Preparazione di vescicole a membrana plasmatica da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo per potenziali terapie di sostituzione del citoplasma

Sommario

Le malattie legate all'età sono associate a più difetti nei componenti del citoplasma. Qui presentiamo un protocollo per preparare vescicole a membrana plasmatica dalle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo. Questa tecnica potrebbe essere potenzialmente utilizzata come mezzo di terapia sostitutiva per citoplasma per migliorare o addirittura invertire i fenotipi associati all'età.

Abstract

Abbiamo già riferito sulla generazione di vescicole a membrana plasmatica (PMV) attraverso l'estrusione meccanica delle cellule dei mammiferi. La fusione di PMV con cellule Rho0 carenti di mitocondriali ha ripristinato l'attività mitotica in condizioni normali di coltura. L'aterosclerosi, il diabete di tipo 2, la malattia di Alzheimer e il cancro sono malattie legate all'età che sono state riportate per essere associate a più difetti meccanici e funzionali nel citosolo e negli organelli di una varietà di tipi di cellule. Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) rappresentano una popolazione cellulare unica dal midollo osseo che possiede capacità di auto-rinnovamento pur mantenendo la loro multipotenza. L'integrazione di cellule di senescenza con giovane citoplasma da BMSC autologhe attraverso la fusione di PMV fornisce un approccio promettente per migliorare o addirittura invertire i fenotipi associati all'età. Questo protocollo descrive come preparare PMV da BMSC tramite estrusione attraverso una membrana policarbonato con 3Determinare l'esistenza di mitocondri e esaminare la conservazione del potenziale delle membrane all'interno di PMV usando un microscopio confocale, concentrare PMV mediante centrifugazione e effettuare l'iniezione in vivo di PMV nel muscolo gastrocnemico dei topi.

Introduzione

Una grande quantità di sforzi è stata dedicata alla creazione di approcci per terapie di sostituzione di geni, enzimi e cellule. Ciò ha portato a grandi scoperte e persino alle applicazioni cliniche ^{1 , 2 , 3} . Recentemente, una controversa terapia sostitutiva di mitocondri basata sulla tecnologia di trasferimento del nucleo è stata applicata alla fecondazione in vitro per le donne di età avanzata o con una mutazione letale del DNA mitocondriale ⁴ . I difetti riscontrati nelle malattie legate all'età, tra cui l'aterosclerosi, il diabete di tipo 2, la malattia di Alzheimer e il cancro, sono di solito multi-faceted. È stato documentato che l'accumulo di gocce lipidiche; La deposizione di proteine ​​amiloide; La conservazione delle proteine ​​dispiegate nel reticolo endoplasmatico; E proteasomi difettosi, autofaggo e mitocondri contribuiscono allo sviluppo o all'aggravamento di queste malattie"Xref"> 5 ^{, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . Attualmente, non esiste un meccanismo disponibile per la rimozione diretta del malfunzionamento nel citosolo e negli organi, che provoca senescenza e fenotipi di invecchiamento.

Abbiamo già riferito sulla generazione di vescicole a membrana plasmatica (PMV) attraverso l'estrusione meccanica delle cellule dei mammiferi ¹² . Ad eccezione del nucleo, i componenti della membrana o del citosolo, tra cui proteine ​​e RNA, nonché gli organelli, come i mitocondri, sono stati trovati nei PMV. In sostanza, un PMV può essere considerato come una cellula enucleata in miniatura. Ancora più importante, la fusione di PMV con cellule Rho0 carenti di mitocondri ha ripristinato l'attività mitotica in normali condizioni di coltura. Questa è la prima relazione su establiUn approccio potenzialmente efficiente per la terapia sostitutiva del citoplasma.

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) sono cellule progenitrici multipotenti generate genericamente dal midollo osseo e sono facilmente espandibili nella coltura. I marcatori delle cellule staminali embrionali Oct4, Nanog e SOX2 sono stati rilevati a bassi livelli nei MSC ¹³ . L'attività della telomerasi è anche misurabile. Inoltre, l'assenza di molecole coestimolanti e molecole di Classe II dell'antigene delle cellule umane (HLA), nonché la bassa espressione di HLA di classe I su MSC, li rendono le cellule ideali per l'uso allogeneico o "off-the-shelf" Sia la medicina rigenerativa che le applicazioni immunomodulatorie ¹⁴ .

Qui descriviamo come preparare PMV da BMSC del mouse attraverso l'estrusione attraverso una membrana di policarbonato con pori da 3 μm, determinare l'esistenza di mitocondri e esaminare la manutenzione del potenziale delle membrane nei PMV utilizzando confocAl microscopio, preparare PMV concentrati ma non aggregati per centrifugazione e effettuare l'iniezione in vivo di PMV nel muscolo gastrocnemico dei topi.

Protocollo

I topi BALB / c da 8 a 12 settimane sono stati acquistati da Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, Cina) e raccolti in una struttura specifica per gli animali patogeni e climatizzata. La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state conformi agli orientamenti per l'uso e la cura degli animali da laboratorio istituiti dall'Università Shantou.

1. Montaggio dell'apparecchio

1. Per garantire la sterilità, accendere la luce UV di un cofano di tessuto per 30 minuti prima dell'uso.
2. Svitare un gruppo filtrante da 25 mm e immergere il tappo e il fondo dell'unità in una tazza di vetro da 200 ml riempita di etanolo al 75% per 30 minuti. L'unità è in polipropilene di grado medico.
3. Raccogliere il tappo e il fondo dell'unità utilizzando le pinze, scuotere manualmente l'etanolo rimanente e lasciare asciugare le parti per 10 minuti nel cofano.
4. Bagnare una membrana in policarbonato da 19 mm in PBS e collocarla accuratamente sulla parte superiore della matrice di supporto del bottoM dell'unità. La pellicola polimerica presenta una superficie liscia e piana e pori a tracolla 3 μm.
5. Riassemblare l'unità avvolgendo il cappuccio strettamente contro il fondo. Assicurarsi che la membrana non sia dislodata dal centro.
6. Rimuovere l'ago di una siringa da 1 ml di insulina e prelevare 1 ml di PBS. Fissare la siringa all'unità filtrante e quindi spingere PBS attraverso l'unità per bagnare l'assemblaggio e verificare se c'è qualche perdita.

2. Generazione di vescicole a membrana plasmatica (PMV)

1. Stabilire una cultura BMSC, come riportato da Nemeth et al. ¹⁵ , in mezzo di coltura DMEM contenente il 15% di FBS e l'1% di penicillina / streptomicina. Coltivare le cellule in un piatto a 6 pozzetti in un incubatore umidificato contenente 5% di CO ₂ a 37 ° C.
2. Per propagare le cellule, rimuovere il mezzo di coltura e sciacquare il pozzetto con 0,5 ml di PBS privo di calcio.
3. Aggiungere 0,5 mL di 0,25% di trysina-EDTA e incubare le cellule a 37 ° CPer 3 min. Toccare la piastra contro il palmo della mano un paio di volte per facilitare il distacco delle cellule. Fermare la digestione aggiungendo 1 ml di terreno di coltura.
4. Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 2 min in una centrifuga a banco. Resuspendere le cellule in 4 mL di terreno di coltura e trasferire le cellule in due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti.
   NOTA: Le cellule solitamente raggiungono la confluenza a circa 24 h.
5. Per generare PMV, raccogliere le cellule da un pozzetto (circa 5 x 10 ⁵ cellule) di una piastra a 6 pozzetti mediante la digestione della tripsina e monodispersa le cellule in 0,5 mi di terreno di coltura.
6. Caricare le cellule nella siringa dell'insulina, collegarla all'unità filtrante e spingere rapidamente lo stantuffo per spremere le cellule attraverso il filtro. Scartare il mezzo estruso poiché dovrebbero essere solo pochi PMV all'interno di esso.
7. Caricare altri 0,5 ml di mezzo nella siringa e spingerlo rapidamente attraverso il filtro. Raccolto il mezzo della seconda estrusione, che contengonoI PMV di varie dimensioni.
8. Caricare 150 μl del mezzo raccolto in un piatto di vetro da 35 mm e lasciare che i PMV si affacciano sul fondo per circa 10 minuti. Esaminare i PMV sotto un microscopio di contrasto a fase invertito dotato di una telecamera CCD usando la lente obiettivo 20X.

3. Esame del contenuto all'interno dei PMV utilizzando la microscopia confocale

1. Per eseguire la trasfezione nei BMSCs, diluire 2 μg di DNA plasmidico supercoiled e 6 μl di reagente di transazione cationico ( ad esempio, PolyJet) in 50 μL di DMEM senza siero. Vortex per mescolare bene e spin brevemente per raccogliere tutto il liquido dai lati del tubo.
2. Aggiungere la soluzione diluita (dal punto 3.1) a goccia in soluzione DNA diluita, vortex forte per 1 min, spin brevemente e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
3. Sostituire il vecchio mezzo sui BMSCs, che sono stati seminati a confluenza di circa il 30% durante la notte, con 2 ml di terreno di coltura fresco e aggiungere DNUna miscela di trasfezione in goccia.
4. Sostituire con 2 ml di mezzo fresco dopo 12 ore di trasfezione.
5. Per tracciare proteine ​​citoplasmaticamente localizzate, trasfettano le cellule con il plasmide contenente una cassetta di espressione EGFP (pEGFP-N1), come descritto in precedenza. Raccogliere le cellule dalla digestione della tripsina 48 h dopo la trasfezione per la produzione di PMV, come descritto in precedenza.
6. Per tracciare i mitocondri, macchia le cellule con colorante mitocondriale (1 μM, MitoTracker) in terreno di coltura fresco per 30 minuti a 37 ° C.
7. Per rilevare il potenziale di membrana dei mitocondri, macchiare le cellule con il colorante cianina JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraetilbenzimidazolilcarbocyanin ioduro) (10 μg / ML) in terreno di coltura fresco per 30 minuti a 37 ° C.
   1. Lavare le cellule con 0,5 mL di PBS tre volte e raccogliere le cellule per la digestione della tripsina per la produzione di PMV, come descritto sopra.
   2. Caricare 150 μL della raccolta medIn un piatto di vetro da 35 mm e lasciare che i PMV si affacciano sul fondo per circa 10 minuti. Esaminare i PMV sotto un microscopio confocale utilizzando l'obiettivo obiettivo olio 100X.
8. Per rilevare EGFP o il colorante mitocondriale, accendere il laser a 488 nm e raccogliere il segnale a 505-530 nm. Per rilevare JC-1, attivare i laser a 488 nm e 543 nm e raccogliere segnali a 505-530 nm e 560-615 nm. Impostare il valore del pinhole intorno a 1,4.

4. Preparazione di PMV concentrati mediante centrifugazione

1. Raccogliere le cellule dalla digestione della tripsina e generare PMVs, come sopra descritto, in 0,5 ml di terreno di coltura.
2. Spin i PMV a 1.200 xg in una centrifuga a benchtop per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cautela il surnatante e risospendere il pellet in 100 μl di terreno di coltura con delicatissimi vortici.
3. Caricare 50 μL di PMV in un piatto di vetro da 35 mm e lasciarli lasciarli a temperatura ambiente per circa 10 minuti. Esaminare i PMVSotto un microscopio confocale con l'obiettivo obiettivo olio 40X.
4. Aggiungere la serie di soluzione di polietilenimino diluito (PEI) alla coltura BMSC per 1 h e verificare i segni di citotossicità.
   NOTA: qui, il PEI a 2 μg / mL è stato scelto in quanto nessun segno di tossicità è stato rilevato nei BMSCs.
5. Raccogliere le cellule dalla digestione della tripsina e aggiungere PEI a 2 μg / mL per 1 h per caricare la membrana cellulare come mezzo per prevenire l'aggregazione. Generare PMVs, come sopra descritto, in 0,5 mL di terreno di coltura. Concentrare i PMV e esaminarli sotto un microscopio confocale, come sopra descritto.

5. Iniezione dei PMV nel muscolo Gastrocnemius

1. Per macchiare la membrana aggiungere colorante CM-DiI (clorometil-di-alchil-indocarbocyanina) (10 μM) in 1 ml di terreno di coltura fresco ai BMSC per 30 min.
2. Raccogliere le cellule (circa 5 x 10 ⁵ ) dalla digestione della tripsina e riposarle in 0,5 mL di terreno di coltura. Aggiungere PEI (2 μg / mL) per 1h. Generare e concentrare i PMV in 100 μl di terreno di coltura, come sopra descritto.
3. Anestetizza un topo BALB / c iniettando il barbital di sodio (10 mg / kg) dopo 12 ore di digiuno.
4. Pulire l'esterno del muscolo gastrocnemius con il 75% di etanolo. Iniettare lentamente i PMV (100 μL) nel muscolo gastrocnemius usando una siringa per insulina da 30 g.
5. Dopo aver somministrato l'anestesia, posizionare una garza bagnata sugli occhi per tutta la durata dell'esperimento e riscaldare il mouse con una luce incandescente fino a quando si sveglia. Lasciate il mouse solo in una gabbia di ventilazione individuale.
6. Per raccogliere il muscolo gastrocnemius dopo 12 ore, uccidere il mouse dalla dislocazione cervicale.
7. Spruzzare il 75% di etanolo sopra il muscolo gastrocnemius, aprire la pelle con le forbici e tagliare l'intero muscolo gastrocnemius a entrambe le estremità.
8. Sciacquare il muscolo con PBS e esaminarlo sotto un microscopio a fluorescenza usando la lente obiettivo 20X.
9. Tagliare il muscolo con unLama di rasoio tagliente per rimuovere le parti senza fluorescenza. Tagliare le parti con una forte fluorescenza rossa in circa 9 mm di ³ cubetti.
10. Incorporare ogni cubo in ottima temperatura di taglio (OCT), immergerlo in azoto liquido per 5 minuti e conservarlo in un congelatore da -20 ° C fino all'uso.
11. Tagliare le sezioni congelate in pezzi di 20 μm utilizzando un criostato e aderire ogni sezione ad una lastra di vetro. Sciacquare la sezione una volta con PBS.
12. Disegnare un cerchio intorno alla sezione con una penna a cerchio e aggiungere 100 μL di DAPI (1 μg / mL). Aspirare la soluzione DAPI dopo 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente al buio e lavare tre volte con PBS.
13. Far cadere l'olio sopra il campione, coprirlo con una scotta di vetro e sigillare la scivola con unghie. Esaminare la sezione sotto un microscopio confocale utilizzando l'obiettivo obiettivo olio 100X.
14. Per rilevare CM-DiI, accendere il laser a 543 nm e raccogliere il segnale a 560-615 nm. Per rilevare DAPI, accendere il 405Nm laser e raccogliere il segnale a 420-480 nm. Impostare il valore del pinhole a circa 1,4.

Risultati

La chiave per una buona preparazione dei PMV dipende fortemente dal corretto montaggio dell'unità filtrante ( Figura 1 ), che può essere testato spingendo 1 mL di PBS attraverso la membrana. Se si verifica una perdita, riassemblare l'unità filtrante e provare nuovamente. Tuttavia, la perdita può essere verificata solo in modo affidabile quando le cellule vengono spinte attraverso la membrana. Se solo pochi PMV vengono rilevati sotto un normale microscopio utilizz...

Discussione

La terapia sostitutiva del citoplasma, come proposta in questo manoscritto, presenta vantaggi unici rispetto ad altri approcci riportati come la terapia genica, molecolare e cellulare. I PMV generati dalle BMSC incapsulano non solo i prodotti dei geni della staminalità, ma anche gli organelli cellulari intatti, che sono essenziali per rimediare ai fenotipi di invecchiamento associati alla senescenza. Quando il citoplasma giovane viene consegnato alle cellule senescenti, i meccanismi di malfunzionamento possono ottenere u...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Membrane IsoporeTM	Millipore	TSTP04700	3 mm pore
Unità filtrante monouso	Xinya, Shanghai, Cina	insulina in polipropilene per uso medico	da 25 mm
	BD	328446	1 mL
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
Sonde molecolari	MitoTracker	M7514	Verde FM, 1 μ M
JC-1	Beyotime, Haimen, Cina	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime, Haimen, Cina	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75.000
Microscopio a fluorescenza	Nikon	Eclipse TE 2000	Con fotocamera CCD
Microscopio Confocol	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	Per la trasfezione cellulare

Siringa da