Viene presentato un protocollo per la produzione di tRNA (UUU) e l'analisi di tRNA (UUU) in complesso con l'enzima TcdA mediante saggi di retardazione del gel agarosio.
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Articolo metodologico
Analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-tRNA per l'analisi del
In questo articolo
Sommario
Abstract
Esistono metodi per l'espressione e la purificazione di tRNA (UUU) in Escherichia coli e l'analisi mediante test di ritardo di gel del legame di tRNA (UUU) a TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi che ciclizza il treonilcarbamoil La catena laterale attaccata ad A37 nel loop di gambo anticodon (ASL) di tRNA a ciclica t 6 A (ct 6 A). La transcrizione del gene sintetico che codifica il tRNA (UUU) è indotta in E. coli con 1 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e le cellule contenenti tRNA vengono raccolte 24 h postinduzione. La frazione RNA viene purificata usando il metodo di estrazione di fenolo acido. Il tRNA puro viene ottenuto mediante una cromatografia di filtrazione a gel che effettua la separazione efficiente delle molecole di tRNA di piccole dimensioni dai più grandi acidi nucleici intatti o frammentati. Per analizzare il legame TcdA a tRNA (UUU), TcdA viene mescolato con tRNA (UUU) e separato su un gel agarosico nativo a 4 ° C.Il tRNA libero (UUU) migra più velocemente, mentre i complessi TcdA-tRNA (UUU) subiscono un ritardo di mobilità che può essere osservato durante la colorazione del gel. Abbiamo dimostrato che TcdA è un enzima tRNA (UUU) -binding. Questo test di ritardo di gel può essere utilizzato per studiare mutanti TcdA e gli effetti degli additivi e di altre proteine sul legame.
Introduzione
Il saggio di ritardo di gel 1 (noto anche come test di spostamento di mobilità elettroforetica, EMSA) è un metodo elettroforetico progettato per studiare e caratterizzare le interazioni proteiche-acido nucleico. Permette di analizzare le proteine-DNA e le interazioni proteine-RNA e in particolare le interazioni tra tRNA e proteine leganti tRNA, utilizzando componenti purificati o miscele complesse di proteine ( ad es. , Lisati cellulari) o acidi nucleici ( ad esempio tRNA piscine). Abbiamo applicato saggi di retardazione del gel allo studio dell'interazione tra tRNA purificato (UUU) e TcdA, una N 6....
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Protocollo
Attenzione: Prima dell'uso consultare tutte le schede tecniche di sicurezza relative ai materiali (MSDS). Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossiche e corrosive. Utilizzare pratiche appropriate quando si esegue l'estrazione di tRNA utilizzando fenolo, incluso l'uso di un cappuccio e delle attrezzature di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse, ecc .). Questo protocollo utilizza una macchia acida nucleica non tossica. L'uso di macchie alternative può richiedere ulteriori precauzioni e smaltimento specializzato del colorante se tossico e / ....
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Risultati
Grandi quantità di tRNA (UUU) possono essere ottenute esprimendo il gene tRNA in E. coli sotto il controllo di un forte promotore T7 inducibile. L'espresso tRNA (UUU) si accumula nel citoplasma e si arricchisce sulla piscina di tRNA naturali abbondanti. Un procedimento di purificazione a due fasi costituito da una fase di cattura / estrazione e una fase di filtrazione / lucidatura gel è stata utilizzata per ottenere il tRNA di grado EMSA. La fase di cattura / estrazione util.......
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Discussione
Il saggio di retardazione del gel agarosico di proteina-tRNA descritto qui può essere modificato in diversi modi. In primo luogo, la percentuale di agarosio nel gel può essere ridotta per consentire la separazione e la visualizzazione di complessi proteina-tRNA significativamente più grandi di quelli analizzati qui (120 kDa). In secondo luogo, se la proteina bersaglio è termolabile, occorre prendere ulteriori precauzioni per garantire che la temperatura sia mantenuta al di sotto della massima temperatura accettabile spo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
MCV è membro del programma CIB Intramural "Macchine Molecolari per una migliore vita" (MACBET). La ricerca che ha portato a questi risultati è stato finanziato dall'ente spagnolo Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), dal ministero spagnolo de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R e SAF2015-72961-EXP alla MCV ), Il governo regionale di Madrid (S2010 / BD-2316 a MCV) e la Commissione europea (Programma quadro 7 (FP7)) il progetto ComplexINC (contratto n. 279039 a MCV). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta di dati e nell'analisi, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 contiene polimerasi T7 dopo induzione di IPTG. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d conferisce resistenza all'ampicillina; Promotore T7. |
| brodo LB, a basso contenuto di sale (brodo Lennox L), granulato | Melford | GL1703 | Brodo LB convenzionale, ad alto contenuto di sale. |
| Ampicillina | Sigma-Aldrich 10419313 | ||
| Agitatore per incubatrici (termostatato) | NBS | Excella E24 | È possibile utilizzare qualsiasi incubatore con agitatore con controllo della temperatura. |
| Isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Acetato di sodio, anidro, >99% | Melford | B4017 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), sale disodico, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Dannoso se inalato. |
| Centrifuga (refrigerata) | Eppendorf | 5430 | |
| Rotore centrifuga (refrigerata) | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuga | Sorvall | RC5C | |
| Rotore centrifuga | Sorvall | SLA-3000 | |
| Soluzione fenolica, Saturata con tampone citrato 0,1 M, pH 4,3 ± 0,2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione), corrosivo |
| Etanolo assoluto per analisi, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodio fosfato bibasico diidrato, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassio diidrogeno fosfato, KH2PO4 | Merck | 48.730.250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarosio | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(idrossimetil)amminometano HCl] | Melford | T1513 | |
| Acido borico | Melford | B0503 | |
| Microonde | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosivo per i metalli e la pelle. |
| ATP [Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato], Grado I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Cloruro di magnesio (MgCl2), anidro, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Cloruro di sodio (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Cloruro di potassio (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Alimentatore | Consort | EV261 | |
| Unità di elettroforesi | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe Colorazione degli acidi nucleici | Real Laboratory | RBMSAFE | 20.000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Marchio Fisher | 13214789 |
Riferimenti
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.
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Ristampe e permessi
