protocollo passo-passo del lungo lunghezza elettrostatico repulsione-idrofilo interazione cromatografia-spettrometria di massa tandem metodo (LERLIC-MS / MS). Questa è una nuova metodologia che consente per la prima volta quantificazione e caratterizzazione dei glutammina e asparagina isoforme deamidazione da proteomica fucile.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caratterizzazione di deamidation proteina è indispensabile per decifrare il ruolo (s) e le potenzialità di questa proteina post-traslazionale modifica (PTM) nella patologia umana e in altri contesti biochimici. Al fine di eseguire la caratterizzazione di deamidation proteine, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo lungo lunghezza elettrostatico interazione cromatografia-spettrometria di massa tandem repulsione-idrofilo (LERLIC-MS / MS) Metodo che può separare la glutammina (Gln) e asparagina isoforma (Asn) prodotti di deamidation da composti modello a campioni biologici molto complessi. LERLIC-MS / MS è, dunque, la prima strategia proteomica fucile per la separazione e la quantificazione di Gln isoforme deammidazione. Abbiamo anche dimostrato, come una novità, che il protocollo di trasformazione campione qui delineato stabilizza l'intermedio succinimmide permettendo la sua caratterizzazione LERLIC-MS / MS. L'applicazione di LERLIC-MS / MS come mostrato in questo articolo il video può aiutare a chiarire il momento sconosciutoarray n molecolari deamidation proteine. Inoltre, LERLIC-MS / MS fornisce ulteriore comprensione delle reazioni enzimatiche che comprendono deamidation in sfondi biologiche distinte.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deamidation è una modificazione post-traduzionale di proteine (PTM) che introduce una carica negativa al backbone proteina mediante una modifica di asparagina (Asn) e / o glutammina (Gln) residui 1. Questa modifica mentre colpisce residui Asn genera prodotti isomerici acido isoaspartic (isoAsp) e n acido -aspartic (Asp) ad un comune rapporto 3: 1 2. Nonostante, questo rapporto può essere alterato dall'intervento della riparazione enzima L-isoaspartyl metiltransferasi (PIMT) 3, 4. Analogamente, deamidation di residui Gln genera acido isomerica gamma-glutammico (γ-Glu) e isoforme di acido alfa-glutammico (α-Glu) ad un atteso rapporto 1: 3, 5 7, ma questo rapporto può essere spostata dall'azione di l'onnipresente enzima transglutaminasi 2 e altri transglutaminasi, compreso transglutaminasi 1, una enzyme recentemente identificato come associati con vescicole extracellulari nel cervello 6.

L'origine di deamidation può essere spontanea o enzimatica, il primo è particolarmente comune sui residui Gln in cui transglutaminasi e altri enzimi mediano reticolante / intra-molecolare tra via transamidazione (vedere 3 per ulteriori dettagli sulla Gln transammidazione e sue implicazioni in diversi cronica e malattie umane fatali). Pertanto, deamidation è un PTM che si ripercuote determinante sulla struttura e funzione delle molecole interessate 4, 7, 8 e richiede una caratterizzazione chimico approfondita 3 alla luce delle sue diverse conseguenze biochimiche compreso il servizio di clock molecolare dell'invecchiamento 9 .

Anche se deamidation dei residui Asn è stata relativamente ben caratterizzato dal basso verso l'alto fucile proteomica 1, 10, deammidazione di residui Gln ancora non ha un metodo di caratterizzazione adatto oltre l'analisi impegnativo composti modello da elettron-based frammentazione radicale 11. Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo unidimensionale proteomica fucile strategia (LERLIC-MS / MS) 3 che consente la separazione di Gln e Asn isoforme deamidazione da campioni biologici complessi e composti modello in una singola analisi. LERLIC-MS / MS è basato sulla separazione dei triptica digerito peptidi utilizzando una lunga lunghezza (50 cm) colonna di scambio ionico (LAX) operando in modalità elettrostatica repulsione-idrofila cromatografia a interazione (Erlic) ed accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC MS / MS). Questa nuova strategia analitico è stato usato per caratterizzare e quantificare relativamente l'estensione di ciascuna residuo deamidato nei tessuti cerebrali umanif "> 3. Tuttavia, il protocollo descritto qui fornirà immagini video di LERLIC-MS / MS mirava a studiare le peculiarità di deamidation proteine nel contesto biochimica di interesse.

ETICA DICHIARAZIONE

Tutte le procedure di questo protocollo sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale della Nanyang Technological University di Singapore e sono state eseguite in conformità alle linee guida istituzionali.

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Protocol

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1. Imballo Long-length di scambio anionico (LAX) colonna capillare

(Nota: Anche se la colonna LAX può essere in casa imballato come descriviamo in questo protocollo, colonne LAX sono anche disponibili in commercio, vedi Tabella dei Materiali e reagenti per ulteriori dettagli).

  1. Sospendere 50 mg di materiale da imballaggio scambio anionico debole in 3,5 mL di tampone imballaggio (Tabella 1) per preparare l'impasto liquido.
  2. Montare l'estremità della colonna capillare (50 cm Lunghezza - 200 micron di diametro interno (ID) Tubi) utilizzando una femmina-femmina raccordo, un ferule e un dado femmina. Posizionare uno schermo 1/16" OD di 1 micron dimensione dei pori all'interno del raccordo femmina-femmina (Nota:. Lo schermo utilizzato qui deve avere dimensione dei pori inferiore alla dimensione delle particelle del materiale di imballaggio per impedire fuoriuscita del materiale dalla colonna).
  3. Imballare il capillare con la poltiglia utilizzando una pompa a pressione azionata a 4.500 psi. (Nota: Imballare la column finché il materiale di imballaggio è visibile all'ingresso della colonna).
  4. Montare l'altra estremità della colonna capillare come descritto al punto 1.2.

Preparazione 2. Esempio

Questo protocollo descrive l'applicazione di LERLIC-MS / MS per analizzare i tessuti cerebrali umani come modello proteoma. (Nota: In caso utilizzare altri tessuti o campioni proteomica, devono essere adattati alle procedure di preparazione del campione.)

  1. Tissue omogeneizzazione:
    un. tessuti cerebrali di lavaggio (50 a 100 mg) con soluzione di tampone fosfato 1x per cinque minuti tre volte.
    b. Omogeneizzare il tessuto in corrispondenza 1: 1: 2,5 tessuto / perline metalliche / SDC tampone di omogeneizzazione (2 Tabella) Rapporto (w / w / v) per 5 minuti a 4 ° C in provette Safe-Lock alla massima intensità utilizzando un omogeneizzatore tessuto. (Nota: DSC tampone di omogeneizzazione può includere inibitori di proteasi come precedentemente indicato in 3)
    c. Centrifugare l'omogenato tissutale, ottenuto from il passaggio precedente, a 10.000 xg, a 4 ° C per 10 minuti e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml.
    d. Ripetere i passaggi bc per i restanti pellet e combinare i supernatanti il numero di volte necessario fino non si osserva pellet. (Nota: Se si deve ripetere la procedura bc più di due volte, spostare il campione e le perline per un nuovo tubo di sicurezza di blocco per prevenire la perdita di campione durante la fase di centrifugazione).
    e. Quantificare la concentrazione proteica degli omogenati ottenuti da acido bicinconinico dosaggio (BCA) 12.
  2. Sodio desossicolato (DSC)-assistita in-soluzione di digestione trittico 13 di omogenati di cervello.
    un. Aggiungere una concentrazione finale di 10 mM ditiotreitolo (DTT) (utilizzando la soluzione madre indicato in Solution 5 della tabella 3) alla omogenato ottenuto per avviare la riduzione dei legami disolfuro proteine.
    b. Incubare l'omogeneizzato in 30 minuti in un bagnopre-impostata a 60 ° C.
    c. Aggiungere alla omogenato una concentrazione finale di 20 mM iodoacetamide (IAA) usando la soluzione madre indicato in Solution 7 della tabella 4.
    d. Incubare l'omogeneizzato contenente IAA a temperatura ambiente al buio per 45 min.
    e. Diluire l'omogenato cerebrale due pieghe utilizzando tampone di diluizione (Soluzione 6 della tabella 3).
    f. Incubare il campione per un secondo stadio di riduzione durante 30 min a 37 ° C.
    g. Aggiungere tripsina sequenziamento-grado-modificato sciolto in Soluzione 2 della tabella 2 a proteine-to-enzima 1:50 (w / w).
    h. Digerire l'omogeneizzato con tripsina mediante incubazione per una notte a 30 ° C.
    io. Estinguere la digestione enzimatica il giorno successivo aggiungendo 0,5% concentrazione finale di acido formico (FA). (Nota: aggiunta di FA provoca la precipitazione dei sali DSC in condizioni acide.)
    j. Delicatamente vortice campioni contenenti DSC di precipitazionetati.
    K. Pellet le sali DSC centrifugando i campioni a 12.000 xg, a 4 ° C durante 10 min.
    l. Raccogliere il surnatante e trasferire il liquido in una nuova provetta pulita. (Nota: Fare attenzione durante la dispensazione di questo passo per non ri-sospendere e / o raccogliere i sali dal pellet DSC).
    m. Ri-sciogliere il precipitato DSC DSC ri-dissoluzione tampone (Tabella 5) sotto vigorosa vortex per 1 min.
    n. Ripetere i passaggi jl due volte per recuperare peptidi precipitati e si combinano il surnatante. (Nota:. Vedere Serra et al 2016 13 per ulteriori dettagli sulla DSC-assistita soluzione protocollo triptica digestione adattato qui.)
  3. Dissalazione di trittico digerito campioni.
    un. Eseguire dissalazione di campioni digeriti che utilizzano una cartuccia 1g C-18. (Nota: L'uso di una cartuccia di grande volume (5 mL) indipendentemente dalla quantità di proteina ottenuto garanzie corretta pulizia dei rimanenti sali DSC nei campioni primadell'iniezione LC-MS / MS).
    b. Effettuare condizionamento della cartuccia C-18 1g con 5 mL di acetonitrile (ACN).
    c. Passare 5 mL di pulizia tampone (Tabella 6) dalla cartuccia 1G C-18 condizionata per rimuovere qualsiasi solvente organico residuo.
    d. Caricare il campione alla cartuccia 1G C-18.
    e. Eseguire 3 - 5 gradini clean-up al campione nella colonna 1g C-18 usando 5 mL di tampone di pulizia ogni passo.
    f. Eluire i peptidi dissalate dal 1g cartuccia C-18 usando 5 mL di tampone di eluizione (Tabella 7).
    g. Essiccare i peptidi eluiti in un concentratore a vuoto.
    c. Ricostituire il campione essiccato in un volume finale di 200 microlitri di tampone di eluizione. (Nota:. Uso vigorosa e lunga (> 10 min) vortex seguita da successiva sonicazione in un bagno di sonicazione durante 30 minuti per risospendere completamente i peptidi secchi in tampone iniezione)
    d. Regolare il volume di iniezione del campione per LERLIC-MS / MS per anaLyze tra 1 a 3 pg di proteina.

3. Uno-dimensione LERLIC-MS / MS Separazione

  1. Condizioni cromatografia liquida:
    fasi mobili:
    A: 0,1% FA in acqua (Tabella 8).
    B: 0,1% FA in ACN (Tabella 9)
    Portata: 0,4 ml / min
    Colonna: colonna capillare LAX (lunghezza 50 centimetri - 200 micron ID)
    un. Utilizzare la seguente 1200 min-gradiente: 95% B per 40 min, 95 - 85% B per 434 min 85 - 70% B per 522 min 70 - 35% B per 124 min 35 - 3% B per 45 min , isocratica al 3% B per 5 minuti, 3 - 95% B oltre 7 min e mantenuto isocratica al 95% B per 23 min.
    b. Eseguire la separazione dei peptidi che utilizzano il capillare LAX come indicato nella Serra & Gallart-Palau et al. 3 utilizzando ultra-alta pressione cromatografia liquida.
  2. Configurazione spettrometro di massa:
    un. Configurare i dettagli dell'evento scansione effettuare acquisizione dati alternata between pieno trasformata di Fourier-spettrometria di massa (FT-MS) e spettrometria di massa Fourier Transform-tandem (FT-MS / MS) con i seguenti parametri:
    A.1. modalità di acquisizione dei dati: positivo
    a.2 parametri FT-MS:
    range di massa: 350 - 2.000 m / z
    Risoluzione: 60.000
    Microscans: 1 per lo spettro
    Controllo automatico del guadagno: 1 × 10 6
    a.3 parametri FT-MS / MS:
    Modalità Frammentazione: ad alta energia di dissociazione collisione (HCD)
    a.4 gamma di massa: 150 - 2.000 m / z
    Risoluzione A.5: 30.000
    A.6 Top N ioni: 10
    Microscans: 1 per lo spettro
    Gratis Stato:> 2+
    Larghezza di isolamento: 2 Da
    A.7 controllo di guadagno automatico: 1 × 10 6
    b. Eseguire il rilevamento spettrometria di massa dei peptidi come indicato in 3 usando uno spettrometro di massa Orbitrap equipaggiato con una sorgente di ioni nanoelectrospray lavorare a 1,5 kV.

Analisi 4. I dati

  1. eseguire protealla ricerca di database al LERLIC-MS / MS ottenuto dati utilizzando i seguenti parametri usando un software di proteomica specifica: (Nota: Vedere 3 per ulteriori dettagli.)
    un. Tolleranza Ion: 10 ppm
    b. Tolleranza agli ioni frammento: 0.05 Da
    c. False Discovery Rate (FDR): 1%
    d. Database: Database umana UniProt
    e. modifiche fisse: Carbamydomethylation a Cys
    f. modifiche variabile (se richiesto dal software): ossidazione (Met), deamidation (Asn e Gin).
  2. Caratterizzazione fiducioso e quantificazione dei prodotti isomerici deamidati nei dati LERLIC-MS / MS:
    un. Export risultati della ricerca del database da LERLIC-MS / MS a un software di spreedsheet per l'analisi.
    b. Trovare ed estrarre l'intero elenco di peptidi Deamidated e le loro controparti non-deamidati.
    c. Utilizzando l'elenco dei peptidi ottenuti come riferimento, estrarre i cromatogrammi ionici (XICs) di questi peptidi mediante un software appropriata a 5 ppm di tolleranza massa. (Nota:Vedere 3 per ulteriori dettagli sul software utilizzato per l'estrazione di XICs.)
    d. Controllare visivamente le XICs ottenuti per identificare il separato eluizione doppio picco dei prodotti isomerici come indicato 3. (Nota: i prodotti isomeri di questi peptidi identificati a livello MS / MS si possono trovare facilmente guidato dalla presenza di due differenti tempi di ritenzione nei risultati della ricerca di database.)
    e. quantificazione relativa dei prodotti isomerici da ciascuna deamidato sito / peptide deve essere eseguita sulla base dell'area di picco di ciascun isomero identificati negli XICs ottenuti.

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Results

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Deamidation di residui Gln e Asn è considerata una modifica proteina degenerativa (DPM) implicati in numerose malattie croniche e mortali 14. È stato dimostrato che questo PTM può prevedere l'emivita e degradative stati di anticorpi e altre molecole nel corpo umano e sfondi biologiche simili 1, 15. Il significato di deamidation proteine, infatti, va oltre il contesto biomedico, quindi questa modifica è pre...

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Discussion

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In questo video-articolo presentiamo un protocollo passo-passo di LERLIC-MS / MS 3, un metodo per eseguire la caratterizzazione approfondita e di determinare con precisione l'entità del deammidazione proteine ei processi enzimatici coinvolti in questa modifica proteina. LERLIC-MS / MS è basato sull'uso di un lungo lunghezza (50 cm) LAX secondo il principio della elettrostatico cromatografia interazione repulsione-idrofila (Erlic) 27. L'utilizzo di una colonna a...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da sovvenzioni dal Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore (Tier 2: Grant ARC9 / 15), Consiglio Nazionale delle Ricerche di Medicina di Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016), e NTU-NHG Aging Research Grant ( concessione ARG / 14017). Vorremmo esprimere la nostra gratitudine e il più sincero ringraziamento al Dr. Andrew Alpert e la squadra PolyLC per ci ha gentilmente fornito il materiale di imballaggio che hanno reso possibile questo studio.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PolyCAT 3 µ m 100-Å (materiale sfuso)PolyLC Inc.Colonna
capillare a scambio ionico di lunga lunghezza 50 cm - 200 µ m IDPolyLC Inc.Ordine
Tubo PEEKsil 1/16" OD x 200 µ m ID x 50 cm di lunghezzaSGE Analytical Science sotto Trajan Scientific Australia 620050
Raccordo femmina-femmina per tubi da 1/16" ODUpchurch ScientificUPCHF-125
Dado femmina per microferuleUpchurch ScientificUPCHP-416
MicroferuleUpchurch ScientificUPCHF-132
Bomba a pressione NanoBaumeWestern Fluids EngineeringSP-400
Shimadzu Prominence UFLC sistemaShimadzuProminence UFLC
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Tubi con blocco di sicurezzaEppendorf T9661-1000EA
Perline in acciaio inossidabile. 0,9 - 2,0 mm. 1 lb. Non sterile.Next AdvanceSSB14B
Centrifuga da tavolo Hettich ZentrifugenRotina 380 R
Bagno di circolazione riscaldato digitale standard, 120VACPolyScience 8006 6L8006A11B
Confezione separata c18 cartuccia di desalinizzazione 50 mgWatersWAT020805
concentratore VacummEppendorf Concentratore Plus
Dionex UltiMate 3000 UHPLC DionexUltiMate 3000 UHPLC 
Spettrometro di massa Orbitrap EliteThermo Fisher Scientific Inc.ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray Michrom-Bruker Inc.Incubatore TCSI-SS2
INCUCELL MMM GruppoINCUCELL111
Tripsina modificata di grado sequenzialePromegaV5111
Compresse da cocktail di inibitori della proteasiRoche11836170001 (ROCHE)
Soluzione tampone fosfato 10x (diluita a 1x)Sigma-AldrichP5493
Acetato di ammonioSigma-AldrichA1542
Sodio desossicolatoSigma-AldrichD6750
DitiotreitoloSigma-AldrichD0632
IodoacetammideSigma-Aldrichi6125
Acido formicoSigma-AldrichF0507 (HONEYWELL)
Idrossido di ammonioSigma-Aldrich338818 (HONEYWELL)
Acetonitrile HPLC gradoSigma-Aldrich675415
Isopropanolo Grado HPLCSigma-Aldrich675431
Acqua Grado HPLCSigma-Aldrich14263
specialeSistema

References

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