Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell'ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi.
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Articolo metodologico
Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le spline dendritiche sono le protuberanze degli alberi dendritici neuronali che contengono sinapsi eccitatoriali. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all'interno dell'ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoria. Ci sono diversi approcci alla colorazione Golgi, tutti utili per determinare le caratteristiche morfologiche degli archi dendritici e produrre uno sfondo chiaro. L'attuale metodo Golgi-Cox, (una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione Golgi commerciale), è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del farmaco chemioterapico 5-flurouracil (5-Fu) avrebbe influenzato la morfologia dendritica , Il numero di spine e la complessità dell'arborizzazione all'interno dell'ippocampo. Il 5-Fu ha significativamente modulato la complessità dendritica e ha ridotto la densità della colonna vertebrale in tutto l'ippocampo in un modo specifico della regione. I dati presentati mostrano che il metodo di colorazione Golgi efHa colorato esattamente i neuroni maturi nel CA1, nel CA3 e nel dentato gyrus (DG) dell'ippocampo. Questo protocollo riporta i dettagli di ogni passaggio in modo che altri ricercatori possano affidare affidabilmente il tessuto in tutto il cervello con risultati di alta qualità e minima risoluzione dei problemi.
Introduzione
I dendriti sono la parte più grande dei neuroni che ricevono e trattano l'input presinaptico 1 . I loro processi dendritici hanno una geometria complessa, in cui i rami prossimi hanno un diametro maggiore rispetto ai rami distali. Come sviluppano i dendriti, formano diversi collegamenti con altri neuroni in un processo denominato arborizzazione dendritica. L'estensione e il modello di questa ramificazione determina la quantità di input sinaptici che un dendrite può elaborare adeguatamente 2 .
L'arborizzazione dendritica è un processo necessario per la plasticità dipendente ....
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Protocollo
Gli esperimenti sono stati condotti secondo gli standard etici approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali a UAMS.
1. Animali e 5 paradigmi di iniezione
- Acquistare i maschi di tipo maschio C57Bl6 / J di 6 mesi e di alloggiarli sotto un ciclo di luce / buio costante da 12 h fino a quando non raggiungono 1 anno di età.
- Diluire la 5-Fu in soluzione salina sterile del 0.9%. Utilizzare 60 mg / kg come dose necessaria per mouse.
- Dare le iniezioni intraperitoneali del 5-Fu (una volta alla settimana per tre settimane).
- Date le iniezioni intraperitoneali attorn....
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Risultati
Gli effetti del trattamento 5-Fu sull'arborizzazione e la complessità dendritica nell'ippocampo delle sezioni cerebrali macchiate da Golgi sono state quantificate e tracciate utilizzando un software di imaging disponibile in commercio. Dopo la tracciatura, l'arborizzazione dendritica, la densità della colonna vertebrale e la morfologia della spina sono state analizzate usando l'analisi di Sholl e l'indice di complessità dendritica (DCI). L'analisi di Sholl è un me.......
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Discussione
Rispetto alle tecniche più moderne, il metodo Golgi-Cox presenta diversi vantaggi che lo rendono il metodo preferito per esaminare la morfologia della colonna vertebrale: 1) la colorazione può essere utilizzata per qualsiasi tessuto, 2) una messa a punto di microscopi di base è tutto ciò che serve a Acquisire immagini basate su Golgi, 3) l'imaging Golgi-Cox è più veloce di un'immagine confocale e 4) le sezioni macchiate di Golgi sono vitali per diversi mesi a anni più a lungo dei campioni che sono etichettati in.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione pilota sotto NIH P20 GM109005 (ARA) e dal Centro per il Premio Programma IDeA P30 GM110702 per il Trasferimento Neuroscienze.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit superGolgi | Bioenno Scienze della Vita | 30100 | Contiene materiali pericolosi. |
| PBS 10x concentrato in polvere | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Pescatore | SP 15-100 | |
| Coperchio scorrevole | Pescatore | 12-546-14 | |
| Pipetta di trasferimento da 7 mL | Globo scientifico | 135030 | |
| Provette Falcon da 10 mL | BD Bioscienze | ||
| Lamina | Pescatore | 01-213-105 | |
| Piastra a 12 pozzetti | BD Bioscienze | ||
| 200 prove di etanolo | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| xilene | Acros Organics | 1330-20-7 | Pericoloso. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL pipetta sierologica | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratomo | Mondo Strumenti di Precisione | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Topi maschi | Il Laboratorio Jackson | ||
| Axio Imager 2 | ZEISS | Componenti multipli, vedere il sito Web per i dettagli. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Piatto di colorazione, | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Set di piatti di colorazione | Scienze della microscopia elettronica | 70312-20 | |
| Riempitrice per pipette motorizzata | Pescatore | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscienze | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscienze | ||
| Prisma | GraphPad |
Riferimenti
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L.
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Ristampe e permessi
