Articolo metodologico

Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l'estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

DOI:

10.3791/55697

⸱

13 giugno 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, 3Ananda Devices

In questo articolo

Sommario

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Questa procedura descrive come avviare rapidamente, estendere e collegare neuriti organizzati in camere microfluidiche utilizzando perline poli-D-lisina fissate a micropipette che guidano l'allungamento del neurite.

Abstract

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La lesione del cervello e del midollo spinale può portare a disabilità permanente e alla morte perché non è ancora possibile rigenerare i neuroni per lunghe distanze e ricollegarle con un bersaglio adeguato. Qui viene descritta una procedura per iniziare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a lunghe distanze. I tassi di estensione raggiunti raggiungono oltre 1,2 mm / h, 30-60 volte più velocemente rispetto ai tassi in vivo degli assoni in crescita più veloci del sistema nervoso periferico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 e 10 volte più veloci di quanto riportato in precedenza per gli stessi Tipo neuronale in una fase precedente dello sviluppo 4 . In primo luogo, le popolazioni isolate di neuroni ippocampali del ratto vengono coltivate per 2-3 settimane in dispositivi microfluidici per posizionare le cellule in modo preciso, consentendo una facile micromanipolazione e una riproducibilità sperimentale. Successivamente, le perle ricoperte di poli-D-lisina (PDL) vengono poste sulle neurite per formare cont. AdesiveGli atti e la micromanipolazione pipettata vengono utilizzati per spostare il complesso bead-neurite risultante. Mentre il tallone viene spostato, estrae un nuovo neurite che può essere esteso su centinaia di micrometri e collegato funzionalmente a una cellula bersaglio in meno di 1 h. Questo processo consente la riproducibilità sperimentale e la facilità di manipolazione, escludendo strategie chimiche più lente per indurre la crescita del neurite. Le misure preliminari presentate qui dimostrano un tasso di crescita neuronale molto superiore a quelle fisiologiche. Combinando queste innovazioni permette la precisa creazione di reti neuronali nella cultura con un grado di controllo senza precedenti. È un metodo nuovo che apre la porta ad una pletora di informazioni e approfondimenti sulla trasmissione del segnale e sulla comunicazione all'interno della rete neuronale, nonché come un parco giochi in cui esplorare i limiti della crescita neuronale. Le potenziali applicazioni e gli esperimenti sono diffusi con implicazioni dirette per terapie che mirano a ricollegare la neuronaL circuiti dopo trauma o in malattie neurodegenerative.

Introduzione

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Le lesioni al sistema nervoso centrale adulto (CNS) possono portare a disabilità permanente a causa di meccanismi multipli che limitano la ricrescita assonale 1 . Dopo l'infortunio, molti assoni CNS non formano un nuovo cono di crescita e non riescono a montare una risposta efficace rigenerativa 2 . Inoltre, i danni e il tessuto delle cicatrici che circondano lesioni del CNS inibiscono significativamente la crescita axonica 1 , 2 , 3 . Le terapie correnti per promuovere la rigenerazione del SNC dopo lesioni sono state focalizzate sul miglioramento del potenziale di crescita intrinseco del neurone danneggiato e sulla mascheratura degli inibitori dell'estensione assonica associata a detriti di mielina e la cicatrice gliale 1 , 3 . Nonostante ciò la capacità di rigenerare gli assi lunghi a obiettivi lontani e di formare appropriate sinapsi funzionali rimane gravemente limitata 4 , 5 , 6 , 7 .

Nell'attuale lavoro, microbeads, micromanipolazione pipettata e dispositivi microfluidici vengono utilizzati per avviare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a lunghe distanze. Precedenti lavori hanno dimostrato che le perline ricoperte da poli-D-lisina inducono l'adesione della membrana seguita dal clustering dei complessi di vescicole sinaptici e la formazione di bouton presinaptici funzionali 8 . È stato inoltre dimostrato che quando il PDL-bead viene tirato meccanicamente dopo la differenziazione presinaptica, il cluster proteico sinaptico segue il branco, innescando un nuovo neurite 9 . La seguente procedura sfrutta questo fatto insieme alla capacità di coltivare i neuroni ippocampali embrionali di ratti in regioni organizzate su una copertura con dispositivi microfluidici polidimetilsilossano (PDMS) per ricreare con precisione un neuronecircuito.

Questi dispositivi microfluidici PDMS sono non tossici, otticamente trasparenti e sono costituiti da due camere collegate da un sistema di microchannel. Una volta assemblati su una copertura, ogni apparecchio serve come uno stampo per guidare la crescita neuronale e mantenere sani le culture neuronali su modelli precisi per più di 4 settimane in vitro .

Qui viene presentato un quadro per studiare i limiti di estensione e funzionalità del nuovo neurite. Nuove funzionalità neurite vengono create e posizionate per controllare (re) le reti neuronali. I tassi di estensione raggiunti sono più veloci di 20 μm / min su distanze di millimetro e sono stabilite le connessioni funzionali. Questi risultati mostrano inaspettatamente che la capacità intrinseca di queste neuriti per allungamento è molto più veloce di quanto precedentemente pensato. Questo approccio meccanico proposto supera strategie chimiche lente e consente la connessione controllata ad un target specifico. thÈ la tecnica apre nuove vie per lo studio in vitro di nuove terapie per ripristinare la connettività neuronale dopo il danno. Permette inoltre la manipolazione e il riavvolgimento delle reti neuronali per indagare aspetti fondamentali dell'elaborazione dei segnali neuronali e della funzione neuronale in vitro .

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Protocollo

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Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate dalla McGill University Animal Care Committee e sono conformi alle linee guida del Consiglio canadese di Animal Care.

1. Standardizzazione delle culture neuronali usando dispositivi microfluidici: Assemblaggio di apparecchiature

  1. Selezionare un dispositivo microfluidico adatto per l'esperimento desiderato. Per collegare i neuroni all'interno della stessa popolazione, utilizzare i Neuro Devices ( Figura 1 ) e collegare i neuroni in diverse popolazioni usa i dispositivi Co-Cultura ( Figura 6 ).
  2. Pulire e preparare il numero desiderato di coperchietti sterili o piatti di fondo in vetro. Per ottenere risultati ottimali sulle superfici di plastica utilizzare piatti da 35 mm, su vetri da 25 mm, oppure da piatti di fondo da 35 mm. Selezionare lo spessore del vetro basato sul sistema di imaging, ad esempio 0,15 mm.
  3. Cappare i piatti o le copertine con 0,5-1 ml di 100 μg / mL PDL per 2 ore o durante la notte a temperatura ambienteature.
    Nota: il protocollo può essere interrotto qui e ripreso il giorno successivo, se lo si desidera. Inoltre, i piatti possono essere rivestiti con PDL diluito in borato, PolyL-Lysine (PLL), laminina o qualsiasi altra molecola di adesione cellulare.
  4. Lavare i piatti due volte con acqua (non utilizzare saline fosforato-tamponato (PBS) in quanto i cristalli salini possono bloccare i canali), rimuovere tutto il liquido e lasciarlo asciugare in un ambiente sterile come un armadio per la biosicurezza per 5-10 minuti o fino a La superficie è completamente asciutta.
    Nota: Fare attenzione a garantire che le copertine siano assolutamente asciutte, poiché qualsiasi liquido residuo interferisce con l'adesione dei sistemi microfluidici.
  5. Posizionare i dispositivi microfluidici con i modelli rivolti verso l'alto sotto la luce UV in un ambiente sterile (armadio di biosicurezza) per 10 min. Assicurarsi di seguire le procedure sterili quando si lavora nell'armadio della biosicurezza 10 .
  6. Usando le pinzette mettere un dispositivo microfluidico con il modello rivolto verso il basso in contatto con i coperchi pulitiip / piatto. Utilizzare le pinzette per premere dolcemente il dispositivo in modo che aderisca al vetro.
    Nota: la trasparenza della regione aderente sarà visibile quando si guarda contro la luce. Assicurarsi che tutti gli angoli stiano contattando il vetro. Fai questo a tutti i dispositivi microfluidici. Vedere la Figura 1a .
  7. Per riempire il dispositivo della singola popolazione con il mezzo, puntare la pipetta verso i canali e aggiungere 50 μl di mezzo completo di cellule integrati con B-27 privo di sieri (rapporto di volume 1:50) e 500 μg / mL di penicillina / streptomicina / glutamina Chiamato NBM) al pozzo superiore destro e quindi aggiungere un altro 50 μL al pozzetto che si trova diagonalmente ad esso. Fai questo per tutti i dispositivi, assicurandoti che il mezzo scorre tra pozzetti. Successivamente, aggiungere 50 μL di mezzo ai restanti 2 pozzetti. Vedere la Figura 2a .
    1. Per riempire il dispositivo multiplo di popolazione con il mezzo, puntare la pipetta verso i canali e aggiungere 30 μLDella NBM completa ai pozzetti di destra, fare riferimento alla Figura 6a . Fai questo per tutti i dispositivi, assicurandoti che il mezzo scorre tra pozzetti. Successivamente, aggiungere 50 μL di mezzo ai restanti 4 pozzetti.
  8. Posizionare i dispositivi in ​​una piastra più grande con un piatto aperto con acqua autoclave (camera bagnata) e collocare nell'incubatrice (37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità) per 1-2 h durante la preparazione della coltura cellulare. Vedere la Figura 2b .

2. Neuroni di placcatura nei sistemi microfluidici

  1. Seguendo il protocollo delineato in Rif. 8 , ottenere neuroni ippocampali dissociati o corticali da embrioni di ratto di Sprague Dawley (entrambi i sessi).
  2. Resuspendere i neuroni embrionali in NBM a una concentrazione di 1-2 milioni di neuroni / ml. Verificare le concentrazioni di cellule nel microscopio usando un emocitometro e seguendo il riferimento 8 . Regolare la concentrazione della concentrazione cellulareG alla densità cellulare desiderata. Per aumentare le probabilità di ottenere singoli assi ippocampali per canale, piastra 10.000 neuroni per dispositivo. Per avere più assoni nello stesso canale, inserire 60.000 neuroni per dispositivo.
    Nota: Questi numeri variano in funzione del tipo neuronale utilizzato.
  3. Rimuovere il mezzo dai dispositivi microfluidici senza svuotare i pozzetti. Lasciare circa 5 μL in ciascuno.
  4. Per piastrare le celle nel dispositivo della popolazione singola, aggiungere 50 μL di NBM al pozzo inferiore destro. A questo punto il mezzo scorre da solo per riempire l'altro pozzo inferiore. Aggiungere 20 μL della soluzione di cellule concentrate nel pozzo superiore destro del dispositivo microfluidico, come indicato in figura 1b .
    1. Per piastrare le cellule nel dispositivo multiplo della popolazione aggiungere 20 μL della soluzione di cellule concentrate in ciascuno dei pozzetti di destra nella figura 6a .
  5. Controllare nel microscopio se le celleSono all'interno delle camere e collocano i dispositivi nell'incubatrice per 15-30 minuti per promuovere l'attaccamento cellulare al substrato.
  6. Controllare il microscopio se ci sono celle sufficienti nelle camere. Se sono necessari ulteriori, ripetere i passaggi 2.4 e 2.5.
  7. Aggiungere 50 μL di NBM ai 2 pozzetti superiori del dispositivo di popolazione singola e 20 μL di NBM nello stesso pozzetto in cui le cellule sono state iniettate nel dispositivo multiplo della popolazione. I supporti si sporgono leggermente per formare un menisco positivo, dando ai pozzetti un aspetto superiore della muffin. Ancora una volta, vedere la Figura 2a .
  8. Mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità.

3. Manutenzione delle culture neuronali

  1. Rimuovere NBM (circa 30 μL con una pipetta) dalle cellule e applicare il nuovo NBM preriscaldato il giorno successivo alla loro introduzione ai dispositivi (cioè 1 d dopo il passo 2).
  2. Controllare ogni 2 giorni se c'è sufficiente mezzo in ogni canale. Se il muffin tOp è basso basta aggiungere più medio ai pozzi superiori.
  3. Coltivare le cellule per almeno 7 giorni prima della rimozione dei dispositivi microfluidici. Le cellule possono sopravvivere in questi dispositivi per diverse settimane. Rimuovere i dispositivi 1-2 giorni prima che gli esperimenti siano eseguiti sui campioni.

4. Rimozione dei dispositivi microfluidici

  1. 1 - 2 d prima della rimozione dei dispositivi microfluidici, aggiungere 2 mL di NBM preriscaldati a 37 ° C ad ogni piatto di campione, inondando le camere e mantenere i dispositivi nell'incubatrice.
  2. Utilizzare pinzette sterili e una punta per rimuovere i dispositivi microfluidici dai coperchi lasciando una configurazione di neuroni modellata. Utilizzare la punta per tenere la copertura in posizione e le pinzette per chiudere il bordo del dispositivo nell'angolo inferiore sinistro del pozzetto. Applicare delicatamente la torsione, sollevando il dispositivo con le pinzette in modo da sbucciare la copertura. Vedere la Figura 2c - 2d .
  3. Ogni 2-3 giorni, sostituire l'haSe la NBM finché il campione non viene utilizzato per gli esperimenti.
  4. Prima di eseguire esperimenti di riavvolgimento sul campione, verificare che le neurite nei singoli canali di popolazione e le popolazioni neuronali nel dispositivo multiplo della popolazione siano isolate esaminando le lacune tra di loro nel microscopio per assicurare che non ci siano filamenti che collegano le popolazioni neuronali.

5. Preparazione dei branelli rivestiti in PDL

  1. Aggiungere 2 gocce di 50 μl di branelli in polistirene di 4, 10 o 20 μm diluiti in acqua (1: 500) a 1 ml di PDL (100 μg / ml). Lasciare almeno 2 ore a temperatura ambiente.
    Nota: il protocollo può essere interrotto qui e ripreso il giorno successivo.
  2. Centrifugare la soluzione a 8.820 xg per 1 min. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare le perle accumulate in fondo al contenitore.
  3. Lavare le perle due volte con 1 ml di soluzione sterile 10 mM HEPES pH 8.4.
  4. Resuspendere le perle rivestite con PDL in 200 mL di 10 mM HEPES pH 8.4soluzione.

6. Preparazione delle micropipette

  1. Preparare pipette provenienti da tubi capillari di vetro (diametro interno di 1 mm, diametro esterno di 1,5 mm) utilizzando un estrattore elettrodo orizzontale. Regolare le impostazioni in modo che la punta esterna della micropipetta tirata sia di ~ 2-5 μm. Prima di tirare, assicurarsi che i tubi di vetro siano puliti.
  2. Fissare le pipette alle vetrate di vetro per essere conservate e assicurarsi che la punta non tocchi la superficie dello scivolo poiché la punta è fragile. Conservare a temperatura ambiente in un contenitore coperto per proteggere dalla polvere. Usare pipette nello stesso giorno in cui vengono tirate.

7. Adesione ai Neuroni di PDL-bead

  1. Aggiungere 40-60 μL di branelli rivestiti in PDL preparati nel passaggio 5 ad una coltura cellulare preparata nel passaggio 4. Centrare la punta pipetta sopra i neuroni, che sono debolmente visibili sul coperchio e aggiungere le perle (vedi figura 3 ).
  2. Rimettere il campione all'incubatore per 1 ora per promuovere la formazione dell'occhioContatti naptici 8 , 9 .
  3. Dopo l'incubazione, rimuovere le perle non aderenti lavando delicatamente la coltura con NBM preriscaldata.

8. Preparazione della soluzione fisiologica salina (per esperimenti sulla temperatura ambiente)

  1. Preparare la soluzione salina fisiologica combinando gli ingredienti elencati nei riferimenti 7 , 8 . Questo è per regolare l'ambiente cellulare all'esterno dell'incubatore.
  2. Verificare i livelli di osmolarità e pH come indicato nei riferimenti 7 , 8 .
  3. Continuare a infondere la soluzione con O 2 per ridurre al minimo le fluttuazioni del pH durante lo svolgimento di esperimenti.
  4. Riscaldare a temperatura ambiente.
  5. Impostare il sistema di perfusione inserendo un'estremità di un tubo di plastica (dimensioni opzionali) in soluzione fisiologica iniettata da O 2 e fissando le altreNd ad un ago inserito nel supporto del campione. Mettere il tubo e la soluzione più alti del campione (vedere la Figura 4 ).
    1. Scollegare il tubo dall'ago e collegarlo ad una siringa. Usare la siringa per esercitare pressione e disegnare liquido, riempiendo il tubo. Sigillare con un morsetto a rulli e ricollegare l'ago.

9. Micromanipolazione di perline

  1. Installare il campione in una configurazione sperimentale in modo tale che le celle possano essere accessate dall'alto da due micropipette montate in micromanipulatori e accessibili in modo ottico sotto, ad esempio con l'obiettivo a 40 secondi (apertura numerica di 0,6) di un microscopio ottico invertito. In questa configurazione, montare una telecamera CCD per la cattura delle immagini sulla porta laterale del microscopio. Collegare ogni pipetta a 1 ml di siringhe tramite tubo di plastica. A questo punto, sostituire NBM con soluzione salina fisiologica (1-2 mL) (vedi figura 4 ).
  2. Durante l'esperienza, Continuamente perfusione delle cellule con la soluzione fisiologica salina preparata al punto 8 a una velocità di 0,5-1 ml / min.
  3. Selezionare un PDL-bead NON collegato ad un neurone nel campo visivo. Allineare la perlina con una punta di micropipetta mettendo a fuoco sul tallone quindi fino alla micropipetta. Portare il puntale giù il più vicino possibile al tallone monitorandolo attraverso il microscopio.
  4. Applicare una pressione negativa con la siringa da 1 ml collegata alla pipetta per raccogliere il tallone. Mantenere una pressione negativa per tutto l'esperimento.

10. Tirare i Neuriti

  1. Selezionare un tallone PDL collegato ad un neurone nel campo visivo e collegarlo alla seconda micropipetta usando l'aspirazione come descritto nei passaggi 9.3-9.4.
  2. Tirare il complesso PDL-bead-neuron lentamente (~ 0,5 μm / min) spostando il micromanipolatore o la fase di campionamento di 1 μm e pausa per 5 minuti per consentire l'iniziazione neurita.
  3. Ripetere due volte il passaggio 10.2.
    Nota: i primi 3 &# 181; m deve essere tirato lentamente per garantire il successo sperimentale, che si verifica oltre il 95% del tempo.
  4. Tirare il complesso PDL-bead-neuron lentamente (~ 0,5 μm / min) spostando il micromanipolatore o la fase di campionamento di 2 μm e pausa per 5 minuti per consentire l'allungamento del neurite.
  5. Dopo un inizio di successo e l'estensione del neurite per i primi 5 μm, tirare il neurite a 20 μm / min su distanze di millimetro.
    Nota: l'estrazione può essere eseguita in modo continuo o in gradini ea diverse velocità. Vedere la Figura 5b -5c .

11. Collegamento dei neuroni

  1. Selezionare una regione ricca di neuriti e abbassare il complesso PDL-bead-neurite in modo che lo contatti fisicamente. Utilizzare altre perle per misurare l'altezza del punzone sopra la superficie del coperchio. Vedere la Figura 5d .
  2. Lasciare il complesso PDL-bead-neurite a contatto con il neurite target durante la manipolazione della seconda micropiPette. Abbassare la seconda pipetta con il secondo PDL-bead sulla parte superiore del neurite appena formato, circa 20 μm dal primo bead. Utilizzare il secondo PDL-bead per spingere il nuovo filamento neurite verso la cella di destinazione.
  3. Tenere entrambe le perle in posizione per almeno 1 h. Verificare l'assenza di gonfiore focale, un ispessimento dei neuriti che contattano il tallone, con il microscopio 16 .
  4. Durante questo periodo, utilizzare la perfusione per cambiare lentamente il mezzo del campione da salinità fisiologica a NBM precarbonizzato CO 2- equilibrato.
  5. Rilasciare il tallone dalla seconda pipetta rilasciando l'aspirazione. Se il nuovo neurite rimane attaccato, rilasciare anche il primo tallone. Vedere la Figura 5e .
  6. Rimuovere delicatamente la soluzione salina e sostituire con NBM (~ 2 mL).
  7. Riposizionare con cautela il campione nell'incubatrice per rafforzare la connessione neuronale per i prossimi esperimenti. Questa connessione è stabile per> 24 h 7 .

12. Verifica della funzionalità della nuova connessione mediante le registrazioni delle morsetti di patch a coppie intere

  1. Seguire i riferimenti 7 , 18 , 19 . Per assemblare un set di elettrofisiologia.
  2. Seguire i riferimenti 7 . Per preparare gli elettrodi pre- e postinaptici.
  3. Raccogliere i dati della pinzetta delle patch, ripetutamente seguendo i riferimenti 18 , 19 .
  4. Confronta i risultati con i segnali naturali 7 per determinare il tipo di connessione.

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Risultati

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I neuroni ippocampali del ratto embrionale vengono coltivati ​​in dispositivi microfluidici per consentire un posizionamento preciso di cellule, PDL-perle e micromanipulatori. Il primo passo è quello di montare correttamente il dispositivo microfluidico su una copertura o un piatto di vetro. È essenziale che il dispositivo microfluidico sia ben attaccato al substrato per evitare che le cellule esca dalle camere e che si muovano sotto le parti del dispositivo che dovrebbero essere sigilla...

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Discussione

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Grazie alla micromanipolazione standard e ai dispositivi innovativi microfluidici, è stata sviluppata una nuova tecnica per avviare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a grandi distanze. La micromanipolazione della pipetta è uno strumento comune nella maggior parte dei laboratori neuroscienze 4 , 13 . La vera sfida per ottenere risultati riproducibili e affidabili è stata la standardizzazione di culture neuronali sane e posizio...

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Dichiarazioni

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L'autore Margaret H Magdesian è il CEO di Ananda Devices che produce gli strumenti utilizzati in questo articolo.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare Yoichi Miyahara per molte discussioni e approfondimenti utili. MA e PG riconoscono il finanziamento da NSERC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dispositivi di co-colturaDispositivi Ananda Disponibiliin commercio presso http://www.anandadevices.com
Neuro dispositivi DispositiviDisponibili in commercio presso http://www.anandadevices.com
n. 1 Vetrino coprioggetti rotondo da 25 mmWarner Instruments64-0705
Piatti con fondo in vetro da 35 mm #0, non rivestiti, irradiati con raggi gammaIncorporazione MatTexP35G-0-20-C
Piastra per colture cellulari da 35 mm, non pirogena, sterileCorning Inc430165
Piastra Petri da 95 mm x 15 mm, coperchio scorrevole, polistirene sterileFisherbrandFB0875714G
Provette da centrifuga da 50 mL con graduazioni stampate e tappi piatti VWR89039-656
Provetta conica in polipropilene da 15 mL, modello 17 x 120 mm, non pirogena, falco sterile
Neurobasal MediumLife Technologies21103-049Soluzione extracellulare
Integratore B-27 (50X),Integratore B-27 senza siero (50X), 17504044 senza sieroSoluzione extracellulare
Pennicilina, Streptomiozina, GlutamminaThermo Fisher Scientific 11995-065Soluzione extracellulare
200 μ L PipettatoriVWR89079-458
2 - 20 μ L PipettorsPuntali resistenti agli aerosol2149P
BD Falcon 3mL Pipette di trasferimento [Non sterili]BD Falcon357524
GlucosioGibco15023-021Soluzione extracellulare
HEPESSigma7365-45-9Soluzione extracellulare/Perline
NaClSigma-Aldrich7647-14-5Soluzione
extracellulareKClSigma-Aldrich7447-40-7Soluzione extracellulare
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4Soluzione extracellulare
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3Soluzione extracellulare
#5 Dumont Dumostar Pinzette 11 cmWorld Precision Instruments500233
Strumenti di dissezioneBraun, Aesculap
Po-D-lisina bromidratoSigma-AldrichP6407
Micro particelle a base di polistirene, 10 μ mSigma-Aldrich72986
Tubi in borosilicatoKing Precision Glass, Inc.14696-2
Estrattore di pipette orizzontaleSutter InstrumentsP-97
, serie PCS-5000SD InstrumentsMC7600R
Siringa da 1 mLBD Luer-Lok309628
Microscopio invertitoOlympus IX71
ObiettivoOlympusUIS2, LUCPLFLN 40X
CCDCamera PhotometricsCascade II: 512
Leibovitz's (1x) L-15 MediumLife Technologies11415-064Dissezione di ratto
Typsin-EDTA (0,05%), Phenol redLife Technologies25300054Dissezione
di rattoDMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4,5 g/L D-glucosio, + L-glutammina, + 110 mg/L di piruvato di sodio]Life Technologies11995-065Dissezione di ratto
HBSS (1x) Soluzione salina bilanciata di Hank [- Cloruro di calcio, - Cloruro di magnesio, - SolfatoLife Technologies14170-112Dissezione di ratto
Ananda 352097 Micromanipolatori Brown-Flaming di magnesio]

Riferimenti

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