Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution

Gisela Beutner; George Arthur Porter Jr.

doi:10.3791/55738

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Articolo metodologico

Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution

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DOI:

10.3791/55738

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1 giugno 2017

Gisela Beutner¹ , George Arthur Porter Jr.¹

¹Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la separazione dei complessi funzionali della catena di trasporto elettronico mitocondriale (Cx) IV e dei suoi supercomplexi utilizzando l'elettroforesi nativa per rivelare informazioni sulla loro struttura e struttura. Il gel nativo può essere sottoposto a immunoblotting, analisi in-gel e purificazione mediante elettroelution per caratterizzare ulteriormente i singoli complessi.

Abstract

La catena di trasporto elettronico mitocondriale (ETC) trasforma l'energia derivata dalla rottura di vari combustibili nella valuta bioenergetica della cellula, ATP. L'ETC è composto da 5 complessi proteici massicci, che si riuniscono anche in supercomplexes chiamati respirasomi (CI, C-III e C-IV) e sintasi (CV) che aumentano l'efficienza del trasporto di elettroni e della produzione di ATP. Sono stati utilizzati diversi metodi per oltre 50 anni per misurare la funzione ETC, ma questi protocolli non forniscono informazioni sull'assemblaggio di singoli complessi e supercomplex. Questo protocollo descrive la tecnica dell'elettroforesi genica gel poliacrilammide (PAGE), un metodo modificato più di 20 anni fa per studiare la struttura complessa di ETC. L'elettroforesi nativa consente la separazione dei complessi ETC nelle loro forme attive, e questi complessi possono essere studiati utilizzando immunoblotting, test in-gel (IGA) e purificazione mediante elettroelution. Combinando il reI risultati di un gel nativo PAGE con quelli di altri test mitocondriali, è possibile ottenere un quadro completo dell'attività ETC, del suo assemblaggio dinamico e dello smontaggio e come questo regola la struttura e la funzione mitocondriale. Questo lavoro discuterà anche i limiti di queste tecniche. In sintesi, la tecnica della PAGE nativa, seguita da immunoblotting, IGA e elettroelution, presentata sotto, è un modo potente per studiare la funzionalità e la composizione dei supercomplex mitocondriali ETC.

Introduzione

L'energia mitocondriale sotto forma di ATP non è solo essenziale per la sopravvivenza cellulare, ma anche per la regolazione della morte cellulare. La generazione di ATP da fosforilazione ossidativa richiede una catena funzionale di trasporto di elettroni (ETC; Cx-I-IV) e mitocondriale ATP sintasi (Cx-V). Recenti studi hanno dimostrato che questi grandi complessi proteici sono organizzati in supercomplex, chiamati respirasomi e sintasi ¹ ^, ² . È impegnativo analizzare l'assemblaggio, la dinamica e la regolazione delle attività di questi complessi e supercomplexi massicci. Mentre le misurazioni del con....