Articolo metodologico

Dissezione del Pancreas del Mouse per l'analisi istologica e Profiling metabolico

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DOI:

10.3791/55647

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19 agosto 2017

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1Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, 2College of Medicine, Central Michigan University

In questo articolo

Sommario

Questo video articolo fornisce una dimostrazione dettagliata delle procedure necessarie per rimuovere con successo il pancreas da un mouse tramite la dissezione per l'analisi istologica e profiling metabolico.

Abstract

Stiamo indagando il fattore di trascrizione specifico del pancreas, 1a cre-ricombinasi; ratto di salmone affumicato-fermata-salmone affumicato-Kristen sarcoma, glicina, l'acido aspartico pone al codone 12 (Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / +) ceppo il mouse come un modello di cancro del pancreas umano. L'obiettivo dei nostri studi attuale consiste nell'identificare nuovi biomarcatori metabolici della progressione del cancro del pancreas. Abbiamo eseguito il profilo metabolico di urina, feci, sangue ed estratti di tessuto del pancreas, come pure le analisi istologiche del pancreas per mettere in scena la progressione del cancro. Il pancreas del mouse non è un organo solido ben definito come negli esseri umani, ma piuttosto è un tessuto molle diffusamente distribuito che non è facilmente identificabile da parte di persone non hanno familiarità con l'anatomia interna del mouse o da individui che hanno poca o nessuna esperienza di prestazione dissezioni di organo del mouse. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire una dettagliata graduale dimostrazione visiva per guidare i novizi nella rimozione del pancreas del mouse tramite la dissezione. Questo articolo dovrebbe essere particolarmente utile per gli studenti e gli investigatori di nuovo alla ricerca che richiede la raccolta del pancreas del mouse tramite la dissezione per profiling metabolico o analisi istologiche.

Introduzione

Il mouse è emersa come un importante modello animale di cancro del pancreas umano1,2. Nel Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + modello del topo, Kristen oncogene di ratto sarcoma (K-Ras) viene attivata esclusivamente nel pancreas, con conseguente apertura di lesioni precancerose del pancreas, conosciuto come neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanINs), che il progresso per gli adenocarcinomi duttali pancreatici, comunemente come PDACs3. Questo sistema di modello del mouse fornisce uno dei migliori modelli animali disponibili per cancro del pancreas umano4,5, con l'ulteriore vantaggio che il PanINs emergono entro i primi cinque mesi di vita e frequentemente di progresso per PDAC entro un singolo anno4,5, considerando che il cancro del pancreas si verifica più frequentemente negli esseri umani 60-70 anni di età.

Estrazione del pancreas tramite la dissezione dal Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + topi alle varie età permette per un esame istologico longitudinale dello sviluppo del cancro del pancreas, che vanno dalle prime fasi PanIN attraverso la progressione a PDAC3,4 , 5. raccolta del pancreas alle età che variano da cinque a quindici mesi può essere utilizzata anche per preparare il tessuto estratti per caratterizzare i cambiamenti globali nel pancreas4 metabolismo che si verificano durante la transizione da sano al tessuto malato 6,7.

Questo articolo presenta una guida visiva completa i passaggi necessari per eseguire un'estrazione del pancreas del mouse e fornisce linee guida per la conservazione di un pancreas per ulteriori analisi. Questa guida sarà altrettanto preziosa per individui conducendo una ricerca su altre malattie del pancreas, compreso il diabete di tipo e dovrebbero essere particolarmente utili per gli studenti e gli investigatori nuovi di ricerca che coinvolge la raccolta del pancreas del mouse utilizzando dissezione per profiling metabolico o analisi istologiche.

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Protocollo

le procedure effettuate nel video e descritti di seguito sono state approvate da istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) presso l'Università di Miami.

1. preparazione e Test di stimolo

  1. stabilire due aree distinte per la procedura chirurgica, il tavolo operatorio e la tabella post-operazione. Fase di entrambe le aree con tutti i materiali e gli utensili necessari. Tabella
    1. stage operativo sotto un cappuccio ventilato. Organizzare la tabella con l'apparecchiatura in un modo che permette il continua e senza ostacoli delle prestazioni della procedura.
    2. Stabilire una tabella di postoperatoria nella stessa stanza e vicino al tavolo principale dell'operazione. Mantenere entrambe le tabelle come ambienti sterili durante tutta la procedura.
  2. Posto i seguenti rifornimenti sul tavolo operatorio: un barattolo con coperchio, una provetta da 15 mL, un paio di forbici chirurgiche, una bottiglia di etanolo al 70%, due pannelli in schiuma, due pinze, due siringhe di calibro 1 mL 21, due provette da 50 mL, una provetta , un flaconcino criogenico, quattro rilievi chirurgici, dieci birilli, un dispenser di salviette sterilizzanti e un contenitore di sharps.
  3. Posto le seguenti forniture sul tavolo post-operazione: una bilancia analitica, uno 4 L dewar di azoto liquido, una vasta poco profonda bocca dewar, un rack di Conetti galleggiante, un paio di forbici chirurgiche, due pinze, quattro fiale criogeniche e un dispenser di salviette sterili.
  4. Riempire un 50 mL e un tubo da 15 mL 75% volume con formalina.
  5. Con uno spillo in ogni angolo, apporre un tampone chirurgico ad un Consiglio di schiuma approssimativo 30 x 30 cm per servire come il bordo di dissezione. Utilizzare i rimanenti quattro perni durante l'operazione. Preparare un piccolo bordo di schiuma con un tampone chirurgico per trasferire gli organi alla tabella post-op.
    Attenzione: Isoflurano (99.9%) è una sostanza chimica tossica e deve essere utilizzato in una cappa di sfiato per garantire il massimo livello di sicurezza dall'evacuazione di gas anestetico dei rifiuti 8. Ulteriori informazioni riguardanti i rischi per i ricercatori associati all'utilizzo del metodo open-goccia con isoflurano possono essere trovate in un articolo di Taylor e Mook 8.
  6. Inserire un tampone chirurgico il vaso di vetro e bagnare con qualche goccia di isoflurane (99.9%) e posizionare un asciugamano di carta sopra la parte superiore per evitare il contatto diretto del mouse con l'isoflurano. Analogamente, utilizzare un tampone chirurgico per linea tubo restante e bagnare con qualche goccia di isoflurano e posizionare un cuscinetto supplementare sopra la parte superiore per evitare il contatto diretto tra il mouse e l'isoflurano.
  7. Pour azoto liquido in bocca ampia superficiale dewar fino alla linea di riempimento massimo è raggiunto.
  8. Posto il mouse selezionato per dissezione in anestesia da camera, cioè il vaso di vetro con un tampone imbevuto con poche gocce di isoflurane (99.9%) coperta con il coperchio, per un minimo di ~ 1
    Nota: Questo tempo varia da mouse a mouse. Una volta che il mouse è incosciente, rimuoverlo dall'alloggiamento e posizionarlo al centro del tavolo operativo.
  9. Orientare il mouse in modo che si è sdraiato sul lato ventrale e con la testa puntato lontano dallo scienziato. Posizionare la testa all'interno del tubo interno foderato con un tampone chirurgico imbevuto con qualche goccia di isoflurane (99.9%) e un pizzico di piede per assicurare che il mouse non risponde agli stimoli per eseguire un test di stimolo.
    1. Se questo test ha esito negativo e il mouse risponde alla prova di pizzico del piede, ripetere il passaggio 1.8.

2. Incisione, cuore di puntura e l'eutanasia iniziale

  1. Pin gli arti del mouse alla scheda di schiuma chirurgica e bagnato il lato ventrale del mouse con etanolo al 70%.
  2. Pizzicare la pelle/pelliccia vicino all'apertura uretra con pinze e tirare leggermente verso l'alto. Fare un'incisione con le forbici chirurgiche attraverso la cavità addominale, a partire dall'apertura uretra, la linea mediana e termina al mento.
    1. Vicino al punto di partenza dell'incisione iniziale, afferrare un lato della pelliccia/pelle con il forcipe e fare un'altra incisione con le forbici verso il basso e in diagonale verso la zampa posteriore.
    2. Ripetere questa operazione nello stesso modo sul lato opposto.
      Nota: La pelliccia/pelle può essere appuntata giù per creare una più ampia apertura, ma non è necessaria.
  3. Cuore di individuare e rimuovere il pericardio, che è la sacca intorno al cuore, per evitare l'intasamento dell'ago della siringa.
    1. Afferrare il pericardio con il forcipe e tagliare con le forbici. Eseguire la puntura di cuore inserendo con attenzione l'ago della siringa nel cuore pulsante e iniziare lentamente per ritrarre lo stantuffo.
    2. Per la raccolta del sangue ottimale, usare lo stantuffo dell'ago per imitare l'azione di pompaggio del cuore ed evitare di disegno troppo in fretta.
      Nota: In genere circa 1 mL di sangue può essere raccolto.
    3. Dopo aver completato la raccolta di sangue, dissipare il sangue nella provetta da centrifuga e smaltire la siringa nel contenitore di sharps.
    4. Dopo la puntura di cuore viene eseguita, eseguire l'eutanasia rimuovendo gli allegati collegamento cuore.
      Nota: L'eparina, un anticoagulante, non è stato aggiunto alla siringa in questa procedura prima della puntura cuore per permettere al sangue di coagulare per raccolta del siero in questo studio specifico. Tuttavia, se il ricercatore ha desiderato impedire la coagulazione del sangue per la raccolta del plasma, l'eparina potrebbe aggiungersi alla siringa prima della puntura di cuore.
  4. Se lo studio comporta la genotipizzazione del mouse, praticare una porzione dell'orecchio con le forbici e inserire in una provetta da centrifuga per una verifica di genotipo.

3. pancreas estrazione

  1. Locate stomaco sul lato sinistro del mouse. Begin delicatamente (in modo da evitare di strappare) che separa il pancreas dallo stomaco e duodeno utilizzando due pinze.
    Nota: Prima di scollegare il pancreas dallo stomaco e l'intestino, è molto importante che le pinze sono utilizzate delicatamente per guidare il tessuto pancreatico lontano gli organi e a non schiacciare o strappare il pancreas con il forcipe.
    1. Continuano a separare il pancreas dalle sezioni piccolo intestino digiuno e ileo e infine dall'intestino cieco dell'intestino crasso.
  2. In intestino cieco, riposizionare il forcipe e continuare la separazione del pancreas lungo il restante colon verso il retto.
    Nota: A questo punto, è conveniente tagliare e rimuovere la parte dallo stomaco alla regione del colon immediatamente precedente retto.
  3. Individuare il pancreas e attaccato la milza. Far scorrere il pancreas verso il lato destro del mouse. Separare le connessioni rimanenti tra il pancreas e la cavità toracica con il forcipe per scollegare completamente il pancreas e la milza comunicanti.
  4. Rimuovere il pancreas e stenderlo per esame. Lasciare la milza associata al pancreas per scopi di identificazione.
    1. Rimuovi tutto del tessuto connettivo, il tessuto grasso e mesenterico dal pancreas.
      Nota: Questo tessuto è più bianco nel colore e quindi può essere facilmente distinto dal tessuto del pancreas che è pinker in colore. Ciò è particolarmente importante se l'intero pancreas deve essere rimosso. Ad esempio, se il pancreas deve essere pesato e rispetto al peso corporeo o tra gruppi di animali. Nel Ptf1a cre / +; LSL-Kras G12D / + modello del topo, in particolare nei mesi precedenti, tessuto pancreatico fibroso duro potrebbe essere presente. In questo caso, la rimozione accurata del pancreas dovrà svolgersi come l'intestino potrebbe essere intrecciata nel tessuto del tumore. Nei casi avanzati, possono anche essere presenti anormale della milza e tessuto del fegato.
  5. Se lo si desidera, rimuovere altri organi a questo punto.

4. raccolta dei dati e archiviazione

  1. dopo l'estrazione degli organi, spostare i campioni alla zona postoperatoria per conservazione.
  2. Pesare ogni organo e metterli nel loro rispettivo flacone criogenico.
    Nota: lungo with la massa di ciascun campione, eventuali irregolarità devono essere registrate per riferimento futuro.
  3. Una volta che gli organi sono pesati, inserirli nell'azoto liquido per congelamento snap.
  4. Dopo lo snap di congelamento, riporre gli organi a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
  5. Il formalina memorizzato i campioni sulla parte superiore del banco durante la notte e la mattina successiva modificare loro soluzione da formalina in etanolo al 70%.
    Nota: Questi campioni devono essere conservati a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.
  6. Per immagazzinaggio a lungo termine, congelare il pugno di sangue e l'orecchio a-80 ° C.. Per la raccolta del siero dal sangue, permettere al sangue di coagulare per 30 min e poi centrifugare esso. Rimuovere la parte di siero utilizzando una pipetta e quindi conservare a -80 ° C.

5. Clean Up

  1. Sanitize tutti la dissezione strumenti con le salviettine sterilizzante. Tappo del tubo interno foderato con l'isoflurano imbevuto chirurgiche pad. Sostituire il tampone chirurgico sulla scheda di schiuma con un tampone chirurgico fresco. Disporre le porzioni del mouse che non sono state raccolte per l'alloggio ' politica di smaltimento animale s.

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Risultati

La figura 1 Mostra una panoramica dell'area ambiente operativa e la figura 2 Mostra l'area di operazione post. Mentre questa impostazione fornisce la quantità minima di attrezzature e messa in scena, gli individui possono scegliere di modificare questo per meglio soddisfare le esigenze individuali. Il protocollo dovrebbe essere ottimizzato secondo le specifiche esigenze dell'esperimento. Questa procedura è condotta in modo che te...

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Discussione

Significato per quanto riguarda i metodi esistenti
Mentre esista altri video informale delle dissezioni del mouse, questo video articolo fornisce la prima qualità professionale, inter pares, dimostrazione visiva di tutti i passaggi dettagliati necessari per l'estrazione e la raccolta del pancreas del mouse tramite la dissezione10 . Il pancreas è un organo principale per attività metabolica e insulino produzione, la dissezione e la raccolta del pancreas permette la conservazione...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

MAK riconosce il supporto per questo lavoro dai National Institutes of Health / numero - 1R15CA152985-01A1 di sovvenzione del National Cancer Institute. Questo progetto è stato supportato anche dal Miami University Undergraduate Research Award programma, le opportunità di dottorato-laurea Università di Miami per Scholarship Program e il programma di studiosi di Miami University estivo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Barattolo di vetro Corning3140-150Il barattolo di vetro utilizzato nel video è stato interrotto. Questo è il suo sostituto.
Coperchio del barattolo di vetroCorning9985-150Il coperchio del barattolo di vetro utilizzato nel video è stato interrotto. Questo è il suo sostituto.
Provette Falcon da 15 mlFisher Scientific339650
Forbici chirurgicheFisher Scientific9201
Flacone da spremere Fisher Scientific03-409-10DD
100% etanoloFisher Scientific22-032-103
FormalinaFisher Scientific245-684
Pannelli in schiumaTherapak562908
PinzeFisher Scientific200205SHN
1 mL 21G SiringheBD Biosciences309624
Provette Falcon da 50 mLFisher Scientific 339652
Provette per microcentrifuga da 2,0 mLFisher Scientific02-681-258
Cuscinetti chirurgiciFisher ScientificS67011
Perni a T Lunghezza:  2" Prodotti Advance StoreX32T-05
Salviette sterilizzantiMonouso professionali International Inc.Q85084
Contenitore per oggetti taglientiFisher Scientific14-827-122
Bilancia analiticaMarshall ScientificME-AE200
4L DewarTaylor-Wharton4LD
Bocca larga e poco profonda DewarFisher ScientificF3087-V
Rack per microprovette galleggianteVWR60986-100
Fiala criogenica 1,2 mL, sterileFisher Scientific10-500-25
Isothesia (isoflurano) Henry Schein Salute degli animali050033
Azoto liquidoWright BrothersNIT-60-XX
Ceppo di topo KrasThe Jackson LaboratoryOO8179
Ceppo di topoCre MMRRCOOO435-UNC

Riferimenti

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