Articolo metodologico

Preparazione di vescicole a membrana plasmatica da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo per potenziali terapie di sostituzione del citoplasma

DOI:

10.3791/55741

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18 maggio 2017

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1Multidisciplinary Research Center, Shantou University

In questo articolo

Sommario

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Le malattie legate all'età sono associate a più difetti nei componenti del citoplasma. Qui presentiamo un protocollo per preparare vescicole a membrana plasmatica dalle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo. Questa tecnica potrebbe essere potenzialmente utilizzata come mezzo di terapia sostitutiva per citoplasma per migliorare o addirittura invertire i fenotipi associati all'età.

Abstract

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Abbiamo già riferito sulla generazione di vescicole a membrana plasmatica (PMV) attraverso l'estrusione meccanica delle cellule dei mammiferi. La fusione di PMV con cellule Rho0 carenti di mitocondriali ha ripristinato l'attività mitotica in condizioni normali di coltura. L'aterosclerosi, il diabete di tipo 2, la malattia di Alzheimer e il cancro sono malattie legate all'età che sono state riportate per essere associate a più difetti meccanici e funzionali nel citosolo e negli organelli di una varietà di tipi di cellule. Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) rappresentano una popolazione cellulare unica dal midollo osseo che possiede capacità di auto-rinnovamento pur mantenendo la loro multipotenza. L'integrazione di cellule di senescenza con giovane citoplasma da BMSC autologhe attraverso la fusione di PMV fornisce un approccio promettente per migliorare o addirittura invertire i fenotipi associati all'età. Questo protocollo descrive come preparare PMV da BMSC tramite estrusione attraverso una membrana policarbonato con 3Determinare l'esistenza di mitocondri e esaminare la conservazione del potenziale delle membrane all'interno di PMV usando un microscopio confocale, concentrare PMV mediante centrifugazione e effettuare l'iniezione in vivo di PMV nel muscolo gastrocnemico dei topi.

Introduzione

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Una grande quantità di sforzi è stata dedicata alla creazione di approcci per terapie di sostituzione di geni, enzimi e cellule. Ciò ha portato a grandi scoperte e persino alle applicazioni cliniche 1 , 2 , 3 . Recentemente, una controversa terapia sostitutiva di mitocondri basata sulla tecnologia di trasferimento del nucleo è stata applicata alla fecondazione in vitro per le donne di età avanzata o con una mutazione letale del DNA mitocondriale 4 . I difetti riscontrati nelle malattie legate all'età, tra cui l'aterosclerosi, il....

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Protocollo

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I topi BALB / c da 8 a 12 settimane sono stati acquistati da Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, Cina) e raccolti in una struttura specifica per gli animali patogeni e climatizzata. La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state conformi agli orientamenti per l'uso e la cura degli animali da laboratorio istituiti dall'Università Shantou.

1. Montaggio dell'apparecchio

  1. Per garantire la sterilità, accendere la luce UV di un cofano di tessuto per 30 minuti prima dell'uso.
  2. Svitare un gruppo filtrante da 25 mm e immergere il tappo e il fondo dell'unità in una tazza di vetro da 20....

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Risultati

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La chiave per una buona preparazione dei PMV dipende fortemente dal corretto montaggio dell'unità filtrante ( Figura 1 ), che può essere testato spingendo 1 mL di PBS attraverso la membrana. Se si verifica una perdita, riassemblare l'unità filtrante e provare nuovamente. Tuttavia, la perdita può essere verificata solo in modo affidabile quando le cellule vengono spinte attraverso la membrana. Se solo pochi PMV vengono rilevati sotto un normale microscopio utilizzando l'o.......

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Discussione

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La terapia sostitutiva del citoplasma, come proposta in questo manoscritto, presenta vantaggi unici rispetto ad altri approcci riportati come la terapia genica, molecolare e cellulare. I PMV generati dalle BMSC incapsulano non solo i prodotti dei geni della staminalità, ma anche gli organelli cellulari intatti, che sono essenziali per rimediare ai fenotipi di invecchiamento associati alla senescenza. Quando il citoplasma giovane viene consegnato alle cellule senescenti, i meccanismi di malfunzionamento possono ottenere u.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione Li Ka Shing, il Guangdong University High Level Project "Green Technologies for Marine Industries", la Fondazione della Scienza Naturale della Cina (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) e il Dipartimento per l'istruzione del Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Membrane IsoporeTMMilliporeTSTP047003 mm pore
Unità filtrante monousoXinya, Shanghai, Cinainsulina in polipropilene per uso medicoda 25 mm
BD3284461 mL
pN1-EGFPClontech  6085-1
Sonde molecolariMitoTrackerM7514Verde FM, 1 μ M
JC-1Beyotime, Haimen, CinaC200610 mg/mL
CM-DiIBeyotime, Haimen, CinaC103610 mM
PEISigmaP3143Mn = 75.000
Microscopio a fluorescenzaNikonEclipse TE 2000Con fotocamera CCD
Microscopio ConfocolCarl ZeissLSM 510 Meta
PolyJetSigaGenSL100688Per la trasfezione cellulare
Siringa da

Riferimenti

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  1. Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
  2. Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Soli....

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Estrusione meccanicaMicroscopia confocalePotenziale di membrana mitocondrialeConcentrazione per centrifugazioneIniezione nel muscolo gastrocnemioMarcatura fluorescenteColorazione con colorante mitocondriale

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