Questo protocollo descrive un metodo per isolare e coltivare rudimenti metanufricani da embrioni di topo.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per la dissezione, l'isolamento e la cultura dei rudimenti metanofili del mouse.
Durante lo sviluppo del rene dei mammiferi, i due tessuti progenitrici, il germoglio ureterico e il mesenchim metanufrico, comunicano e reciprocamente inducono meccanismi cellulari per formare eventualmente il sistema di raccolta e i nefroni del rene. Poiché gli embrioni di mammiferi crescono intrauterini e pertanto sono inaccessibili all'osservatore, è stata sviluppata una cultura dell'organo. Con questo metodo è possibile studiare le interazioni epiteliali-mesenchimali e il comportamento cellulare durante l'organogenesi renale. Inoltre, l'origine di malformazioni del rene congenito e delle vie urogenitali può essere studiata. Dopo un'attenta dissezione, i rudimenti metanufricani vengono trasferiti su un filtro che galleggia sul mezzo di coltura e può essere mantenuto in un incubatore di colture di cellule per diversi giorni. Tuttavia, bisogna essere consapevoli che le condizioni sonoArtificiale e potrebbe influenzare il metabolismo nel tessuto. Inoltre, la penetrazione delle sostanze di prova potrebbe essere limitata a causa della matrice extracellulare e della membrana basale presente nell'esplosivo.
Un vantaggio principale della cultura dell'organo è che lo sperimentatore può ottenere l'accesso diretto all'organo. Questa tecnologia è economica, semplice e consente un gran numero di modifiche, come l'aggiunta di sostanze biologicamente attive, lo studio delle varianti genetiche e l'applicazione di tecniche di imaging avanzate.
Introduzione
Il rene dei mammiferi deriva da due strutture primordiali di origine mesodermica: la gemma ureterale epiteliale tubulare e il mesenchima metanefrico. Durante la nefrogenesi, la gemma ureterale invade il mesenchima metanefrico e si ramifica per formare il sistema collettore. Il mesenchima metanefrico dà origine agli elementi epiteliali dei nefroni. Questi processi avvengono in modo temporizzato e spazialmente coordinato e sono avviati da meccanismi induttivi reciproci. Entrambi i componenti del tessuto comunicano e influenzano la morfogenesi cellulare dell'altro.
Negli anni '20, fu Boyden che eseguì l'ostruzione in vivo del dotto m....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I topi sono stati mantenuti secondo la normativa svedese e la legislazione dell'Unione europea (2010/63 / UE). Tutte le procedure sono state eseguite seguendo le linee guida del comitato etico svedese (autorizza C79 / 9, C248 / 11 e C135 / 14). Le procedure presso l'Università di Heidelberg che coinvolgono soggetti di origine animale sono stati approvati dal Regierungspräsidium Karlsruhe e dagli Ufficiali di Benessere degli animali presso l'Università di Heidelberg.
1. Preparazione di reagenti e materiali per la cultura
NOTA: utilizzare una cappa a flusso laminare per ridurre al minimo la contaminazi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'anlagen renale metanico è stato derivati da topi in gravidanza Black-6 in E11.5 e sono stati coltivati. Dopo 3 giorni, il germoglio ureterico era ramificato fino a 5 volte, con conseguente ramificazione del germoglio uretrico inizialmente a forma di T. Ogni esplante è stato fotografato e il numero di segmenti e endpoint è stato quantificato per determinare le generazioni di ramificazione e per calcolare il numero di endpoint per ramo ( Figura 1 ). ImageJ (generaz.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo manoscritto descrive un metodo per isolare l'anlagen metanofrico in sviluppo dall'embrione del topo e per coltivare i rudimenti degli organi. Questo metodo è una tecnica standard, come sviluppato da Grobstein 8 e Saxén 9 , 10 ed è stato adattato e modificato da molti altri 11 , 12 . Il successo del metodo dipende principalmente dalla durata della dissezione, in quan.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Leif Oxburgh e Derek Adams per aver generosamente condiviso la loro conoscenza, Leif Oxburgh per i commenti utili sul manoscritto e Stefan Wölfl e Ulrike Müller per il loro sostegno tecnico e per Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer e Viola Mayer laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto da Development, The Company of Biologists (a CP).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| Integratore GlutaMAX Thermo | Fisher Scientific 35050061 | ||
| DPBS, calcio, magnesio | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | uso per la dissezione |
| olo-transferrina umana | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Soluzione di amfotericina B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Aziduro di sodio | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Gallato di propile | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinilato Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 coniugata streptavidina | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| proteina ricombinante della chimera di topo Ephrin-B2 Fc, CF | R& D Systems | 496-EB | |
| IgG1 umano ricombinante, FC | R& D Systems | 110-HG-100 | |
| Capra Anti-IgG Fc Anticorpo R | & D Systems | G-102-C | |
| Compresse saline tamponate con fosfato | Sigma-Aldrich | P4417 | uso per la fissazione e l'immunocolorazione |
| Dumont #5, punte biologie , INOX, 11 cm | agnthos.se | 0208-5-PS | Sono necessarie 2 paia di pinze |
| Forbici per iris, dritte, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Pinze per medicazione, diritte, delicate, 13 cm | agnthos.se | 08-032-130 | |
| Piastre Petri Nunclo Delta trattate | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Filtro a membrana isopore, policarbonato, Idrofilo, 5.0 &; m, 13 mm, bianco, liscio | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multipiatti 4 pozzetti, fondo piatto | Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Vetro di copertura del microscopio 24 x 50 mm di spessore. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Occhiali di copertura No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Vetrini ~76 x 26 x 1, 1/2-w. macinato liscio | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Lame di rasoio | VWR VWR | 55411-055 | |
| Provette da centrifuga da 50 ml | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL | Sigma-Aldrich | ||
| Whatman, grado 113V, crespata | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Mircoscopio da ricerca a stadio fisso | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 topi consanguinei, maschio, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 topi consanguinei, femmina, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereomicroscopio | Leica | Leica S6 E |
Riferimenti
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
- Peuckert, C., ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
