Articolo metodologico

Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution

DOI:

10.3791/55738

⸱

1 giugno 2017

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la separazione dei complessi funzionali della catena di trasporto elettronico mitocondriale (Cx) IV e dei suoi supercomplexi utilizzando l'elettroforesi nativa per rivelare informazioni sulla loro struttura e struttura. Il gel nativo può essere sottoposto a immunoblotting, analisi in-gel e purificazione mediante elettroelution per caratterizzare ulteriormente i singoli complessi.

Abstract

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La catena di trasporto elettronico mitocondriale (ETC) trasforma l'energia derivata dalla rottura di vari combustibili nella valuta bioenergetica della cellula, ATP. L'ETC è composto da 5 complessi proteici massicci, che si riuniscono anche in supercomplexes chiamati respirasomi (CI, C-III e C-IV) e sintasi (CV) che aumentano l'efficienza del trasporto di elettroni e della produzione di ATP. Sono stati utilizzati diversi metodi per oltre 50 anni per misurare la funzione ETC, ma questi protocolli non forniscono informazioni sull'assemblaggio di singoli complessi e supercomplex. Questo protocollo descrive la tecnica dell'elettroforesi genica gel poliacrilammide (PAGE), un metodo modificato più di 20 anni fa per studiare la struttura complessa di ETC. L'elettroforesi nativa consente la separazione dei complessi ETC nelle loro forme attive, e questi complessi possono essere studiati utilizzando immunoblotting, test in-gel (IGA) e purificazione mediante elettroelution. Combinando il reI risultati di un gel nativo PAGE con quelli di altri test mitocondriali, è possibile ottenere un quadro completo dell'attività ETC, del suo assemblaggio dinamico e dello smontaggio e come questo regola la struttura e la funzione mitocondriale. Questo lavoro discuterà anche i limiti di queste tecniche. In sintesi, la tecnica della PAGE nativa, seguita da immunoblotting, IGA e elettroelution, presentata sotto, è un modo potente per studiare la funzionalità e la composizione dei supercomplex mitocondriali ETC.

Introduzione

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L'energia mitocondriale sotto forma di ATP non è solo essenziale per la sopravvivenza cellulare, ma anche per la regolazione della morte cellulare. La generazione di ATP da fosforilazione ossidativa richiede una catena funzionale di trasporto di elettroni (ETC; Cx-I-IV) e mitocondriale ATP sintasi (Cx-V). Recenti studi hanno dimostrato che questi grandi complessi proteici sono organizzati in supercomplex, chiamati respirasomi e sintasi 1 , 2 . È impegnativo analizzare l'assemblaggio, la dinamica e la regolazione delle attività di questi complessi e supercomplexi massicci. Mentre le misurazioni del consumo di ossigeno prese con un esame di elettrodi di ossigeno e di enzimi condotti utilizzando uno spettrofotometro possono fornire preziose informazioni sull'attività complessa del ETC, questi dosaggi non possono fornire informazioni riguardanti la presenza, la dimensione e la composizione subunità del complesso proteico o dei supercomplexi coinvolti. Tuttavia, lo sviluppo di nativi azzurri e chiari (BN e CN) PAGE 3 ha creato un potente strumento per rivelare importanti informazioni sulla composizione complessiva e sull'assemblaggio / smontaggio e sulla regolazione dinamica dell'organizzazione supramolecolare di questi complessi respiratori vitali in condizioni fisiologiche e patologiche 4 .

L'assemblaggio di questi complessi in supercomplex di ordine superiore sembra regolare la struttura mitocondriale e la funzione 5 . Ad esempio, il complesso respiratorio aumenta l'efficienza del trasferimento di elettroni e la generazione della forza motrice protonica attraverso la membrana interna mitocondriale 5 . Inoltre, l'assemblaggio di sintasi non solo aumenta l'efficienza della produzione di ATP e il trasferimento di equivalenti energetici nel citoplasma 2 , ma anche forma la membrana interna mitocondriale nella crista tubolare 6 ,/ Sup> 7 . Studi di assemblaggio supercomplex durante lo sviluppo cardiaco in embrioni di topi mostrano che la generazione di supercomplex contenenti Cx-I nel cuore inizia a circa il giorno embrionale 13.5 8 . Altri hanno dimostrato che la quantità di supercomplex contenenti Cx-I diminuisce nel cuore a causa dell'invecchiamento o delle lesioni di reazioni di ischemia / reperfusione 9 , 10 o possono svolgere un ruolo nella progressione delle malattie neurodegenerative 11 .

Questo protocollo descrive metodi per PAGE nativo di gel che può essere utilizzato per indagare l'assemblaggio e l'attività dei complessi ETC e dei supercomplex. Il peso molecolare approssimativo dei supercomplex mitocondriali può essere valutato separando i complessi proteici in gel di poliacrilammide CN o BN. CN PAGE consente anche la visualizzazione dell'attività enzimatica di tutti i complessi mitocondriali direttamente nel gel (in-gel assay;IGA) 12 . Questo lavoro dimostra l'attività dei respirasomi evidenziando la capacità di Cx-I di ossidare NADH attraverso l'IGA e la presenza di sintassi derivanti dall'attività di idrolisi ATP di Cx-V da parte di IGA. I complessi multipli e i supercomplex contenenti Cx-I e Cx-V possono anche essere dimostrati trasferendo le proteine ​​sulle membrane di nitrocellulosa e eseguendo immunoblotting. Il vantaggio di questo approccio è che BN o CN PAGE in genere separano i complessi proteici in base alla loro dimensione e composizione fisiologica; Il trasferimento a una membrana conserva questo modello di bande. L'analisi dei complessi proteici in una BN o in CN PAGE può essere effettuata anche utilizzando la 2D-PAGE (vedere Fiala et al. 13 per una dimostrazione) o mediante centrifugazione di densità di saccarosio 14 , 15 . Per analizzare ulteriormente una banda specifica, è possibile escoggersi dalla BN PAGE e le proteine ​​di questo complesso proteico possono essere purificateD elettrolientandoli in condizioni naturali. L'elettroelution nativo può essere eseguito entro poche ore, che potrebbe fare una differenza significativa alla diffusione passiva (come usato nel riferimento 16) di proteine ​​da un gel nel buffer circostante.

In sintesi, questi metodi descrivono diversi approcci che consentono l'ulteriore caratterizzazione di supercomplex di peso molecolare dalle membrane mitocondriali.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando cuori da topi C57BL / 6N (tipo selvatico). I topi sono stati anestetizzati con CO 2 prima della dislocazione cervicale e tutte le procedure sono state eseguite in stretta conformità con la Divisione di Medicina Veterinaria Laboratoria presso l'Università di Rochester e in conformità con la legge statale, statuto federale e la politica NIH. Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Rochester (Commissione universitaria delle risorse animali).

1. CN e BN PAGE

NOTA: Tutte le apparecchiature utilizzate per BN e CN PAGE devono essere prive di detersivo. Per garantire questo, lavare tutte le apparecchiature con acido cloridrico 0,1 M, seguito da un ampio risciacquo con H 2 O deionizzato.

  1. Preparazione
    1. Preparare un tampone di anodo costituito da 25 mM imidazolo, pH 7,0, a 4 ° C; Conservare a 4 ° C.
    2. Preparare il buffer catodico per CN o BN PAGE.
      1. Per CN PAGE, utilizzare 7.5 mM imidazolo e 50 mM tricina; Aggiungere 0,5 g di deossolfato di sodio e 0,2 g di lauril maltoside per litro di tampone. Regolare il pH a 7 ° C a 4 ° C e conservare a 4 ° C.
      2. Per BN PAGE, utilizzare 7.5 mM imidazolo e 50 mM tricina e regolare il pH a 7.0 a 4 ° C. Conservare a 4 ° C.
      3. Per il tampone catodico BN in blu chiaro, utilizzare 7.5 mM imidazolo e 50 mM tricina. Regolare il pH a 7,0 a 4 ° C e aggiungere 20 mg di Coomassie per litro di tampone. Conservare a 4 ° C.
    3. Preparare il buffer di estrazione (EB) con 50 mM NaCl, 50 mM imidazolo, 2 mM acido aminocaproico e 1 mM EDTA. Regolare il pH a 7 ° C a 4 ° C e conservare a 4 ° C.
    4. Preparare il tampone gel 3x (utilizzato per i gel BN e CN) con 75 mM imidazolo e 1,5 M acido aminocaproico. Regolare il pH a 7 ° C a 4 ° C e conservare a 4 ° C.
    5. Preparare un tampone di caricamento (LB) di 0,01 g di Ponceau S, di 5 g di glicerolo e di 5 ml di H 2 O. Conservare in cameratemperatura.
    6. Preparare il blu di Coomassie aggiungendo 50 mg di Coomassie a 1 mL di 500 mM di acido 6-aminoheico. Regolare il pH a 7 ° C a 4 ° C e conservare a 4 ° C.
    7. Preparare 20 mM e 200 mM lauril maltoside in H 2 O. Fare aliquote di 200 μL e conservarli congelati. Sciogliere il detergente prima dell'uso.
Da 3% a 8% (mini) Dal 4% al 10% (maxi)
0.5 gel (leggero) 0.5 gel (pesante) 0.5 gel (leggero) 0.5 gel (pesante)
AAB (ml) 0.42 1.3 2.5 7.7
Tampone CN / BN (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H 2 O (mL) 2.7 1.4 14 6.3
Glicerolo (g) 0 0.47 0 2.5
Volume (ml) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabella 1: Quantità di ingredienti necessari per versare 1 mini- o maxi-pagine. I volumi usati in questa tabella sono calcolati per 1 mini- o 1 maxi-gel, spessore 1,5 mm. Il volume di AAB si basa su una soluzione di magazzino del 40%. Leggeri e pesanti si riferiscono al concentratoIone di AAB. APS e TEMED vengono aggiunti dopo che ogni colonna del miscelatore di gradiente viene riempita con la soluzione AAB.

  1. Versare ed eseguire gel
    NOTA: Utilizzare rispettivamente 3-8% o 4-10% di gradiente di acrilammide / bisacrilammide (AAB) per i geni CN o BN. La Tabella 1 riepiloga le quantità di tampone, AAB, H 2 O, glicerolo, ammonio-persulfato (APS) e tetrametiletiletilendiammina (TEMED) utilizzati per un mini-gel (85 mm di larghezza x 73 mm di altezza x 1,5 mm di spessore) o maxi-gel Mm largo x 200 mm di altezza x 1,5 mm di spessore). Le confezioni di lastre di vetro con gemme CN o BN possono essere refrigerate in una borsa con qualche ml di tampone di gel 1x o avvolti in un tovagliolo di carta bagnato con tampone di gel 1x per lo stoccaggio. I gel sono stabili per essere utilizzati fino a una settimana.
    1. Per versare il gel, posizionare il miscelatore di gradiente su una piastra di agitazione elevata per assicurare che il gel fluisca per gravità nella camera gel preparata.
    2. Riempire la camera di deflusso del miscelatore di gradiente con 4.77 / 25 mL (Mini / maxi) della soluzione pesante (con una maggiore concentrazione di AAB).
    3. Aprire delicatamente la connessione del rubinetto tra la camera pesante e quella leggera e consentire una goccia di soluzione per passare all'altro lato.
      NOTA: questo spinge le bolle d'aria dal tubo di collegamento e dal rubinetto che impedirà il flusso tra le due camere. Questo non può essere fatto se entrambe le parti sono già state riempite, perché la pressione uguale impedirà la bolla di muoversi.
    4. Riempire l'altra camera del miscelatore di gradiente con 4.72 / 25 mL (mini / maxi) della soluzione leggera.
    5. Posizionare una barra di stirata nella camera di deflusso con la soluzione pesante e iniziare a mescolare. Utilizzare una velocità della barra di mescolamento che non provoca la formazione di bolle.
    6. Aggiungere rapidamente APS e TEMED ad ogni camera per avviare la polimerizzazione.
    7. Aprire la connessione tra le due camere del miscelatore gradiente e consentire la miscelazione per alcuni secondi prima di aprire la camera di mandata per versare il gel.
      NOTA: Gravità wiLo scarico di entrambe le camere sarà uguale e la miscelazione della luce nella soluzione pesante diminuirà lentamente la densità dell'acrilamide dal basso fino alla parte superiore del gel. Utilizzare l'intero contenuto contenuto nel mixer gradiente per versare il gel.
      1. Alla fine, montare attentamente il pettine, con i pozzetti all'interno del gel per evitare bolle e miscelazione a strati.
    8. Lavare immediatamente il miscelatore di gradiente con etanolo per sciacquare qualsiasi gel. Sciacquare con acqua e versare il secondo gel. Lasciare polimerizzare i gel (di solito meno di 20 minuti è necessario per mini-gel).
    9. Per eseguire i gel, montarli nel morsetto di montaggio dell'elettrodo e riempire la camera centrale / superiore con il citofono BN del CN ​​o del blu-chiaro. Attendere qualche minuto per verificare le perdite prima di aggiungere un buffer anodico alla camera esterna / inferiore.
      1. Estrarre delicatamente i pozzetti e lavare i pozzetti con il buffer catodico utilizzando una siringa o una pipetta.
      2. Eseguire i gel in una stanza fredda (4 ° C) o completamente imballata in ghiaccio.
        1. Per CN mini-PAGE, utilizzare 100 V per la prima ora e 200 V finché non è terminato, di solito un altro 1-1,5 h. In alternativa, eseguire la CN mini-PAGE a 30-40 V durante la notte.
          NOTA: l'attenzione è qui sui complessi proteici ad alto peso molecolare, per cui complessi proteici con un peso molecolare inferiore a 140 kDa esauriranno dal gel. Possono essere utilizzati tempi di corsa più brevi per l'elettroforesi per mantenere complessi a basso peso molecolare.
        2. Per BN maxi-PAGE, utilizzare 100 V ed eseguire i gel durante la notte (circa 18 h).
          NOTA: La corrente sarà molto bassa (<15 mA), quindi è necessario un alimentatore in grado di gestire queste condizioni. A questo punto, i gel possono essere utilizzati per IGA o immunoblotting. In alcuni casi, bande o corsie possono essere tagliate fuori dai gel usando una lama di rasoio su una lastra di vetro per elettroelution.
  2. preparazione del campione
    NOTA: I supercomplex mitocondriali a membrana devono essere estratti da thE membrana mitocondriale interna. Per proteggere i supercomplex mitocondriali, utilizzare mitochondria appena isolato o campioni che sono stati congelati e scongelati una sola volta. I calcoli / volumi riportati di seguito sono dati per mini-gel (il pozzetto di un pettine da 10 pozzetti in un gel da 1,5 mm di spessore fino a 35-40 μL) e maxi gel (il pozzo di un pettine da 15 pozzetti è fino a 200 μL). Inoltre, salvare un'aliquota di ogni campione (di solito 10 μL), da eseguire su un gel SDS denaturante per la rilevazione del canale di anione dipendente dalla tensione (VDAC), come controllo di caricamento.
    1. Inserire una quantità appropriata ( ad es., 10-50 μg di proteine ​​per mini-gel e 50 - 200 μg per maxi gel) di mitocondri isolati o tessuto omogeneato in microtubi e centrifugare a 17.000 xg per 10-15 min a 4 ° C.
      NOTA: Questo passaggio elimina alcune delle matrici mitocondriali solubili e / o proteine ​​citosoliche.
    2. Aspirare e scartare il surnatante e aggiungere il tampone di estrazione alla quantità desiderataDa caricare sul gel. Riposare delicatamente il sedimento su ghiaccio. Se si desidera, aggiungere un mix di inibitori della proteasi generale a questo punto.
      NOTA: Sulla base dell'apparecchiatura utilizzata qui, 30 μL è stato usato per un mini-gel e 100 μL per un maxi-gel, limitando il rapporto proteina / tampone a non più di 2 μg di proteine ​​a 1 μl di tampone.
    3. Aggiungere detersivo ( ad esempio, 2 μg di lauril maltoside / 1 μg di proteine, vedere i risultati rappresentativi e la discussione per ulteriori informazioni).
      NOTA: In genere si utilizza il lauril maltoside, ma può anche essere utilizzato il digitonin.
    4. Incubare su ghiaccio per 20 min. Mescolare delicatamente all'inizio e occasionalmente durante l'incubazione triturando e / o agitando il tubo.
    5. Centrifugare a 17.000 xg per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere qualsiasi membrana e frammenti di tessuto.
    6. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Per i campioni di CN, aggiungere 1 μL di LB per ogni 10 μL di volume del campione; Il volume totale del campione dovrebbe essere appApprossimativamente 40 μL per un mini-gel e 130 μL per un maxi-gel. Per i campioni BN, aggiungere Coomassie ai campioni in modo che il rapporto tra colorante e detersivo sia di 1: 4 (w / w).
    7. Caricare 30 e 120 μL dei campioni nei pozzetti del mini- o maxi-gel, rispettivamente. Utilizzare il restante 10 μL da ogni campione per il gel denaturativo SDS per rilevare VDAC come un controllo di caricamento.
    8. Per preparare i marcatori a peso molecolare, sciogliere 1 flaconcino di una miscela di calibrazione ad alta molecola (vedere la tabella dei materiali per ulteriori informazioni) in 60 μl di buffer BN / CN gel e aggiungere 120 μl di H2O e 20 μL di LIBBRE. Caricare 15 μL per corsia.
    9. Eseguire i gel come descritto nel punto 1.2.9.2.

2. Analisi in-gel per Cx-I e Cx-V

NOTA: I dosaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente. Scatta foto, scansioni o immagini delle bande di sviluppo per la documentazione. (Importante) Le proteine ​​non possono essere trasferiteO membrane nitrocellulose dopo aver completato un IGA.

  1. Cx-I assay
    1. Preparazione.
      1. Preparare un tampone di analisi di 5 mM Tris in H 2 O, con un pH di 7,4; conservare a temperatura ambiente.
      2. Sciogliere 10 mg di NADH in 1 mL di tampone di dosaggio. Conservare in aliquote di 100 μL a -20 ° C fino all'uso; Evitare il congelamento e scongelamento.
      3. Pesare 25 mg di Tetrazolium Nitroblue in un microtube.
      4. Preparare il fissativo diluendo 5 mL di acido acetico in 95 mL di H 2 O; conservare a temperatura ambiente.
    2. Esecuzione del dosaggio.
      1. Combinare 10 mL di buffer di analisi con 25 mg di tetrazolium Nitroblue (concentrazione finale: 2,5 mg / mL) e 100 μL di 10 mg / mL NADH (0,1 mg / mL). Aggiungete questo a tutto il gel, una corsia o una zona di interesse escluse da un gel CN.
        NOTA: questo può essere fatto in un contenitore trasparente di plastica o di vetro. Tieni presente che questo test non può essere eseguito dopo BN PAGE.
      2. Seguire lo sviluppo delle bande blu dopo una leggera agitazione (rocker) per> 3 min.
      3. Fissare il gel in 10 - 20 ml di soluzione di acido acetico o lavare in 5 mM Tris, pH 7,4 per fermare la reazione. Scattare fotografie per la documentazione (vedere la tabella dei materiali).
  2. Analisi Cx-V
    NOTA: Il test Cx-V deve essere effettuato usando gel duplicati CN o BN, dove uno viene incubato con oligomicina da 5 μg / mL (un inibitore Cx-V) per dimostrare l'attività indipendente da Cx-V.
    1. Preparazione.
      1. Preparare un tampone di analisi con 35 mM Tris e 270 mM glicina; Regolare il pH a 8,3 a temperatura ambiente. Conservare il tampone congelato in aliquote da 50 mL, ma controllare il pH dopo il congelamento e la scongelamento.
      2. Preparare 1 M MgSO 4 in H 2 O; Conservare a 4 ° C fino all'uso.
      3. Pesare 27,28 mg di Pb (NO 3 ) 2 in un microtube.
      4. Pesare 60 mg di ATP in un microtube.
      5. Sciogliere 1 mg di oLigomicina in 1 ml di etanolo. Conservare a -20 ° C fino all'uso.
      6. Preparare un fissativo mescolando 50 mL di metanolo con 50 mL di H 2 O; conservare a temperatura ambiente.
    2. Esecuzione del dosaggio.
      1. Incubare un gel, una corsia o una zona di interesse da un gel di BN o CN per 2 ore con agitazione leggera (rocker) in 10-20 mL di tampone di dosaggio ± 5 μg / mL oligomicina (50-100 μL di 1 mg / ML in etanolo) a temperatura ambiente.
      2. Dopo l'incubazione, sostituire il tampone con 14 ml di tampone di analisi fresco e aggiungere, in ordine, 190 μl di 1 M MgSO 4 (14 mM), 27,28 mg di Pb (NO 3 ) 2 (5 mM), 60 mg di ATP 8 mM) e 75 μL di oligomicina (ove necessario).
      3. Incubare con agitazione leggera (rocker) e guardare per un precipitato bianco, poiché le bande su gel trattati con oligomicina daranno bande non-Cx-V.
        NOTA: L'aspetto del precipitato può richiedere diverse ore.
      4. Fissare il gel in metanolo-( Ad esempio, metanolo al 50%), perché le soluzioni acide dissolvono il precipitato di piombo. Fotografate i risultati.
        NOTA: il precipitato di piombo non interferisce con la colorazione Coomassie dei gel.

3. Trasferimento di proteine ​​a membrane di nitrocellulosa o polivinilidene difluoruro (PVDF)

  1. Preparare un tampone di trasferimento di 25 mM Tris e 200 mM di glicina. Regolare il pH su 8.3 e aggiungere 0.0005 g / L SDS e 200 mL / L metanolo. Conservare a temperatura ambiente.
    1. Tagliare una membrana di nitrocellulosa o PVDF (dimensione dei pori: 0,45 μm) con una lama di rasoio o forbici ad una dimensione leggermente più grande di quella del gel.
      NOTA: Le membrane di Nitrocellulosa consentono la colorazione Ponceau S per valutare il carico delle proteine, mentre le membrane PVDF producono bande più nitide.
  2. Protocollo.
    1. Immergere la membrana di nitrocellulosa, la carta filtrante e le spugne per unaAlmeno 10 minuti nel buffer di trasferimento. Mettere la membrana PVDF in metanolo al 100% per 15 secondi o secondo la raccomandazione del produttore prima di collocarla nel buffer di trasferimento. Posizionare la cassetta aperta del kit di trasferimento in una ciotola piatta con tampone di trasferimento.
    2. Posizionare la spugna e 1-2 strati di carta filtrante sul lato posteriore della cassetta. Rimuovere le bolle.
    3. Posizionare il gel sul filtro. Indicare l'orientamento del gel tagliando un angolo del gel e / o della membrana.
    4. Posizionare la membrana sulla parte superiore del gel. Rimuovere tutte le bolle.
    5. Posizionare la carta filtrante e una spugna sulla parte superiore della membrana. Rimuovere tutte le bolle in questo panino.
    6. Chiudere la cassetta e inserirla nel supporto della cassetta del kit di trasferimento.
    7. Trasferire le proteine ​​a 25 V per circa 12-18 h.

4. Immunoblotting

  1. Preparazione.
    1. Preparare una macchia Ponceau (500 mL) aggiungendo 25 mLDi acido acetico e 0,5 g di Ponceau S a 475 ml di H 2 O; Conservare a temperatura ambiente (può essere riutilizzato).
    2. Preparare la soluzione salina a tampone Tris (TBS) con 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Base e 2,7 mM KCl. Regolare il pH su 8,0 e conservare a temperatura ambiente.
    3. Preparare TBS-tween (TBST) aggiungendo 0,5 mL / L Tween 20 a TBS; conservare a temperatura ambiente.
    4. Preparare solidi di latte / TBST sciogliendo 5 g di solidi di latte in 100 ml di TBST. Conservare a 4 ° C e usare entro 3 giorni.
    5. Preparare BSA / TBST sciogliendo 3 g di albumina serica bovina (BSA, frazione V) in 100 mL di TBST. Conservare a 4 ° C e usare entro 3 giorni.
  2. Protocollo.
    1. Al termine del trasferimento, posizionare la membrana nella soluzione Ponceau S per visualizzare tutte le proteine ​​trasferite. Etichettare la posizione dei marcatori sulla membrana con una matita e documentare la membrana Ponceau-S macchiata per fotografia o scansione.
    2. Lavare la membrana 3 volte per 10 min ogni wiTh TBS sotto agitazione leggera.
    3. Bloccare la membrana con solidi di latte / TBST per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte in una stanza fredda con agitazione leggera.
    4. Lavare la membrana per 10 min con TBST sotto agitazione leggera.
    5. Incubare con l'anticorpo primario durante la notte in camera fredda sotto agitazione leggera. Diluire l'anticorpo ( ad esempio, 1: 1.000 per anti-ATP5A e -NDUFB6) in BSA / TBST.
      NOTA: la maggior parte degli anticorpi danno un segnale migliore sulle membrane dai gel nativi quando vengono incubati durante la notte.
    6. Lavare la membrana per 10 min con TBST sotto agitazione leggera.
    7. Incubare con anticorpo secondario per almeno 60 minuti a temperatura ambiente e agitazione minima. Diluire l'anticorpo (1: 5.000 a 1: 50.000) nei solidi del latte / TBST.
    8. Lavare la membrana 3 volte per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione TBST e dolce.
    9. Durante l'ultimo lavaggio, preparare il substrato di chemoluminescenza migliorata (ECL) secondo le istruzioni del manufacturer.
    10. Incubare la membrana con il supporto ECL utilizzando le istruzioni fornite dal produttore.
    11. Rileva il segnale sul film utilizzando le istruzioni fornite dal produttore del substrato ECL.

5. Elettroelution

  1. Preparazione.
    1. Preparare un tampone di eluizione di 25 mM tricina, 3.75 mM imidazolo (pH 7.0 a 4 ° C) e 5 mM acido 6-aminohexanoico.
      NOTA: indossare guanti in qualsiasi momento durante la manipolazione dell'elettrodoelettrico e dei tappi a membrana per evitare la contaminazione con proteine ​​esterne.
  2. Il giorno prima dell'uso dell'elettroutensile per elettroelution nativo, eseguire quanto segue:
    1. Immergere i tappi a membrana (cut-off: 3,5 kDa) in tampone di eluizione per 1 h a 60 ° C. Trasferire i tappi al buffer di eluizione fresco e immergerli per almeno 12 ore in frigorifero.
      NOTA: Un peso molecolare di taglio di 3,5 kDa impedisce la perdita di piccoli pRotte che possono facilmente dissociarsi dal complesso proteico di interesse.
    2. Lavare completamente il modulo elettroelettrico, i tubi di vetro, il serbatoio e il coperchio con etanolo. Sciacquare con acqua e lasciare asciugare l'attrezzatura.
  3. Il giorno della elettroelurazione nativa, procedere come segue.
    1. Mettere una frusta nel fondo (smerigliato) di ogni tubo di vetro da utilizzare. Se necessario, posizionare il tubo di vetro in tampone di eluzione e spingere la fetta dall'interno al fondo del tubo.
    2. Spingere il tubo di vetro con la frittura nel modulo dell'elettroutensile. Bagnare la guarnizione con il tampone di eluizione e far scivolare il tubo di vetro in posizione. Assicurarsi che le superfici dei tubi di vetro siano uguali con la guarnizione.
    3. Chiudere i gommini vuoti con i tappi.
    4. Posizionare un tappo a membrana umida nella parte inferiore dell'adattatore al silicone e riempire l'adattatore con tampone di eluizione. Infilare lentamente e lentamente il tampone nell'adattatore per rimuovere le bolle d'aria attorno alla membrana di dialisi/ Li>
    5. Far scorrere l'adattatore riempito a tampone al fondo del tubo di vetro. Rimuovere tutte le bolle che appaiono sulla fetta all'interno del tubo di vetro.
    6. Riempire ogni tubo di vetro con tampone di eluizione.
    7. Posizionare le fascette eccedenti della BN PAGE nei tubi di vetro (vedere punto 1.2.9.3). Tagliare pezzi di grandi dimensioni in pezzi più piccoli. Assicurarsi che l'altezza di riempimento all'interno del tubo di vetro sia di circa 1 cm.
    8. Posizionare l'intero modulo nel serbatoio.
    9. Aggiungere circa 600 ml di tampone di eluizione fredda al serbatoio. Assicurarsi che i tappi dell'adattatore al silicio siano nel buffer per evitare le bolle alla membrana della dialisi.
    10. Posizionare una barra di agitazione nella parte inferiore del serbatoio.
      NOTA: L'agitazione impedirà che le bolle si attaccino al fondo della membrana di dialisi.
    11. Eluate le proteine ​​per 4 h a 350 V in una stanza fredda.
    12. Dopo aver completato l'eluizione, rimuovere il modulo elettroelettrico dal serbatoio di tampone e metterlo in un dispersore o una ciotola.
    13. Se è stato utilizzato un tappo, rimuoverloNella camera di tampone superiore. Altrimenti, utilizzare una pipetta grande per rimuovere il buffer.
    14. Rimuovere il tampone da ogni tubo di vetro e scartare. Assicurarsi che l'adattatore di silicone rimanga in posizione e che il liquido sotto il frit non sia disturbato o scosso.
    15. Rimuovere con cautela l'adattatore di silicone, insieme al tappo a membrana dal fondo del tubo di vetro. Pipettare il contenuto (circa 400 μL) del tappo in silicone in un microtube. Con altri 200 μl di tampone di eluizione, risciacquare il tappo di silicio e aggiungere al microtube. Ripetere per tutti i tubi di vetro.
    16. Poiché i tappi a membrana possono essere riutilizzati, conservare i tappi a membrana inserendoli in tampone di eluizione contenente 0,5 mg / ml di sodio azide. Frigorifero.
      NOTA: L'eluato ha una bassa concentrazione proteica e può essere concentrato utilizzando dispositivi filtranti centrifughi.

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Risultati

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Per visualizzare i supercomplex mitocondriali, i mitocondri freschi isolati dai topi sono stati usati 17 , 18 . I supercomplex mitocondriali sono sensibili a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento, portando alla loro disgregazione, anche se questo può essere tollerabile per alcuni ricercatori. Se il freddo è necessario per lo stoccaggio, per garantire i migliori risultati, i campioni non devono subire più di un ciclo di c...

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Discussione

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Un ETC funzionale è necessario per la generazione di ATP mitocondriale. I complessi dell'ETC sono in grado di formare due tipi di supercomplex: i respirasomi (Cx-I, -III e -IV) 1 ei sintasi (Cx-V) 2 . L'assemblaggio di ogni complesso è richiesto per un ETC intatto, mentre l'organizzazione dell'ETC in supercomplexes è pensata per aumentare l'efficienza complessiva ETC 5 , 22 . Come questi comples...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'American Heart Association's Founder's Affiliate [12GRNT12060233] e del Forte Centri di Ricerca per l'infanzia presso l'Università di Rochester.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Mini-camera Protean IIBiorad1658004Set completo per versare ed eseguire l'elettroforesi mini-gel
Maxi-gelBiorad1653189 Set completo per versare ed eseguire l'elettroforesi maxi-gel
Creatore di gradienti, Hoefer SG15VWR95044-704Versare gradienti mini-gel
Creatore di gradienti, maxi-gelVWRGM-100Versare maxi-gel gradienti
Kit di trasferimentoBiorad1703930Set completo per il trasferimento a umido di proteine su membrane Elettroelettrico
modello 422Biorad1652976Elettroeluizione di proteine da PAGINE native o SDS PAGES
Piastre di vetroBiorad1653308Piastre corte
Piastre di vetroBiorad1653312Piastre distanziatrici
Lastredi vetroBiorad1651823Piastre interne
Piastre di vetroBiorad1651824Piastre esterne
AlimentatoreBiorad1645070Alimentatore adatto per elettroforesi nativa
ECL-Western Thermo Scientific32209Substrato di chemiolumniscense
SuperSignal-WestDura Thermo Scientific34075Substrato di chemiolumniscense potenziato
Pellicola/pellicola per autoradiografiaGE Health care28906845Documentazione delle macchie occidentali Processore di
pellicole CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonNAScattare foto per documentare gel, membrane e macchie.
Paraluce Canon Power Shot 640Fotocamera schermante Canonper foto scattate su un tavolo luminoso
Acrilammide/bisacrilammideBiorad1610148soluzione premiscelata al 40%
GlycineSigmaG7403
SDS (sodio dodecil solfato)Invitrogen15525-017
Tris-baseSigmaT1503Buffer
TricineSigmaT0377
Sodio desossichelatoSigmaD66750Detergente
EDTASigmaE5134
SaccarosioSigmaS9378
MOPSSigmaM1254Tampone
ImidazoleSigmaI15513Tampone
Lauryl maltosideSigmaD4641Detergente
Coomassie G250Biorad161-0406
Acido aminoesanoicoSigmaO7260
Kit di peso molecolare nativoGE Health care17-0445-01Kit di calibrazione ad alto peso molecolare per elettroforesi nativa.
NameAziendaNumero di catalogoComments
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazoliumSigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP   SigmaA2383
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Lead(II) nitrato (Pb(NO3)2):Sigma228621
OligomicinaSigmaO4876
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Ponceau SSigmaP3504
anti-ATP5AAbcamab14748anticorpo alla subunità ATP sintasi ATP5A
anti-NDUFB6Abcamab110244anticorpo alla subunità Cx-1 NDUFB6
anti-VDACCalbiochem 529534anticorpo contro VDAC
ECL HRP linkato anticorpoGE Health CareNA931Vanticorpo secondario contro ATP5A, NDUFB6 e
VDAC Reagente bloccanteBiorad170-6404
BSA
cloruro di sodioSigmaS9888
cloruro di potassioSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NameAziendaNumero di catalogoComments
Kit di colorazione dell'argentoInvitrogenLC6070
XL

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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