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Articolo metodologico

Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse

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⸱

DOI:

10.3791/55715

⸱

17 maggio 2017

 , 
1Department of Neuroscience, Uppsala University, 2Department of Organismal Biology, Evolutionary Biology Center, Uppsala University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per isolare e coltivare rudimenti metanufricani da embrioni di topo.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per la dissezione, l'isolamento e la cultura dei rudimenti metanofili del mouse.

Durante lo sviluppo del rene dei mammiferi, i due tessuti progenitrici, il germoglio ureterico e il mesenchim metanufrico, comunicano e reciprocamente inducono meccanismi cellulari per formare eventualmente il sistema di raccolta e i nefroni del rene. Poiché gli embrioni di mammiferi crescono intrauterini e pertanto sono inaccessibili all'osservatore, è stata sviluppata una cultura dell'organo. Con questo metodo è possibile studiare le interazioni epiteliali-mesenchimali e il comportamento cellulare durante l'organogenesi renale. Inoltre, l'origine di malformazioni del rene congenito e delle vie urogenitali può essere studiata. Dopo un'attenta dissezione, i rudimenti metanufricani vengono trasferiti su un filtro che galleggia sul mezzo di coltura e può essere mantenuto in un incubatore di colture di cellule per diversi giorni. Tuttavia, bisogna essere consapevoli che le condizioni sonoArtificiale e potrebbe influenzare il metabolismo nel tessuto. Inoltre, la penetrazione delle sostanze di prova potrebbe essere limitata a causa della matrice extracellulare e della membrana basale presente nell'esplosivo.

Un vantaggio principale della cultura dell'organo è che lo sperimentatore può ottenere l'accesso diretto all'organo. Questa tecnologia è economica, semplice e consente un gran numero di modifiche, come l'aggiunta di sostanze biologicamente attive, lo studio delle varianti genetiche e l'applicazione di tecniche di imaging avanzate.

Introduzione

Il rene dei mammiferi deriva da due strutture primordiali di origine mesodermica: la gemma ureterale epiteliale tubulare e il mesenchima metanefrico. Durante la nefrogenesi, la gemma ureterale invade il mesenchima metanefrico e si ramifica per formare il sistema collettore. Il mesenchima metanefrico dà origine agli elementi epiteliali dei nefroni. Questi processi avvengono in modo temporizzato e spazialmente coordinato e sono avviati da meccanismi induttivi reciproci. Entrambi i componenti del tessuto comunicano e influenzano la morfogenesi cellulare dell'altro.

Negli anni '20, fu Boyden che eseguì l'ostruzione in vivo del dotto mesonefrico nel pollo, fornendo la prima indicazione di interazioni induttive poiché il blastema nefrico separato non riesce a differenziarsi1. All'incirca nello stesso periodo, furono pubblicati i primi tentativi riusciti di coltivare rudimenti di nefriche di pollo in una goccia sospesa. Successivamente, la coltura d'organo è stata sviluppata per studiare le interazioni tissutali nell'organogenesi dei mammiferi. Negli anni '50, Grobstein sviluppò una tecnica in cui i rudimenti metanefrici potevano essere coltivati su un filtro. Questa tecnica è stata modificata da Saxén, che ha posizionato il filtro su uno schermo di tipo Trowell in un piatto di coltura1. Nel corso degli anni sono emerse molte modifiche e applicazioni per la coltura degli organi. Il metodo qui descritto si basa sulla tecnica di Saxén ma è semplificato, poiché i filtri galleggiano liberamente sul terreno e il diametro della coltura supera solo leggermente il diametro del filtro, limitando il movimento indesiderato del filtro.

La coltura dell'intero organo è uno strumento classico, economico e semplice ma potente per studiare i processi cellulari e la comunicazione intercellulare durante l'organogenesi. La coltura d'organo consente il trattamento con agenti biologici, come fattori di crescita, anticorpi, oligonucleotidi antisenso, virus e peptidi, nonché con composti farmaceutici e altre sostanze chimiche. Inoltre, la funzione genica può essere studiata utilizzando espianti derivati da topi geneticamente modificati o utilizzando la tecnologia di inattivazione genica inducibile, come il sistema Cre-loxP. Ciò consente lo studio delle mutazioni genetiche che causano la letalità embrionale prima dello sviluppo del rene. La coltura di organi può anche essere combinata con l'etichettatura fluorescente per la funzione genica o il tracciamento del lignaggio e le moderne tecniche di imaging, che consentono il monitoraggio in tempo reale del comportamento cellulare2.

Nell'esempio specifico qui fornito, è stato studiato l'effetto della segnalazione del recettore Eph attivato da EphrinB2 sulla morfologia ramificata della gemma ureterica. La morfologia dei topi a doppio knockout EphA4/EphB2 suggeriva diversi gravi difetti nello sviluppo renale, che erano rilevabili già dall'11° giorno embrionale (E11) e coinvolgevano la gemma ureterica, l'uretere e il dotto nefrico comune3. La segnalazione tramite i recettori Eph richiede il raggruppamento del dimero ligando-recettore4. Per attivare eccessivamente la segnalazione Eph, i rudimenti renali di embrioni di topo E11.5 sono stati coltivati in presenza di EphrinB2-FC ricombinante raggruppata. EphrinB2 è un noto ligando per il recettore EphA4, che è espresso nelle punte delle gemme ureterali3.

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Protocollo

I topi sono stati mantenuti secondo la normativa svedese e la legislazione dell'Unione europea (2010/63 / UE). Tutte le procedure sono state eseguite seguendo le linee guida del comitato etico svedese (autorizza C79 / 9, C248 / 11 e C135 / 14). Le procedure presso l'Università di Heidelberg che coinvolgono soggetti di origine animale sono stati approvati dal Regierungspräsidium Karlsruhe e dagli Ufficiali di Benessere degli animali presso l'Università di Heidelberg.

1. Preparazione di reagenti e materiali per la cultura

NOTA: utilizzare una cappa a flusso laminare per ridurre al minimo la contaminazione.

  1. Nel giorno della dissezione, pre-cluster Fc umano solo o ricombinante proteina chimerica efrina fusa con Fc umana mescolandola con anticorpi caprini anti-umani Fc a un rapporto molare di 1: 5 in soluzione salina fosfata tamponata sterile (PBS). Incubare per 1 ora a 37 ° C 5 .
  2. Preparare il mezzo di coltura integrando il Modified Eagle Medium di Dulbecco: NutrienteLa miscela F-12 (DMEM / F12) con 1% di penicillina / streptomicina (v / v), 1% di glutammina (v / v), 1% di insulina transferrin-selenio (v / v), 50μg / Transferrin e 1,5 μg / mL di amfotericina.
    NOTA: 10 ml di terreno è sufficiente per 16 embrioni.
  3. Aggiungere una soluzione efrina ricombinata raggruppata a una concentrazione finale di 20 μg / mL al terreno di coltura. Usa Fc umano cluster come controllo.
  4. Preparare le piastre di coltura aggiungendo 500 μl di terreno di coltura a ciascun pozzetto di una piastra a 4 pozzetti in polistirolo sterile e non rivestita.
  5. Utilizzando pinze sterili, posizionare con cura un filtro a membrana in policarbonato con una dimensione di pori di 5 μm per pozzetto in cima al mezzo. Trasferire la piastra preparata all'incubatore (37 ° C / 5% CO 2 ). Assicurarsi che il filtro rimanga asciutto sulla superficie superiore e fluttua.
    NOTA: Un filtro è sufficiente per due anlagen renali.
  6. Usando una lama di rasoio, tagliare circa 30 punte pipetta (volume: 100 μL) approssimativamenteY 1 mm dalla punta per provocare un'ampia apertura. Riposizionare le punte in un rack di pipetta.

2. Dissezione dei Rudiments di Metanephric a E11.5

  1. Sacrificare un mouse in gravidanza a E11.5 con dislocazione cervicale (o utilizzando un metodo approvato dal comitato etico locale).
  2. Rimuovere l'utero e gli embrioni, come descritto da Brown e altri 6 . Da questo punto in avanti, lavorare sotto un microscopio di dissezione.
  3. Usando la pinza da orologeria n. 5, tagliate l'embrione direttamente sotto i piedini anteriori. Usa un piatto di Petri fresco per ogni embrione. Rimuovere le gambe e la coda dell'embrione. Per fare questo, afferrare il tessuto da rimuovere con una coppia di pinze da orologeria n. 5 e utilizzare le punte di una seconda coppia da tagliare.
  4. Per rimuovere la massa degli organi ventrali, utilizzare le punte di una coppia di pinze per aprire lateralmente la parete del corpo dell'embrione in una direzione rostrale-caudale.
    1. Tagliare superficialmente, parallelo a tL'aorta dorsale. Utilizzare l'aorta dorsale piena di sangue e quindi visibile per orientarsi. Separare con cautela la parte ventrale della parete del corpo dalla parte dorsale utilizzando le punte delle pinze chiuse e far girare l'embrione. Tagliare lateralmente la parete del corpo in una direzione rostrale-caudale e utilizzare l'aorta dorsale per l'orientamento, come per il lato precedente.
  5. Una volta che la parete ventrale del corpo è stata separata dal corpo dorsale, afferrarlo con una coppia di pinze e tirare attentamente per rimuoverla insieme alla massa dell'organo.
    NOTA: L'anlagen di metanufricoltura di solito rimane attaccato alla parete del corpo dorsale. Sono strutture ovali, ~ 200 μm situate a livello degli arti posteriori.
  6. Tenere la parete del corpo dorsale con una coppia di pinze, con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Utilizzando l'altra coppia di pinze, afferrare l'aorta dorsale alla sua estremità rostrale e sbucchiare attentamente l'aorta dorsale dalla parete del corpo dorsale.
    NOTA: entrambi i reni metanfricari di solito rimangono attaccatiL'aorta dorsale.
  7. Usando una coppia di pinze, tagliare rostrally al rene anlagen per rimuovere l'aorta. Quindi, separare con attenzione i due anlagen renali utilizzando le punte delle pinze.
  8. Scorri con cautela il tessuto indesiderato dal rene anlagen usando le punte delle pinze. Fare attenzione a non danneggiare il mesenchima, in quanto i danni possono provocare una scarsa crescita ed escludere l'esplante dall'ulteriore analisi.
  9. Trasferire separatamente il rene anlagen usando una pipetta di microlitro e una punta di pipetta ampiamente aperta in 10 μL di PBS al filtro a membrana in policarbonato in una piastra a 4 pozzetti.
    NOTA: a causa della tensione superficiale, l'esplante sarà coperto con uno strato sottile di media. Un filtro è sufficiente per due anlagen renale.
    1. Posizionare ciascuno dei due anlagen al centro di ciascuna rispettiva metà del filtro. Trasferire la piastra all'incubatore a 37 ° C / 5% CO 2 . Lasciare la piastra nell'incubatrice finché non si avvicina il metanufricoLe imitazioni dell'embrione successivo sono pronte per essere poste sul filtro.
  10. Ripetere i passaggi 2.3-2.9.1 per ogni embrione.
    NOTA: con una certa pratica, la procedura di dissezione richiederà circa 5 minuti per embrione.
  11. Incubare il rene anlagen per 3 giorni a 37 ° C / 5% CO 2 .

3. Preparazione dei reagenti per la fissazione e la colorazione

  1. Per preparare 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS senza calcio e magnesio (p / v), sciogliere il PFA a 60 ° C in PBS, continuando a mescolare. Riscaldare a temperatura ambiente e utilizzare un filtro di carta per rimuovere le particelle rimanenti. Aliquota e conservare a 4 ° C per uso immediato o congelare per l'immagazzinamento a lungo termine.
    ATTENZIONE: PFA è tossico. Indossare l'attrezzatura di protezione individuale specificata negli standard locali di sicurezza e lavorare in una cappa di fumo. Scartare i rifiuti seguendo le linee guida istituzionali e utilizzare contenitori di rifiuti designati.
  2. Per preparare la soluzione di permeabilizzazione, diluire Triton X-100In PBS senza calcio e magnesio allo 0,3% (v / v).
  3. Per preparare la soluzione di blocco, aggiungere il siero di capra del 5% (v / v) e lo 0,1% di Triton X-100 a PBS senza calcio e magnesio. Aggiungere azidi di sodio ad una concentrazione finale di 0,02% (w / v). Conservare a 4 ° C.
    ATTENZIONE: l'azido di sodio è tossico. Maneggiare l'azide di sodio in conformità alle normative locali in materia di sicurezza e ambiente.
    NOTA: quando si utilizzano anticorpi per la colorazione, utilizzare il siero del 5% della specie che è stato derivato dall'anticorpo secondario per realizzare una soluzione di blocco.
  4. Diluire l'agglutinina Dolichorus biflorus biotinilata 1: 200 in soluzione di blocco. Diluire streptavidina coniugata Alexa488 1: 200 in soluzione di blocco.
  5. Per ottenere il mezzo di incisione pronto per l'uso (vedere la tabella dei materiali), aggiungere 0,1 g di glicerolo al 25% (w / v) in 0,1 m di Tris-HCl (pH 8,5) . Riscaldare a 50 ° C sotto agitazione continua per 1 h, raffreddare e regolare il pH a 8.0-8.5 usando 1M NaOH. Evitare concentrazioni più elevate di NaOH. Aggiungere 100 μg / mL N-propilgallato e timerosale ad una concentrazione finale di 0,02% (w / v). Mescolare per 30 minuti a temperatura ambiente.
    ATTENZIONE: Thimerosal è tossico. Maneggiarlo conformemente alle normative locali in materia di sicurezza e ambiente.
    1. Riempire il supporto di incorporazione in tubi da 50 ml, bilanciare il rotore e centrifugare a 3.200 xg e la temperatura ambiente per 10 min. Decantare la soluzione chiara in 15 mL tubi e scartare il pellet. Aliquota e conservare a -20 ° C per diverse settimane. Una volta scongelata, mantenere la soluzione a 4 ° C. Riscaldare a ~ 30 ° C immediatamente prima dell'uso.
  6. Preparare il maggior numero di diapositive in vetro come filtri con esplanti. Per questo, incollare due piccole copertine, 18 x 18 mm, su entrambi i lati del vetrino con l'adesivo istantaneo, lasciare uno spazio di circa 15 mm per il filtro.

4. Fissazione e colorazione

  1. Dopo un periodo di coltura di 3Giorni in vitro (div), togliere le piastre dall'incubatore e aspirare attentamente il mezzo di coltura da ciascun pozzetto utilizzando una micropipetta. Assicurarsi di non toccare il filtro e mantenerla aperta verso la parete del pozzetto.
  2. Aggiungere 500 μl di 4% di PFA / PBS a ciascun pozzetto. I filtri galleggiano sul fissativo. Utilizzando una micropipetta, aggiungete con cautela il fissativo PFA per sottomettere i filtri. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
    NOTA: Per tutte le fasi successive, occorre prestare attenzione a non lavare le esplosioni dal filtro. Tenere l'apertura della punta della pipetta verso la parete del pozzetto.
  3. Rimuovere il PFA e risciacquare due volte con 500 μl di PBS, sommersando il filtro. Aggiungere a ciascun pozzetto 500 μL di soluzione di permeabilizzazione e incubare a temperatura ambiente per 1 h.
  4. Sciacquare due volte con 500 μl di PBS e aggiungere a ciascun pozzetto 500 μL di soluzione di blocco. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Sostituire la soluzione di blocco con250 μl di agglutinina biflorus biotinilata Dolichorus diluita 1: 200 in soluzione di blocco e incubare a 4 ° C per 24 ore.
  6. Rimuovere la soluzione di agglutinina Doliforum biflorus e risciacquare due volte con 500 μL di PBS per pozzetto.
  7. Aggiungere 250 μL di streptavidina coniugata con Alexa488, diluita 1: 200 in soluzione di blocco e incubare a 4 ° C per 24 ore. In alternativa, incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
    NOTA: si ottiene un migliore rapporto segnale-rumore quando incubato a 4 ° C.
  8. Sciacquare due volte con 500 μl di PBS per pozzetto. Utilizzando la pinza, trasferire i filtri sulle vetrate preparate, con gli esplanti rivolti verso l'alto. Montare con ~ 50-100 μL di supporto incorporante. Copertura con coperchio da 1,5 mm di lunghezza da 60 mm. Lasciare che la soluzione di media incorporante si solidifichi per 2 ore a temperatura ambiente al buio. Procedere all'immagine o conservare le diapositive, avvolte in fogli, a 4 ° C fino a quando non sarà pronto per l'immagine.
  9. Immagine con un ampio campo di epifluorescenza microscopio 7 </ Sup> accoppiato ad una lampada Hg e utilizzare una unità a specchio per eccitazione blu (banda di eccitazione, 460 - 495 nm, specchio bicromato, 505 nm e banda di emissione, 510 - 550 nm) e 20x Plan-Apochromat lenti, 0,75 numeri apertura.

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Risultati

L'anlagen renale metanico è stato derivati ​​da topi in gravidanza Black-6 in E11.5 e sono stati coltivati. Dopo 3 giorni, il germoglio ureterico era ramificato fino a 5 volte, con conseguente ramificazione del germoglio uretrico inizialmente a forma di T. Ogni esplante è stato fotografato e il numero di segmenti e endpoint è stato quantificato per determinare le generazioni di ramificazione e per calcolare il numero di endpoint per ramo ( Figura 1 ). ImageJ (generaz...

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Discussione

Questo manoscritto descrive un metodo per isolare l'anlagen metanofrico in sviluppo dall'embrione del topo e per coltivare i rudimenti degli organi. Questo metodo è una tecnica standard, come sviluppato da Grobstein 8 e Saxén 9 , 10 ed è stato adattato e modificato da molti altri 11 , 12 . Il successo del metodo dipende principalmente dalla durata della dissezione, in quan...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Leif Oxburgh e Derek Adams per aver generosamente condiviso la loro conoscenza, Leif Oxburgh per i commenti utili sul manoscritto e Stefan Wölfl e Ulrike Müller per il loro sostegno tecnico e per Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer e Viola Mayer laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto da Development, The Company of Biologists (a CP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21331020
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140148
Integratore GlutaMAX ThermoFisher Scientific 35050061
DPBS, calcio, magnesioThermo Fisher Scientific14040117uso per la dissezione
olo-transferrina umanaSigma-AldrichT0665
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100x)Thermo Fisher Scientific41400045
ParaformaldeideSigma-Aldrich158127
Soluzione di amfotericina BSigma-AldrichA2942
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Aziduro di sodioSigma-AldrichS8032
ThimerosalSigma-AldrichT5125
Gallato di propileSigma-Aldrich2370
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381
GliceroloSigma-AldrichG5516
Biotinilato Dolichorus Biflorus AgglutininVector LaboratoriesB-1035
Alexa488 coniugata streptavidinaJackson Immuno Research016-540-084
proteina ricombinante della chimera di topo Ephrin-B2 Fc, CFR& D Systems496-EB
IgG1 umano ricombinante, FCR& D Systems110-HG-100
Capra Anti-IgG Fc Anticorpo R& D SystemsG-102-C
Compresse saline tamponate con fosfatoSigma-AldrichP4417uso per la fissazione e l'immunocolorazione
Dumont #5, punte biologie
, INOX, 11 cm		agnthos.se0208-5-PSSono necessarie 2 paia di pinze
Forbici per iris, dritte, 12 cmagnthos.se03-320-120
Pinze per medicazione,
diritte, delicate, 13 cm		agnthos.se08-032-130
Piastre Petri Nunclo Delta trattateThermo Fisher Scientific150679
TMTP01300 Filtro a membrana isopore, policarbonato, Idrofilo, 5.0 &; m, 13 mm, bianco, liscioMerckMilliporeTMTP01300
Nunclon Multipiatti
4 pozzetti, fondo piatto		Sigma-AldrichD6789-1CS
Vetro di copertura del microscopio 24 x 50 mm di spessore. No.1.5H 0.17+/-0.005 mmnordicbiolabs107222
Occhiali di copertura No.1.5, 18 mm x 18 mmnordicbiolabs102032
Vetrini ~76 x 26 x 1, 1/2-w. macinato liscionordicbiolabs1030418
VWR Lame di rasoioVWR VWR55411-055
Provette da centrifuga da 50 mlSigma-AldrichCLS430828
15 mLSigma-Aldrich
Whatman, grado 113V, crespataSigma-AldrichWHA1213125
Mircoscopio da ricerca a stadio fissoOlympusBX61WI
Black 6 topi consanguinei, maschio, C57BL/6NTacTaconicB6-M
Black 6 topi consanguinei, femmina, C57BL/6NTacTaconicB6-F
Greenough StereomicroscopioLeicaLeica S6 E
Carta da filtro qualitativa prepletata CLS430055

Riferimenti

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  7. Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
  8. Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
  9. Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
  10. Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
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