Questo protocollo descrive metodi per purificare, quantificare e caratterizzare vescicole extracellulari (EVs) / esosomi da cellule epiteliali mammarie non aderenti / mesenchimali e per usarle per trasferire la capacità di formazione delle ghiandole mammarie alle cellule epiteliali mammarie luminali. EVs / esosomi derivati da cellule epiteliali mammarie simili a stelo possono trasferire questa proprietà cellulare alle cellule che ingeriscono gli EV / esosomi.
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Articolo metodologico
Trasferimento di abilità di formazione del ghiandale mammario tra le cellule epiteliali basali del mammifero e le cellule luminescenti mammarie attraverso le vescicole / esosomi extracellulari
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule possono comunicare attraverso esosomi, vescicole extracellulari di ~ 100 nm (EVs) che contengono proteine, lipidi e acidi nucleici. Le vescicole extracellulari ottenute dalle cellule epiteliali mammarie non mescolate (NAMEC) possono essere isolate dal mezzo NAMEC tramite ultracentrifugazione differenziale. Sulla base della loro densità, gli EV possono essere purificati mediante ultracentrifugazione a 110.000 x g. La preparazione EV da ultracentrifugazione può essere ulteriormente separata usando un gradiente continuo di densità per impedire la contaminazione con proteine solubili. Gli EVs purificati possono quindi essere ulteriormente valutati usando un'analisi di tracking nanoparticolare, che misura la dimensione e il numero di vescicole nel preparato. Le vescicole extracellulari con una dimensione variabile da 50 a 150 nm sono esosomi. Gli EVs / esosomi derivati dal NAMEC possono essere ingeriti da cellule epiteliali mammarie, che possono essere misurate mediante citometria a flusso e microscopia confocale. Alcune proprietà delle cellule staminali del mammario ( ad esempio, la capacità di formare la ghiandola mammaria) possonoEssere trasferito da NAMEC-simili a gambo alle cellule epiteliali mammarie attraverso i EV / esosomi derivati da NAMEC. Le cellule epiteliali mammarie luminose luminescenti epCAM hi / CD49f non possono formare ghiandole mammarie dopo essere state trapiantate nei rilievi di grasso del mouse, mentre le cellule epiteliali mammarie EpCAM lo / CD49f hi basali formano ghiandole mammarie dopo il trapianto. L'assorbimento di EV / esosomi derivati da NAMEC da EpCAM hi / CD49f lo luminal cellule epiteliali mammarie permette loro di generare ghiandole mammarie dopo essere stati trapiantati in pastiglie grasse. Gli EVs / esosomi derivati da cellule epiteliali mammarie simili al gambo trasferiscono la capacità di formare la ghiandola mammaria alle cellule epiteliali mammarie luminose EpCAM hi / CD49f.
Introduzione
Gli esosomi possono mediare la comunicazione cellulare trasferendo membrane e proteine citosoliche, lipidi e RNA tra le cellule 1 . La comunicazione esosomiale è stata dimostrata coinvolta in molti processi fisiologici e patologici ( es. Presentazione di antigene, sviluppo della tolleranza 2 e progressione tumorale 3 ). Gli esosomi spesso hanno contenuti simili a quelli delle cellule di origine che li rilasciano. Così, gli esosomi possono trasportare proprietà cellulari specifiche dalle cellule sorgenti e trasferire queste proprietà alle cellule che ingeriscono 4
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Protocollo
Tutte le ricerche relative agli animali sono conformi ai protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura degli animali.
1. Isolamento e validazione di vescica extracellulare / esosomi
- Le cellule basali dell'epitelio mammario della cultura, NAMECs 4 , con mezzo fresco e privo di siero costituito da 500 mL di MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL di DMEM / F12 con bicarbonato di sodio (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Idrocortisone (0,5 μg / mL); Insulina (5 μg / mL); Estratto di ipofisaro bovino (BPE; 35 μg / mL); E GW627368X (1 μg / mL) nei piatti da 15 cm.
- Dopo il conteggio delle cellule con un ....
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Risultati
Dal momento che è stato dimostrato che bloccando la segnalazione di PGE 2 / EP 4 provoca il rilascio di EV / esosomi da cellule staminali simili al basale mammario 4 , questo lavoro presenta un metodo di isolamento degli EV / esosomi indotti dalla coltura cellulare basale epiteliale mammaria (NAMEC). Dal momento che NAMECs sono coltivati in un mezzo senza siero, non esistono EVs / esosomi preesistenti derivati dal siero .......
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Discussione
Gli esosomi spesso trasportano caratteristiche delle cellule che li hanno liberati e la quantità di esosomi rilasciati può essere indotta da stimoli 4 . Il mezzo di coltura delle cellule può essere raccolto e sottoposto ad ultracentrifugazione differenziale per la raccolta di EV / esosomi ( Figura 1 ). Attualmente non esiste un accordo generale su un metodo ideale per isolare EV / esosomi. Il metodo ottimale utilizzato qui è stato determinato dall'applicazione a .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni degli Istituti Nazionali di Ricerca Sanitaria (05A1-CSPP16-014, HJL) e dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuga | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotore | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotore | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | soluzione al 60% (p/v) di iodixanolo in acqua (sterile). |
| L'anticorpo CD81 | GeneTex | GTX101766 | 1:1.000 in latte in polvere scremato al 5% p/v, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 gradi; C, durante la notte |
| Anticorpo CD9 | GeneTex | GTX100912 | 1:1.000 in 5% p/v latte in polvere scremato, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 gradi C, durante la notte |
| Anticorpo CD63 | Abcam | Ab59479 | 1:1.000 in 5% p/v latte in polvere scremato, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 gradi C, durante la notte |
| Anticorpo TSG101 | GeneTex | GTX118736 | 1:1.000 in 5% p/v latte in polvere scremato, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 gradi C, durante la notte |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6.000 in latte secco scremato al 5% p/v, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 gradi; C, durante la notte |
| CFSE (estere carbossifluoresceina succinimidil diacetato) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | analizzatore cellulare a fluorescenza | |
| collagenasi Tipo IV | Thermo | 17104019 | |
| tripsina | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | una miscela di insulina umana ricombinante, transferrina umana e selenito di sodio |
| accutasi | ebioscience | 00-4555-56 | una miscela enzimatica naturale con attività enzimatica proteolitica e collagenolitica |
| dispasi | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anticorpo anti-CD49f | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anticorpo anti-EpCAM | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carminio allume | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| cellule epiteliali mammarie umane (cellule HMLE, NAMECs) | doni del Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| bicarbonato di sodio | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Idrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (estratto di ipofisi bovina) | Hammod Cell Tech | 1078-Nuova Zelanda | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| piatto di coltura da 15 cm | Falco | ||
| centrifuga da tavolo | Eppendrof | Centrifuga 3415R | |
| provetta per ultracentrifuga | Beckman | 344058 | |
| PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Microscopia elettronica a trasmissione | Hitachi | HT7700 | |
| gelatina | STEMCELL | 7903 | |
| Piatto di coltura da 10 cm | Falco | ||
| piatto di coltura a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| femmine C57BL/6 topi | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamicina | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNasi I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorano | Alocarburo | NPC12164-002-25 | |
| formaldeide | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Etanolo) | J.T. Baker | 800605 | |
| acido acetico glaciale | Panreac | 131008.1611 | |
| solfato di alluminio e potassio | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| xilene | Leica | 3803665 | |
| 0,22 μ m membrane | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Clip per ferite, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Clip per ferite | Applicatore BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask&commercio; Rosso Profondo | Thermo Fisher Scientific | Colorazione della membrana plasmatica | C10046 |
Riferimenti
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
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Ristampe e permessi
