LERLIC-MS / MS per approfondita caratterizzazione e quantificazione di glutammina e asparagina deamidazione in Fucile Proteomics

Summary

Qui vi presentiamo un protocollo passo-passo del lungo lunghezza elettrostatico repulsione-idrofilo interazione cromatografia-spettrometria di massa tandem metodo (LERLIC-MS / MS). Questa è una nuova metodologia che consente per la prima volta quantificazione e caratterizzazione dei glutammina e asparagina isoforme deamidazione da proteomica fucile.

Abstract

Caratterizzazione di deamidation proteina è indispensabile per decifrare il ruolo (s) e le potenzialità di questa proteina post-traslazionale modifica (PTM) nella patologia umana e in altri contesti biochimici. Al fine di eseguire la caratterizzazione di deamidation proteine, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo lungo lunghezza elettrostatico interazione cromatografia-spettrometria di massa tandem repulsione-idrofilo (LERLIC-MS / MS) Metodo che può separare la glutammina (Gln) e asparagina isoforma (Asn) prodotti di deamidation da composti modello a campioni biologici molto complessi. LERLIC-MS / MS è, dunque, la prima strategia proteomica fucile per la separazione e la quantificazione di Gln isoforme deammidazione. Abbiamo anche dimostrato, come una novità, che il protocollo di trasformazione campione qui delineato stabilizza l'intermedio succinimmide permettendo la sua caratterizzazione LERLIC-MS / MS. L'applicazione di LERLIC-MS / MS come mostrato in questo articolo il video può aiutare a chiarire il momento sconosciutoarray n molecolari deamidation proteine. Inoltre, LERLIC-MS / MS fornisce ulteriore comprensione delle reazioni enzimatiche che comprendono deamidation in sfondi biologiche distinte.

Introduction

Deamidation è una modificazione post-traduzionale di proteine (PTM) che introduce una carica negativa al backbone proteina mediante una modifica di asparagina (Asn) e / o glutammina (Gln) residui ^1. Questa modifica mentre colpisce residui Asn genera prodotti isomerici acido isoaspartic (isoAsp) e n acido -aspartic (Asp) ad un comune rapporto 3: 1 ^2. Nonostante, questo rapporto può essere alterato dall'intervento della riparazione enzima L-isoaspartyl metiltransferasi (PIMT) ^{3, 4.} Analogamente, deamidation di residui Gln genera acido isomerica gamma-....

Protocol

1. Imballo Long-length di scambio anionico (LAX) colonna capillare

(Nota: Anche se la colonna LAX può essere in casa imballato come descriviamo in questo protocollo, colonne LAX sono anche disponibili in commercio, vedi Tabella dei Materiali e reagenti per ulteriori dettagli).

1. Sospendere 50 mg di materiale da imballaggio scambio anionico debole in 3,5 mL di tampone imballaggio (Tabella 1) per preparare l'impasto liquido.
2. Montare l'estremità della colonna capillare (50 cm Lunghezza - 200 micron di diametro interno (ID) Tubi) utilizzando una femmina-femmina raccordo, un....

Results

Deamidation di residui Gln e Asn è considerata una modifica proteina degenerativa (DPM) implicati in numerose malattie croniche e mortali ^14. È stato dimostrato che questo PTM può prevedere l'emivita e degradative stati di anticorpi e altre molecole nel corpo umano e sfondi biologiche simili ^{1, 15.} Il significato di deamidation proteine, infatti, va oltre il contesto biomedico, quindi questa modifica è pre.......

Discussion

In questo video-articolo presentiamo un protocollo passo-passo di LERLIC-MS / MS ^3, un metodo per eseguire la caratterizzazione approfondita e di determinare con precisione l'entità del deammidazione proteine ei processi enzimatici coinvolti in questa modifica proteina. LERLIC-MS / MS è basato sull'uso di un lungo lunghezza (50 cm) LAX secondo il principio della elettrostatico cromatografia interazione repulsione-idrofila (Erlic) ^27. L'utilizzo di una colonna a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3 µ m 100-Å (materiale sfuso)	PolyLC Inc.	Colonna
capillare a scambio ionico di lunga lunghezza 50 cm - 200 µ m ID	PolyLC Inc.	Ordine
Tubo PEEKsil 1/16" OD x 200 µ m ID x 50 cm di lunghezza	SGE Analytical Science sotto Trajan Scientific Australia	620050
Raccordo femmina-femmina per tubi da 1/16" OD	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Dado femmina per microferule	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Bomba a pressione NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC sistema	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Tubi con blocco di sicurezza	Eppendorf	T9661-1000EA
Perline in acciaio inossidabile. 0,9 - 2,0 mm. 1 lb. Non sterile.	Next Advance	SSB14B
Centrifuga da tavolo	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Bagno di circolazione riscaldato digitale standard, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Confezione separata c18 cartuccia di desalinizzazione 50 mg	Waters	WAT020805
concentratore Vacumm	Eppendorf		Concentratore Plus
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Spettrometro di massa Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Michrom-Bruker Inc.	Incubatore TCSI-SS2
INCUCELL	MMM Gruppo	INCUCELL111
Tripsina modificata di grado sequenziale	Promega	V5111
Compresse da cocktail di inibitori della proteasi	Roche	11836170001 (ROCHE)
Soluzione tampone fosfato 10x (diluita a 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Acetato di ammonio	Sigma-Aldrich	A1542
Sodio desossicolato	Sigma-Aldrich	D6750
Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	D0632
Iodoacetammide	Sigma-Aldrich	i6125
Acido formico	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Idrossido di ammonio	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acetonitrile HPLC grado	Sigma-Aldrich	675415
Isopropanolo Grado HPLC	Sigma-Aldrich	675431
Acqua Grado HPLC	Sigma-Aldrich	14263