Un'interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Summary

Presentiamo una soluzione software per il monitoraggio semi-automatico della concentrazione proteica relativa lungo la lunghezza delle protuberanze cellulari dinamiche.

Abstract

Le filopodie sono dinamiche, protrusioni cellulari simili a dito associate alla migrazione e alla comunicazione cellulare. Per comprendere meglio i complessi meccanismi di segnalazione sottostanti all'iniziazione filosofica, all'allungamento e alla successiva stabilizzazione o ritrazione, è fondamentale determinare l'attività proteica spazi-temporale in queste strutture dinamiche. Per analizzare la funzione proteica in filopodi, abbiamo recentemente sviluppato un algoritmo semi-automatizzato di tracciamento che si adatta a cambiamenti di forma filopodiale consentendo così un'analisi parallela delle dinamiche di protrusione e della concentrazione di proteine ​​relative lungo tutta la lunghezza filopodiale. Qui presentiamo un dettagliato protocollo dettagliato per la gestione delle celle ottimizzate, l'acquisizione di immagini e l'analisi del software. Inoltre forniamo istruzioni per l'utilizzo delle funzioni opzionali durante l'analisi delle immagini e la rappresentazione dei dati, nonché le linee guida per la risoluzione dei problemi per tutti i passaggi critici lungo la strada. Infine, includiamo anche un confronto del dSoftware di analisi di immagini escribed con altri programmi disponibili per la quantificazione filopodia. Insieme, il protocollo presentato fornisce un quadro per un'analisi accurata delle dinamiche proteiche nelle protuberanze filopodiali usando il software di analisi delle immagini.

Introduction

Il controllo spazio-temporale delle proteine ​​regolatrici dell'atina è associato alla dinamica dei filopodium ^{1 , 2} . Il monitoraggio della concentrazione proteica spazialmente risolto lungo tutta la lunghezza filopodiale nel tempo è quindi cruciale per favorire la comprensione dei meccanismi che sottendono l'iniziazione, l'allungamento, la stabilizzazione o il crollo di queste strutture dinamiche ^{3 , 4} . A differenza dell'analisi proteica nel citosolo, in cui si verificano molteplici cambiamenti di forma cellulare in una scala più ampia, le filopodi....

Protocol

1. Cultura cellulare

1. Coltura le cellule HeLa o COS nel mezzo modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 g / L D-glucosio, L-alanina-L-glutammina di dipeptide, piruvato, 10% siero fetale bovino e 10 unità / ml di penicillina / streptomicina. Neuroni di cultura in supporti di coltura senza L-glutamina, acido glutammico o acido aspartico, integrati da 0,5 mM dipeptide L-alanina-L-glutammina, supplementi neuronali privi di siero e 10 unità / ml di penicillina / streptomicina.
2. Una volta raggiunta la confluenza del 40%, trasporre le cellule con costrutti di scelta utilizzando un reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore. Mantenere ....

Results

Utilizzando le cellule COS trasfettate con un marker per l'actina filamentosa (f-tractina ¹⁸ , rossa) e un riferimento citosolico (verde), abbiamo trovato protrusioni filopodiali ricche di actina ( figura 3A , pannello superiore). La serie temporale ha dimostrato che la filopodia si estende e si ritrae rapidamente ( figura 3A , pannello centrale). Utilizzando il software di analisi delle immagini, abbiamo.......

Discussion

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per il monitoraggio delle dinamiche di crescita filopodale e l'analisi di concentrazioni di proteine ​​relative in queste strutture dinamiche attraverso l'algoritmo convesso. Utilizzando il software, fino a 3 canali possono essere confrontati in coppia in una singola esecuzione, per cui le relative concentrazioni di due canali ( cioè le proteine) vengono determinate durante il ciclo di estensione / ritrazione e memorizzate come file immagine e dati in cartelle s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	31966-021
10% Siero fetale bovino	Biochrom AG	L11-044
Lipofectamina 2000	Life Technologies	11668-027
1% penicillina/streptomicina	Biochrom AG	12212
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103-049
B27	Life Technologies	17504-044
HEPES (soluzione madre 1M)	Life Technologies	15630
Citrine-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
	Hela Leibniz Institute DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Istituto DSMZ	ACC-60
3T3 cellule	Leibniz Istituto DSMZ	ACC-59
Microscopio	Nicon Eclipse
Camera	Andor	DU888 Unità ultra
confocale	Yokagawa	CSU-X1
Piruvato	Gibco	31966-021