Questo lavoro descrive un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per lo studio dell'adesione piastrinica, della diffusione e della secrezione sotto flusso. Questa piattaforma versatile permette di studiare la funzione piastrinica per la ricerca meccanicistica sulla trombosi e sull'emostasi.
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Articolo metodologico
Imaging di cellule vive di degranulazione piastrinica e secrezione sotto flusso
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le piastrine di sangue sono giocatori essenziali in emostasi, la formazione di trombi per sigillare violazioni vascolari. Sono anche coinvolti nella trombosi, nella formazione di trombi che occludono la vascolarizzazione e danno gli organi, con conseguenze pericolose per la vita. Questo motiva la ricerca scientifica sulla funzionalità piastrinica e lo sviluppo di metodi per tenere traccia dei processi biologici in fase di flusso.
Sono disponibili diversi modelli di flusso per lo studio dell'adesione e dell'aggregazione delle piastrine, due fenomeni chiave della biologia piastrinica. Questo lavoro descrive un metodo per studiare la degranulazione piastrinica in tempo reale in fase di attivazione. Il metodo utilizza una camera di flusso accoppiata ad una messa a punto della pompa a siringa posta sotto un microscopio a fluorescenza a LED basato su ampio campo, invertito. L'impostazione qui descritta consente l'eccitazione simultanea di fluorofori multipli che vengono fornite da anticorpi a fluorescenza o fluorescentiColoranti ent. Dopo gli esperimenti di immagini a cellule vive, i vetri di copertura possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando microscopia statica ( cioè microscopia confocale o microscopia a scansione elettronica).
Introduzione
Le piastrine sono cellule anucleate che circolano nel flusso sanguigno. La loro funzione principale è quella di sigillare le ferite vascolari nei siti di lesioni e di prevenire la perdita di sangue. In questi siti di lesioni, le fibre di collagene subendoteliale diventano esposte e successivamente sono coperte dalla proteina multimerica, il fattore von Willebrand (VWF). VWF interagisce con le piastrine in circolazione in un meccanismo che dipende dal complesso glicoprotein Ibα-IX-V sulla superficie cellulare 1 , rallentando la velocità delle piastrine. Ciò è particolarmente importante a velocità elevate. Le piastrine successivamente subiscono ....
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Protocollo
Il Comitato Etico Medico Comunale del Centro Medico Universitario di Utrecht ha approvato il disegno del sangue per scopi di ricerca ex vivo , inclusi quelli di questo studio.
1. Preparazione della soluzione
- Preparare un buffer di Tyrode di 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico sciogliendo 10 mM HEPES, 0,5 mM Na 2 HPO 4 , 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4 e 5,55 mM D- Glucosio in acqua distillata.
- Fare due varianti del buffer: impostare i livelli di pH a 6,5 e rispettivamente a 7,4. Fai buca fresca per ogni giorno di esperimenti. Supplemento con 10 ng / ml pros....
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Risultati
La figura 1 mostra le immagini della camera di flusso e della configurazione sperimentale; La posizione e le dimensioni del foglio di silicio; E connessioni tubi. La Figura 2 fornisce i dettagli sulle dimensioni della camera di flusso. La figura 3 e il filmato 1 mostrano una serie di immagini di adesione e diffusione piastrinica su VWF immobilizzato. CD63 è una proteina transmembran.......
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Discussione
In tutto il mondo, la trombosi è una causa principale di morte e morbilità e le piastrine hanno un ruolo centrale nel suo sviluppo. Questo lavoro descrive un metodo per l'imaging a cellule vive della degranulazione piastrinica sotto il flusso. Generalmente si presume che, quando le piastrine si attivano, tutti i contenuti granulari vengono direttamente rilasciati in soluzione. I risultati di accompagnamento suggeriscono che questo non è necessariamente il caso. Durante l'aderenza e la degranulazione, le piastrin.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
CM riconosce il sostegno finanziario dell'Organizzazione Internazionale del Paziente per le Deficienze C1-Inibitore (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht e la Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonato (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucosio | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostaciclina | Cayman Chemical | 18220 | |
| Citrato trisodico | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Acido citrico | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Copriocchiali | Menzel-Glä ser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, n. 1 = spessore 0,13 - 0,16 mm. |
| Acido cromosolforico (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Fattore Von Willebrand (VWF) | purificato | ||
| Fibrinogeno | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| Piatto a 4 pozzetti, non trattato | Thermo Scientific | 267061 | |
| Frazione di albumina sierica umana V | Haem Technologies Inc. | ||
| Provette per prelievo di sangue, 9 mL, 9NC Coagulazione Citrato di sodio 3,2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Analizzatore cellulare | ematologico CELL-DYN | di Abbott Diagnostics | |
| Paraformaldeide | Sigma | 30525-89-4 | |
| Pompa a siringa | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| siringa da 10 ml con diametro di 14,5 mm | BD biosciences | 305959 | Siringa Luer-Lok |
| Anti-CD63-biotina | Abcam | ||
| Anti-CD62P-biotina | R& D Systems | Dy137 | |
| 4',6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidina, Alexa Fluor 488 coniugato | Thermo Scientific | S11223 | |
| Olio da immersione | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Soluzione detergente | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Alcool polivinilico | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris cloridrato | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabiciclo[2.2.2]ottano (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Pecora Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 pollici x 125 piedi. |
| Foglio di silicone non rinforzato | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0,125 mm. |
| Foglio di silicone tagliato su misura con canali di perfusione e vuoto | realizzati | Realizzato in foglio di silicone non rinforzato (Nagor, NA 500-1)Provette | |
| 1,5 mL | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Microscopio | fluorescente Zeiss Observer Z1 | Dotato di luci di eccitazione a LED. | |
| Software per microscopio | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G ago (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Pipetta pasteur in plastica | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduato fino a 3 mL. |
| Tubo in silicone | VWR | 228-0656 | Diametro interno. x Diametro esterno x Spessore della parete = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm. |
| Vetrini per microscopio | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, bordi rettificati 45 gradi, estremità smerigliata. |
Riferimenti
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013). <....
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Ristampe e permessi
