Test di riconoscimento di oggetto romanzo per l'indagine di apprendimento e memoria in topi

Il test di riconoscimento di oggetto (ORT), anche conosciuto come il test di riconoscimento oggetto romanzo (NOR), è un mezzo relativamente veloce ed efficiente per il testing di diverse fasi di apprendimento e memoria in topi. Fu originariamente descritto da Ennaceur e Delacour nel 1988 e utilizzato principalmente in ratti¹; Tuttavia, da allora, è stato adattato con successo per uso in topi^2,3,4,5,6,7. Il test si basa su da un minimo di tre sessioni: sessione di una assuefazione, un allenamento e test di una sessione. Formazione comporta semplicemente l'esplorazione visiva di due oggetti identici, mentre la sessione di test consiste nel sostituire uno degli oggetti precedentemente esplorati con un oggetto romanzo. Perché roditori hanno un'innata preferenza per novità, un roditore che ricorda l'oggetto familiare permetterà di trascorrere più tempo esplorando il romanzo oggetto^7,8,9.

Il vantaggio principale di ORT su altri test di memoria roditore è che si basa sulla propensione naturale dei roditori per esplorare novità⁸. Di conseguenza, non c'è nessuna necessità di numerose sessioni di formazione o di qualsiasi rinforzo positivo o negativo per motivare il comportamento. Ciò significa che l'ORT è molto meno stressante rispetto altri test^{10,11,12,13,14,15}e richiede significativamente meno tempo per l'esecuzione di altri comunemente utilizzati memoria test, come il labirinto di Morris acqua o labirinto di Barnes, che entrambi possa richiedere fino a una settimana o più. Di conseguenza, le condizioni di ORT maggiormente assomigliano a quelle utilizzate per studiare la cognizione umana, aumentando la validità ecologica della prova sopra molti altri test di memoria del roditore. Allo stesso modo, perché ORT è un compito semplice richiamo visivo, è stato adattato con successo per l'utilizzo in numerose specie, tra cui gli esseri umani e primati non umani, per valutare diversi aspetti inter-specie di memoria dichiarativa ^{2,16 ,17}. Infine, l'ORT può essere facilmente modificata per esaminare le diverse fasi di apprendimento e memoria (cioè, acquisizione, consolidamento o richiamo), per valutare diversi tipi di memoria (ad es., memoria spaziale), o per valutare la conservazione diversi intervalli (cioè, memoria a lungo termine vs a breve termine).

La versatilità di ORT fornisce una piattaforma per applicazioni di ricerca innumerevoli. Gli studi possono fare uso di agenti farmacologici per disturbare o migliorare la memoria. Variando il tempo di somministrazione del farmaco prima o dopo l'allenamento o prima del test può alludere a neurali sottostanti meccanismi che inducono interrotto o enhanced memoria^{6,18,19, 20}. in un modo simile, optogenetica tecnologia può essere usato anche questi stesso vari intervalli di tempo a guardare l'attivazione/inibizione neurale che contribuisce alle diverse fasi di apprendimento e memoria. L'ORT è anche appropriato per valutare le differenze negli animali transgenici, in studi di lesione, o nei modelli neurodegenerative o nell'invecchiamento studi^{21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28}. il tempo tra allenamento e test, conosciuto come l'intervallo di mantenimento, può essere modificato per valutare una di queste modifiche sul breve e lungo termine memoria²⁶. In definitiva, l'ORT può essere utilizzato come strumento per studiare i cambiamenti farmacologici, genetici e neurologici per apprendimento e memoria, o questi strumenti possono essere utilizzati per studiare la base di apprendimento e memoria in ORT.

tutte le procedure eseguite qui sono stati sottoposti a e approvato da Animal Care e utilizzare Comitato e sono stati condotti seguendo linee guida NIH.

1. selezione degli oggetti e messa a punto sperimentale

1. selezionare gli oggetti che sono abbastanza differenti da essere facilmente discriminati dai topi, ma hanno un simile grado di complessità (struttura, forma, campitura di colore e luminosità, ecc.) al fine di minimizzare qualsiasi potenziale indotto preferenza di oggetto che può influenzare i risultati (Vedi Ennaceur 2010 per una descrizione completa dell'oggetto scelta ⁷).
   1. Test per preferenza innata e discriminazione (vedere i passaggi 2 & 3).
   2. Gli oggetti di uso del mouse di dimensioni medie o solo leggermente più grande per incoraggiare l'esplorazione ( Figura 1). Per ridurre la preferenza indotta, garantire che i topi sono in grado di salire su entrambi gli oggetti o nessuno dei due oggetti, anche se la capacità di arrampicarsi su un oggetto può aumentare l'interesse per l'esplorazione (tempo trascorso seduto solo su un oggetto non viene conteggiato verso il tempo di esplorazione).
   3. Avere almeno 2 copie di ogni oggetto. Tuttavia, per ridurre al minimo possibili spunti di odore durante il test, avere almeno 3 di ogni oggetto, duplicati per formazione e uno per il test.
   4. Utilizzare oggetti in materiale non-fragile, come perdita di un oggetto causa di danni durante la sperimentazione potrebbero interferire con la continuità di test e potenzialmente causare danni o lesioni agli animali.
   5. Pulire accuratamente gli oggetti prima e tra uso (70% vol/vol di etanolo è appropriato).
2. Per ridurre al minimo lo stress di illuminazione luminosa, utilizzare illuminazione diffusa, bassa, con il centro del labirinto illuminato circa 20 lux. Utilizzare una temperatura e l'umidità simile a condizioni abitative regolari. Se topi vengono spostati da una camera di alloggiamento in un'altra camera per l'esperimento, acclimatare topi in loro nuova camera per almeno 1 h prima dell'uso ogni giorno.
3. Maniglia topi ben prima dell'allenamento. Perché il test si basa sulla tendenza naturale dei roditori per esplorare novità, ridurre qualsiasi stress o ansia da manipolazione che può interferire con il loro desiderio di esplorare l'arena e, successivamente, gli oggetti. Idealmente, gestire topi 1 - 2 volte al giorno per almeno 1 min, 1 o 2 settimane prima della prova ^{15 , 29}.
4. Per l'arena principale, utilizzare una camera quadrata (circa 40 x 40 cm x 40 cm) effettuata in bianco o nero, plastica non porosa, in contrasto con il colore del mouse. In alternativa, utilizzare un rotondo arena ed. in particolare, quando si utilizzano topi ansiosi che possono sedersi negli angoli di un quadrato arena, un'arena circolare può essere preferibile per incoraggiare il comportamento esplorativo ^{18 , 30}.
   1. Il giorno di allenamento, posto 2 oggetti identici sulla diagonale (cioè uno nell'angolo NW e uno nell'angolo SE). Se gli oggetti sono troppo leggeri e possono essere spostati con il mouse, fissarli al pavimento. Rimovibile mastice opere di montaggio ben.
   2. Giorno di test, utilizzare la copia di 3 ^rd di ogni oggetto per inserire un oggetto familiare e un oggetto romanzo sulla stessa diagonale come la giornata di formazione ( Figura 2).
   3. Controbilanciare l'uso di ogni set di oggetti in modo che ogni oggetto è usato ugualmente come un oggetto familiare e come oggetto romanzo. Inoltre, controbilanciare la posizione dell'oggetto romanzo a ciascuno dei 4 angoli dell'arena. Assicuratevi di annotare quale diagonale viene utilizzato per quale animale affinché la diagonale utilizzata il giorno di allenamento è lo stesso di quello utilizzato sulla giornata di test, per ogni mouse.
   4. Pulire accuratamente l'apparecchio e gli oggetti da rimuovere spunti odore prima e tra uso (70% vol/vol di etanolo è appropriato).
5. Posizionare la fotocamera direttamente overhead dell'apparato per visione ottimale di esplorazione. Utilizzare solo software con rilevamento del punto del naso per analisi accurate. Se utilizza un software, catturare un'immagine di sfondo con gli oggetti nel posto prima di iniziare. Nel software, impostare l'area di esplorazione per essere circa 2-3 cm intorno all'oggetto.
6. Per ridurre l'interferenza di sperimentatore, registrare la versione di prova e il punteggio e più tardi. Cieco il marcatore delle condizioni sperimentali. Se manualmente segnando durante l'esperimento, verificare che lo sperimentatore è più di 1 metro dall'arena e non è visibile al mouse.
   Nota: Qualsiasi momento il mouse passa seduto sull'oggetto senza attivi vibrisse spazzare o sniffing non conta come tempo di esplorazione.
Esplorazione di
7. definire come quando il mouse ' s rumore è puntato verso l'oggetto e circa 2-3 cm dell'oggetto, con attivi vibrisse spazzare o lo sniffing. Non contano ogni volta che si siede sull'oggetto senza indicazione di esplorazione attiva.

2. Necessari esperimenti pilota

1. Testing per preferenza indotta
   1. per assuefazione, rimuovere il mouse dalla sua gabbia a casa e collocarlo al centro dell'arena aperta. Consentire il mouse per esplorare liberamente per 5 min.
   2. Su Training Day (T1), posto 2 oggetti diversi in quadranti opposti del apparato, (cioè, NW e SE angoli). Rimuovere il mouse dalla sua gabbia a casa e collocarlo al centro dell'arena aperta. Consentire l'esplorazione libera per 10 min.
   3. Calcolare l'indice di discriminazione. Se non c'è nessuna preferenza indotta, l'indice di discriminazione deve essere uguale o vicino a zero. Tutti gli oggetti che mostrano la preferenza non devono essere utilizzati per ORT.
2. Test per la capacità di discriminazione
   1. per assuefazione, rimuovere il mouse dalla sua gabbia casa e collocarlo al centro dell'arena aperta. Consentire il mouse per esplorare liberamente per 5 min.
   2. Sulla sessione di allenamento (T1), posto 2 oggetti identici nei quadranti opposti. Posizionare il mouse al centro dell'arena e consentire il mouse per esplorare per 10 min.
   3. Su test sessione (T2), posto uno dell'oggetto utilizzato durante T1 e un oggetto romanzo nei quadranti opposti (cioè, NW e SE angoli). Sessanta minuti dopo T1, posizionare il mouse al centro dell'arena e consentire la libera esplorazione per 10 min.
   4. Calcolare l'indice di discriminazione. A un intervallo di ritenzione di 60 min, l'indice di discriminazione deve superare 0,25.

3. Procedura sperimentale

1. assuefazione
   1. rimuovere il mouse dalla sua gabbia a casa e collocarlo al centro dell'arena aperta, vuota. Consentire la libera esplorazione dell'arena per 5 min. Una volta che la gabbia a casa è vuota, è possibile salvarlo per uso come una gabbia di detenzione il giorno successivo.
   2. Alla fine di 5 min, rimuovere il mouse e mettere in una gabbia di detenzione. Non restituire il mouse alla sua gabbia originale, o questo può influenzare il comportamento dei topi restanti da sottoporre a.
   3. Pulire accuratamente l'apparecchio tra topi utilizzando etanolo al 70% vol/vol.
      Nota: Durante l'assuefazione, comportamento del tipo di ansia può essere valutato calcolando il tempo trascorso nel centro (vedere Prut & Belzung 2003 ³¹). Si tratta di una metrica utile quando si considera la lunghezza del tempo per T1. Superiori topi di ansia possono richiedere una sessione di 10 minuti per raggiungere il criterio minimo esplorazione.
2. Training (T1)
   1. posizionare due oggetti identici nei quadranti opposti dell'arena (cioè, angolo nord-est e angolo SW).
   2. 24 h dopo l'assuefazione, rimuovere il mouse dalla sua gabbia a casa e collocarlo al centro dell'arena, equidistante dagli oggetti identici 2.
   3. Consenti esplorazione libera per un minimo di 5 min. Se si utilizza un ceppo di topi che sono noti per avere bassa attività dell'apparato locomotore o esplorazione, (cioè, maggior parte dei topi non si raggiunge un minimo di 20 esplorazione di s di entrambi gli oggetti di 5 min, come osservato in esperimenti pilota o la letteratura), estendere la prova a 10 min per tutti i mic e nella coorte.
   4. Alla fine della prova, rimuovere il mouse e posizionare nella gabbia della holding. Una volta che la gabbia a casa è vuota, è possibile salvarlo per uso come la gabbia di detenzione sulla prova giorno.
   5. Pulire accuratamente l'apparecchio e oggetti tra topi utilizzando etanolo al 70% vol/vol.
3. Testing (T2)
   1. inserire un oggetto utilizzato durante T1 (cioè, l'oggetto familiare) e un romanzo oggetto nei quadranti opposti dell'arena. Utilizzare le stesse posizioni come usato durante T1 per ogni mouse.
   2. Presso il T1 a T2 intervallo di scelta, rimuovere il mouse dalla sua gabbia casa e posizionarlo nell'arena centro, equidistante da oggetto familiare e il romanzo.
      Nota: Un intervallo di ritenzione di 24h, maggior parte dei topi non sarà in grado di discriminare tra l'oggetto familiare e romanzo (solitamente -0,2 < d2 < 0,2, rispetto ad un positivo controllo ³²). Se il test per gli effetti nootropic, utilizzare questo punto di tempo per sondare per miglioramento della memoria. Per sondare per i deficit di memoria, utilizzare un intervallo più breve di ritenzione di ovunque tra 20 min a 4 ore, a seconda del ceppo di mouse.
   3. Consenti esplorazione libera per 10 min. Alla fine della prova, rimuovere il mouse e posizionare nella gabbia detenzione.
4. Sia per T1 che per T2, Punteggio ottenuto i primi 5 min. Se il mouse non soddisfa il tempo minimo di esplorazione di 20 s per entrambi gli oggetti, continuare segnando passato 5 min fino a quando l'esplorazione totale supera 20 s.

4. Analisi dei dati

1. Criteri di esclusione
   1. durante entrambi training (T1) e test (T2), calcolare il tempo di esplorazione totale per entrambi gli oggetti per ogni sessione (e1 ed e2). Maggior parte dei mouse dovrebbe raggiungere una minima esplorazione totale per entrambi gli oggetti di 20 s da 5 min.
   2. Tempo estendere T1 e T2 per 10 min per ceppi di topi che hanno basso esplorazione e non soddisfano questo criterio minimo di 5 min, come osservato durante i test pilota.
   3. Punteggio ottenuto comportamento per 5 minuti o oltre 5 min fino a raggiungere il criterio minimo di 20 s.
   4. Se i topi non si raggiungono un minimo di 20 s di esplorazione per entrambi gli oggetti per T1 o T2 a 10 min, escludere dall'analisi, come non può essere confermata hanno trascorso abbastanza tempo ad esplorare per imparare/discriminare.
2. Vs assoluta relativa analisi
   Nota: formule diverse per l'analisi e la loro relazione reciproca possono essere visto nella tabella 1. E1
   1. Calcola il tempo totale esplorazione durante l'allenamento di 2 oggetti identici, dove a1 e a2 sono gli oggetti identici quanto.
      e1 = a1 + a2
   E2
   2. Calcola il tempo totale esplorazione durante il test per l'oggetto familiare (a) e il romanzo di oggetti (b).
      e2 = a + b
   Oggetto
   3. d1 calcola semplicemente come il tempo trascorso ad esplorare il romanzo meno tempo trascorso ad esplorare l'oggetto familiare. La misura assoluta di discriminazione (d1) non tiene conto delle differenze nel tempo di esplorazione tra topi o trattamento gruppi, anche se in determinate circostanze, può essere una misura più sensibile ².
      d1 = b-a
   4. Calcolare d2 come il tempo trascorso ad esplorare il romanzo oggetto meno il tempo trascorso ad esplorare l'oggetto familiare diviso per tempo di esplorazione totale. La misura più comunemente usata è un valore di discriminazione relativa spesso indicato come l'indice di discriminazione (d2), che non è influenzata da differenze nei tempi di esplorazione. Ciò significa che tutti i valori cadono tra -1 e + 1.
      d2 = d1/e2
   5. In alternativa, calcolare il riconoscimento o preferenza indice (d3) ³. Questo è il tempo trascorso ad esplorare l'oggetto romanzo diviso il tempo totale. Ciò significa che tutti i valori cadrà tra 0 e 1. Spesso è moltiplicato per 100 e utilizzato come valore percentuale.
      d3 = b/e2 * 100
3. Analisi statistica
   1. utilizzando i valori di discriminazione medio per ogni gruppo, determinare le prestazioni della memoria usando il One-way ANOVA. Per ulteriori analisi, fare paragoni bidirezionale post hoc, con i gruppi di controllo positivo/negativo e la condizione del veicolo trattati vs.

Un setup sperimentale generale per l'ORT è illustrato nella Figura 2. Il assuefazione topi giorno (T0) sono collocati nell'arena vuota per 5 min, venti-quattro ore più tardi, i topi sono collocati indietro nella camera con 2 oggetti identici e ha permesso di esplorare liberamente per fino a 10 min (T1). Sulla prova giorno (T2), i topi vengono nuovamente inseriti nell'arena, ma con un oggetto familiare e un oggetto romanzo e ha permesso di esplorare per fino a 10 min. L'intervallo di mantenimento, il tempo tra T1 e T2, può essere modificato, a seconda gli obiettivi finali dell'esperimento. Nei dati rappresentativi, poiché gli inibitori sono previste per migliorare la memoria, i topi sono testati 24h dopo T1, un tempo nel quale veicolo topi trattati non dovrebbero mostrare alcuna discriminazione.

Inibitori della fosfodiesterasi 2 sono stati indicati per migliorare l'apprendimento e memoria in ORT. Rispetto al veicolo, la somministrazione di inibitori di PDE2 Bay 60-7550 o ND7001 migliorato significativamente la memoria in maniera dose-dipendente, quando somministrato 30 minuti prima dell'allenamento (T1)6 (figure 3a e 3b). Quando somministrato a intervalli di tempo diversi rispetto al training e il testing, l'inibitore di PDE2 Bay 60-7550 migliora significativamente la memoria quando somministrato 30 minuti prima dell'allenamento, subito dopo l'allenamento e 30 min prima del richiamo (figure 4a e 4b ). Ciò suggerisce che l'inibizione di PDE2 migliora la memoria durante acquisizione o primi meccanismi di consolidamento e di richiamo6. I topi utilizzati in questo esperimento erano topi ICR maschii esperimento ingenuo, 6-8 settimane di età.

Quando si considera la progettazione dell'esperimento, ci sono una serie di fattori che devono essere considerati. Il ceppo del mouse possa influenzare notevolmente il tempo di esplorazione e l'intervallo di mantenimento per discriminazione oggetto positivo. Sık e colleghi hanno analizzato una serie di ceppi comunemente usati, tra cui C57BL, Swiss, BALB/c e topi 129/Sv30. Hanno mostrato che c'è una differenza significativa nel tempo esplorativo totale tra i ceppi, con Swiss e Balb/c avendo il più alto momento esplorativo e C57BL e 129/sv con il più basso tempo esplorativo. Questo problema riguarda il valore assoluto di discriminazione (d1). Inoltre, l'intervallo di ritenzione Mostra una diminuzione significativa nel corso del tempo, con 129/Sv topi con il più basso valore di d2 di quattro ceppi a 1 h (Figura 5). Per il ceppo 129/Sv, potrebbe essere a causa del loro basso livello di esplorazione e non necessariamente la loro mancanza di riconoscimento. Si noti che in questo studio, i ricercatori hanno usato un più breve T1 e T2 (3 min a prova), che ha provocato solo due dei quattro ceppi raggiungendo il tempo minimo di 20 s di esplorazione ha suggerito qui. Questo criterio minimo è spesso considerato l'importo minimo di tempo necessario per imparare ed esplorare oggetti4. Lo studio citato qui di seguito viene illustrato l'importanza di avere un simile criterio minimo.

Figura 1: campione di oggetti per l'uso in ORT. Gli oggetti utilizzati in Lueptow et al sono abbastanza semplici, ma hanno qualche distinzione dispone di6. Tutti gli articoli sono leggermente più grandi di un topo normale e si possono facilmente salire su. Visualizzati da sinistra a destra è un bicchiere da degustazione birra a testa in giù, un blocco di costruzione giocattolo con nastro per texture, un impacco di ghiaccio e un blocchetto di costruzione del giocattolo con allegato un occhio sporgente. Gli oggetti sono stati bloccati al pavimento con stucco di montaggio amovibile, così come non per spostare o suggerimento durante l'esplorazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: messa a punto sperimentale per l'ORT. L'ORT avviene in 3 giorni. Il primo giorno è assuefazione (T0), in cui è consentito un mouse per esplorare il campo aperto per minimo 5 giorno 2 è addestramento (T1), in cui il mouse ha permesso di esplorare l'arena con 2 oggetti identici disposto lungo la diagonale. Test (T2) avviene a 24 h dopo T1 (questo intervallo di ritenzione può essere fatto più o meno lungo, a seconda delle condizioni sperimentali). Topi sono autorizzati a esplorare l'arena con uno degli oggetti familiari e un oggetto romanzo, collocato lungo la diagonale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: aumento Dose-dipendente della memoria in ORT. (un) Baia 607550 e (b) ND7001, quando somministrato 30 minuti prima dell'allenamento, ha migliorato la memoria in un modo dipendente dalla dose quando somministrato, come visto da un aumento dell'indice di discriminazione (d2). Barre rappresentano mezzi ± s.e.m.; n = 10-18 per ogni gruppo. p = 0.05, * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001 rispetto al veicolo. Questa figura è stata copiata da Lueptow et al., 20166 con gentile concessione da Springer Science and Business Media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: inibizione di PDE2 durante l'acquisizione, consolidamento precoce o richiamo hanno migliorato significativamente memoria in ORT. (un) 607550 Bay (3 mg/kg) ha migliorato significativamente la memoria quando somministrato 30 minuti prima dell'allenamento (acquisizione). (b) 607550 Bay (3 mg/kg) dato immediatamente dopo l'allenamento (consolidamento) o 30 min prima del test (richiamo) significativamente migliorato la memoria, come si è visto da un aumento dell'indice di discriminazione (d2). Barre rappresentano la media ± s.e.m.; n = 10-18 per ogni gruppo. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001 rispetto al veicolo. Questa figura è stata copiata da Lueptow et al., 20166 con gentile concessione da Springer Science and Business Media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: ceppo dipendente differenze in memoria tra gli intervalli di ritenzione. Le prestazioni di C57BL, Swiss, BALB/c e 129/Sv topi sull'indice di discriminazione relativa (d2) in un compito di riconoscimento di oggetto diversi ritardi. Tutti i ceppi discriminati tra gli oggetti in base all'intervallo 1-h, ma non in base all'intervallo 4 e 24 h. I valori rappresentano la media (±S.E.M.). Area tra le linee tratteggiate indica lo s.e.m.-gamma del gruppo virtuale (significa: 0, s.e.m.: 0.06). Questa figura è stata copiata da Şık et al. 2003,30 , con gentile concessione da Elsevier.

Tabella 1: Formula per l'analisi dei dati in ORT. E1 è il momento di esplorazione totale durante l'allenamento. a1 e a2 è il tempo a ogni oggetto identico durante T1. e2 è la volta di esplorazione totale durante i test, dove a è l'oggetto familiare e b è l'oggetto di romanzo.

L'autore non ha nulla di divulgare.