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Articolo metodologico

Studiare l'espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule

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⸱

DOI:

10.3791/55745

⸱

6 giugno 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Riportiamo due protocolli di sincronizzazione delle celle che forniscono un contesto per studiare eventi legati a fasi specifiche del ciclo cellulare. Mostriamo che questo approccio è utile per analizzare la regolazione di geni specifici in un ciclo cellulare non selettivo o su esposizione ad agenti che interessano il ciclo cellulare.

Abstract

Il programma di espressione genica del ciclo cellulare rappresenta un passo fondamentale per comprendere i processi dipendenti dal ciclo cellulare e il loro ruolo in malattie come il cancro. L'analisi dell'espressione genica a ciclo-regolazione cellulare dipende dalla sincronizzazione cellulare in fasi specifiche. Qui descriviamo un metodo che utilizza due protocolli complementari di sincronizzazione comunemente usati per studiare la variazione periodica dell'espressione genica durante il ciclo cellulare. Entrambe le procedure sono basate sul blocco temporaneo del ciclo cellulare in un punto definito. Il protocollo di sincronizzazione con il trattamento con idrossiurea (HU) porta all'arresto cellulare nella fase tardiva G1 / fase iniziale S e la liberazione dall'arresto mediato da HU fornisce una popolazione cellulare che procede uniformemente attraverso S e G2 / M. Il protocollo di sincronizzazione da parte di timidina e nocodazolo (Thy-Noc) blocca le cellule in fase iniziale di mitosi e rilascio da arresto mediato da Thy-Noc fornisce una popolazione cellulare sincronizzata adatta per la fase G1 e la fase SProva gli studi. L'applicazione di entrambe le procedure richiede il monitoraggio dei profili di distribuzione del ciclo cellulare, che viene tipicamente eseguito dopo la colorazione del ioduro di propidium (PI) delle cellule e l'analisi della citometria a flusso analizzata del contenuto del DNA. Mostriamo che l'uso combinato di due protocolli di sincronizzazione è un approccio robusto per determinare chiaramente i profili trascrizionali di geni regolati in modo differenziato nel ciclo cellulare ( cioè E2F1 e E2F7) e di conseguenza avere una migliore comprensione del loro ruolo nel ciclo cellulare processi. Inoltre, dimostriamo che questo approccio è utile per lo studio di meccanismi che stanno alla base di terapie a base di droga ( cioè mitomicina C, un agente anticancro), perché consente di discriminare i geni che rispondono all'agente genotossico da quelli esclusivamente colpiti dalle perturbazioni del ciclo cellulare Imposto dall'agente.

Introduzione

La transizione attraverso tutte le fasi del ciclo cellulare è accoppiata ad un programma di espressione genica fortemente regolamentato. Si ritiene che questa coordinata "on and off" della trascrizione genica per tutto il ciclo cellulare sia sotto il controllo di sistemi regolatori transcrittivi complessi, che regola non solo la tempistica ma anche i livelli di espressione genica. La deregulation dei componenti chiave del ciclo cellulare è noto per contribuire allo sviluppo di diverse malattie ed è un segno distintivo ben consolidato della tumorigenesi 1 , 2 . Le analisi trascrizionali a livello genomico effettuate nelle cellule di lieviti e mammiferi hanno rivelato che un gran numero di geni mostrano pattern periodici di espressione genica nel ciclo cellulare, suggerendo che la fluttuazione trascrizionale durante il ciclo cellulare è un riflesso del requisito temporale di un determinato prodotto genico In una fase precisa 3 , 4 , 5 .

Un compito importante nello studio dell'espressione genica del ciclo cellulare è la sincronizzazione delle cellule in fasi specifiche del ciclo cellulare. La sincronizzazione delle cellule aiuta a interpretare l'associazione di un modello di espressione genica a una particolare transizione di fase del ciclo cellulare e ha portato ad una migliore comprensione della regolazione e della funzione di numerosi geni. La sincronizzazione cellulare è anche importante per studiare il meccanismo d'azione dei farmaci antitumorali, in quanto gli agenti chemioterapici sono noti per influenzare sia l'espressione genica, sia la cinetica del ciclo cellulare 6 , 7 . Tuttavia, è spesso difficile determinare se le differenze di espressione genica risultanti dal trattamento con questi agenti sono una risposta diretta al trattamento o sono semplicemente la conseguenza dei cambiamenti nei profili del ciclo cellulare. Per distinguere tra queste possibilità, l'espressione genica deve essere analizzata in cellule che sono state sYnchronized prima dell'aggiunta del farmaco chemioterapico.

Ad eccezione di alcune cellule primarie come le cellule linfoidi appena isolate, che costituiscono una popolazione cellulare omogenea sincronizzata in G08, le linee cellulari stabilite in vitro crescono in modo asincrone nella cultura. In condizioni di crescita regolare, queste cellule cicliche asincrono si trovano in tutte le fasi del ciclo cellulare, ma preferibilmente in G1 9 . Pertanto, questo contesto non fornisce uno scenario ottimale per analisi funzionale o di espressione genica in una fase specifica del ciclo cellulare ( ad esempio G1, S, ecc.). Le linee cellulari immortalizzate non trasformate ( ad es. Fibroblasti) possono essere sincronizzate con i cosiddetti metodi fisiologici 10 . Questi metodi sono basati sulle caratteristiche delle cellule primarie mantenute delle cellule non trasformate, come l'inibizione del contatto cellulare e la dipendenza del fattore di crescita per continuare la ciclizzazione. RimozioneDel siero in combinazione con inibizione del contatto rende le cellule non trasformate arrestate a G0 / G1. Tuttavia, l'ingresso e la progressione del ciclo cellulare sincronizzato richiede spesso la subcultura, che prevede anche il distacco artificiale delle cellule e la ri-placcatura 10 . Il più importante, questo metodo non è adatto per la sincronizzazione di linee cellulari trasformate, la stragrande maggioranza delle linee cellulari esistenti attualmente in uso, caratterizzata per la mancanza di inibizione della crescita mediata dal contatto cellulare o risposta al ritiro del fattore di crescita. Quindi, è chiaro che sono necessari metodi alternativi per un'efficiente sincronizzazione delle cellule in fasi specifiche del ciclo cellulare. In termini generali, i metodi di sincronizzazione più utilizzati sono basati sull'inibizione chimica o farmacologica transitoria di un punto definito del ciclo cellulare, tipicamente la sintesi del DNA o la formazione di mandrini mitotici. L'inibizione della sintesi del DNA sincronizza le cellule arrestandole nella fase tardiva G1 o in fase iniziale S. Questo può essere achiEvitando l'aggiunta di composti come mimosina, inibitore della biosintesi nucleotida 11,12, afidicolina, inibitore delle DNA polimerasi 13 , 14 , idrossiacuri, inibitore della ribonucleotide reduttasi 15 , 16 o in eccesso di timidina 17 , 18 . D'altra parte, gli inibitori della polimerizzazione del microtubulo, come la colchicina o il nocodazolo, sono in grado di bloccare la formazione di mandrini mitotici che conducono alla sincronizzazione cellulare all'inizio della fase M 19 , 20 , 21 .

In questo lavoro descriviamo un metodo che coinvolge due protocolli complementari di sincronizzazione basati sull'inibizione chimica transitoria per studiare l'espressione dei geni regolati dal ciclo cellulare all'MRNAlivello. Questo metodo è fondamentale per definire il ruolo dei geni del ciclo cellulare nei processi specifici del ciclo cellulare. Inoltre, fornisce un quadro generale per studiare l'impatto dei trattamenti antitumorali al fine di rilevare accuratamente i geni reattivi di droga e minimizzare le interpretazioni erronee derivanti da perturbazioni nella progressione del ciclo cellulare generato da questi farmaci.

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Protocollo

1. Sincronizzazione cellulare, rilascio e monitoraggio della progressione del ciclo cellulare

  1. Sincronizzazione e rilascio di cellule U2OS a base di timidina e nocodazolo (Thy-Noc) dalla mitosi
    1. Preparare il mezzo di coltura della cellula desiderato. Le cellule U2OS vengono coltivate regolarmente nel mezzo di DMEM-glutamina integrato con il 10% (vol / vol) FBS (opzionale: 1% di penicillina / streptomicina). Eseguire tutta la preparazione e manipolazione media in condizioni sterili e riscaldare il mezzo complementare (da ora in poi denominato "mezzo completo") a 37 ° C prima dell'uso.
    2. Seme 2 x 10 6 cellule U2OS per piatto da 100 mm in 10 ml di media completa di coltura. Per calcolare il numero di piatti necessari, prendere in considerazione che ciascun piatto da 100 mm in genere fornisce sufficienti celle mitotiche per ricaricare circa 5 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti (0,2 - 0,25 x 10 6 cellule / pozzetto) (vedi Figura 1B ). Sono necessari due pozzetti per punto temporale selezionatoNell'esperimento (1 pozzo per l'estrazione di RNA e 1 pozzo per il monitoraggio del ciclo cellulare). Inoltre, un terzo pozzo può essere raccolto per punto di tempo per l'analisi proteica.
      NOTA: Celle di piastre alla sera (intorno alle 19.00) in modo che i passaggi successivi possano essere eseguiti durante le ore lavorative nei giorni successivi. Includere 2 pozzetti aggiuntivi di cellule in ascolto crescente per definire le impostazioni di compensazione dell'analisi FACS.
    3. Lasciare che le cellule attaccano incubando i piatti da 100 mm a 37 ° C in un'atmosfera umidificata con 5% di CO 2 per 24 h.
    4. Per il blocco di timidina, preparare una soluzione di stock di timidina da 200 mM sciogliendo 145,2 mg di polvere timidina in 3 mi di H 2 O (o in quantità equivalenti) e sterilizzare la soluzione filtrando attraverso un filtro di dimensione pari a 0,2 μm. Il leggero riscaldamento potrebbe aiutare a sciogliere la timidina. Aggiungere 100 μL dello stock di 200 mM appena preparati ad ogni piatto di coltura da 100 mm (concentrazione finale 2 mM). Incubare le cellule con timidina per 20 h a 37 ° C76 ° C in atmosfera umidificata con 5% CO 2 .
      NOTA: Trattare le cellule alla sera (intorno alle 19.00) per avere il tempo per eseguire il rilascio della timidina e bloccare il nocodazolo il giorno successivo.
    5. Per uscire dal blocco di timidine, rimuovere il mezzo di crescita contenente timidina nel pomeriggio del giorno successivo (ore 15); Lavare le cellule due volte con 1x PBS preriscaldato e aggiungere 10 ml di mezzo completo a ogni piatto da 100 mm. Incubare le cellule per 5 h a 37 ° C in un'atmosfera umidificata con 5% CO 2 .
    6. Per l'arresto cellulare mitotico, aggiungere nocodazolo ad una concentrazione finale di 50 ng / mL (8 pm). Preparare una soluzione di stock dissolvendo la polvere di nocodazolo in DMSO ( es. 5 mg / ml) e conservare congelato a -20 ° C. Incubare le cellule con nocodazolo per non più di 10-11 h a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% CO 2 .
    7. Rilascio dall'arresto mediato dal nocodazolo nella fase iniziale M (scossa mitotica) e raccolta di campioni in più tempo poiNts (a partire dalle ore 6-7).
      1. Staccare le cellule arrotondate (mitotiche) scuotendo ogni piastra e pipettando delicatamente il mezzo di crescita contenente nocodazolo. Raccogliere il mezzo con cellule staccate da ogni piastra da 100 mm in tubi sterili da 50 ml, centrifugare (300 xg, 5 min, temperatura ambiente) e lavare le cellule due volte con l'aggiunta di 1x PBS seguita da centrifugazione. È consigliabile utilizzare PBS o PBS più nocodazolo a freddo per evitare lo slittamento mitotico (vedere sezione Discussione).
      2. Resuspendere le cellule mitotiche raccolte da ogni piastra da 100 mm in 10 ml di mezzo completo. Salvare 2 mL per l'estrazione di RNA e 2 mL per l'analisi FACS per il tempo di 0 h (circa 0,2-0,25 x 106 cellule per campione).
      3. Ricostruire le cellule mitotiche rimanenti per i punti temporali successivi in ​​piastre a 6 pozzetti (2 mL / pozzetto, 0,2-0,25 x 10 6 cellule / pozzetto).
        NOTA: Ricorda che sono necessari due pozzetti per ogni punto temporale selezionato (1 per RNA e 1 per l'analisi FACS).
    8. Raccogli i campioni a selI punti temporali. Ogni 1,5 - 3 ore è raccomandato per ottenere un profilo adeguato della progressione del ciclo cellulare.
      1. Per l'estrazione del RNA, rimuovere il mezzo, sciacquare bene con 2 ml di PBS preriscaldato 1x e aggiungere 1 ml di reagente di isolamento RNA appropriato ( es. TRIzol) nel pozzetto (eseguire quest'ultima fase in un armadietto di sicurezza per le sostanze chimiche). Pipettare verso l'alto e verso il basso per staccare e lire le cellule, trasferire il lisato cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, incubare 5 minuti a RT e memorizzare il tubo a -80 ° C fino ad un ulteriore utilizzo.
      2. Per l'analisi FACS sciacquare bene con 2 ml di PBS preriscaldato 1x, aggiungere la soluzione di Trypsin-EDTA preriscaldata (0,3 mL / pozzetto) per staccare le cellule, bloccare Trypsin-EDTA aggiungendo 1 ml di mezzo completo e raccogliere ogni campione in un Tubo da 15 ml.
        1. Centrifugare le cellule (300 xg, 5 min, RT), salvare il pellet cellulare e scartare il supernatante. Al fine di bloccare le cellule, risospendere le cellule in 1 mL di etanolo refrigerato di 70% (v / v) in 1x PBS provocando dolcemente i tubi di vortex e metterli in ghiaccio per app15 min prima della conservazione a 4 ° C o alla colorazione per ulteriore analisi da FACS (descritta nei passaggi 1.4 - 1.5).
  2. Sincronizzazione basata su HU e rilascio delle celle U2OS dal confine G1 / S
    1. Preparare il mezzo completo di coltura cellulare come descritto nel punto 1.1.
    2. Seme 0,25 x 10 6 cellule U2OS per pozzetto in 6 pozzetti (2 ml di media di coltura completa per pozzetto). Per calcolare il numero di pozzetti necessari per l'esperimento, prendere in considerazione che saranno necessari due pozzetti per punto temporale selezionato (1 pozzo per l'estrazione di RNA e 1 pozzetto per il monitoraggio del ciclo cellulare) e che due pozzetti aggiuntivi di cellule in ascolto crescente sono Necessario definire le impostazioni di compensazione dell'analisi FACS.
    3. Lasciare le cellule attaccare incubando le piastre a 6 pozzetti per notte (O / N) a 37 ° C in un'atmosfera umidificata con 5% CO 2 .
    4. Rimuovere il mezzo completo dai pozzetti la mattina successiva e aggiungere 2 mlDi materiale DMEM-Glutamina privo di FBS preriscaldato per pozzetto. Incubare le cellule per altri 24 h a 37 ° C in un'atmosfera umidificata con 5% di CO 2 .
      NOTA: eseguire questo passaggio in tutti i pozzetti tranne 2 (quelli salvati per definire le impostazioni FACS). La fase di ritiro del siero può essere omessa se si ottiene una sincronizzazione efficiente semplicemente incubando le cellule con HU.
    5. Arresto del ciclo cellulare G1 / S con HU.
      1. Preparare la soluzione di riserva HU fresca (500 mM) prima di ogni uso. Aggiungere 2 ml di H 2 O a 76,06 mg di polvere HU e mescolare fino a fondo disciolto. Sterilizzare la soluzione filtrando con un filtro di dimensione pari a 0,2 μm. Mescolare 50 ml di mezzo completo con 400 μL di soluzione a base di HU per filtrazione sterilizzata per una concentrazione finale di HU di 4 mM.
      2. Rimuovere il supporto da tutti i pozzetti tranne i 2 pozzetti necessari per definire le impostazioni FACS e sostituire con un mezzo completo completo di 4 mM contenente HU (2 mL / pozzetto).
      3. Incubare le cellule per 24 hContenente HU a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% CO 2 .
    6. Liberazione di cellule da arresto mediato da HU. Rimuovere il contenitore HU contenente i pozzetti e sciacquare i pozzetti due volte con PBS pre-riscaldato (2 mL ogni volta). Aggiungere 2 ml di mezzo completo per pozzetto. Raccogliere 2 campioni per il tempo di 0 h (1 per l'estrazione RNA e 1 per la verifica dell'arresto del ciclo cellulare da FACS) nonché 2 campioni salvati per le impostazioni FACS. Inserire i pozzi rimasti nell'incubatrice.
    7. Raccogliere campioni ogni 1,5 - 3 ore per ottenere un'adeguata distribuzione della progressione del ciclo cellulare. Ad ogni punto temporale, eseguire l'elaborazione del campione (per l'estrazione di RNA e per l'analisi FACS) come descritto in 1.1.8.1-1.1.8.2.
  3. Trattamento con agenti dannosi del DNA
    NOTA: Ogni volta che lo scopo è quello di chiarire l'effetto di un composto ( ad es. Agenti dannosi del DNA) negli eventi di ciclo cellulare, è possibile utilizzare uno qualsiasi dei metodi di sincronizzazione descritti in precedenzaCombinato con il trattamento delle cellule con l'agente genotossico. Per selezionare il metodo di sincronizzazione, è importante considerare la fase del ciclo cellulare che vorremmo analizzare. In generale, la procedura Thy-Noc può essere idonea a studiare l'effetto di un composto in fase di fase G1 o in fase di fase S mentre la sincronizzazione mediata da HU può essere più idoneo a studiare l'impatto nelle fasi S-G2 o all'ingresso alla mitosi.
    1. Analisi dell'effetto degli agenti genotossici nella fase G1 o nella fase S
      1. Sincronizzare le celle come descritto in 1.1.2. A 1.1.6.
      2. Rilasciare le cellule di nocodazolo e ricaricarle come descritto in 1.1.7. Incubarli a 37 ° C in un'atmosfera umidificata con 5% di CO 2 per 3 h per farli fissare prima dell'aggregatore (il periodo di incubazione desiderato può variare a seconda della linea cellulare).
      3. Aggiungere agente e raccogliere i campioni come precedentemente descritto in 1.1.8.
    2. Analisi dell'effetto degli agenti genotossici in SG2 fasi o entrata M
      1. Sincronizzare le celle come descritto in 1.2.2. A 1.2.5.
      2. Liberare le cellule da HU come descritto in 1.2.6. E aggiungere immediatamente l'agente.
      3. Raccogli i campioni come precedentemente descritto al punto 1.8.
  4. Monitoraggio della sincronizzazione cellulare e progressione attraverso il ciclo cellulare mediante la colorazione del ioduro di propidium (PI) e l'analisi FACS
    NOTA: i campioni raccolti in tutti i punti di tempo insieme a quelli richiesti per definire le impostazioni FACS possono essere memorizzati a 4 ° C una volta stati fissati (come indicato in 1.1.8.2). Eseguire la colorazione con la soluzione PI e seguire l'analisi FACS per tutti i campioni dell'esperimento contemporaneamente. PI intercalates nella scanalatura principale del DNA a doppio filamento che produce un segnale altamente fluorescente quando eccitato a 535 nm con un picco di emissione largo intorno a 600 nm. Poiché PI può anche legarsi a RNA a doppio filamento, è necessario trattare le cellule con RNase per una risoluzione ottimale del DNA.
    1. Preparare la soluzione di colorazione fresca PI. Una soluzione di stock PI può essere preparata sciogliendo la polvere di PI in PBS ( es. 5 mg / ml). Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C (nell'oscurità). La soluzione di colorazione è composta da PI (140 μM), citrato di sodio (38 mM) e Triton X-100 (0,01% v / v).
    2. Riscaldare una superficie appropriata ( ad es. Forno) a 37 ° C.
    3. Centrifugare le cellule fisse (450 xg, 5 min, RT), superare il diluente (etanolo) e lavare una volta con 1x PBS.
    4. Centrifugare nuovamente le cellule, rimuovere PBS e aggiungere 300 μL di soluzione di colorazione PI per campione (ad eccezione di uno dei campioni per le impostazioni FACS, invece aggiungere PBS a questo campione).
    5. Trasferire le cellule ai tubi FACS (tubi in polistirene rotondo 5 ml).
    6. Aggiungere 1 μL di RNasi A ad ogni campione, mescolare ed incubare i campioni per 30 minuti nell'oscurità a 37 ° C. I campioni possono essere conservati protetti dalla luce a 4 ° C per un massimo di 2 - 3 giorni.
    7. Analizzare il contenuto del DNA nei campioni mediante flussocitometria. Definire le impostazioni di compensazione dell'analisi FACS con un campione asincrono colorato PI. Usare campioni vuoti (senza soluzione di colorazione PI) per verificare l'autofluorescenza. Le basi dell'analisi mediata dalla colorazione PI del contenuto del DNA mediante citometria a flusso sono state precedentemente descritte 9 .
  5. Determinazione dell'indice mitotico mediante colorazione a doppio fosfo-H3 (Ser 10) / PI
    NOTA: le cellule sottoposte a mitosi possono essere facilmente rilevate mediante citometria a flusso con anticorpi specifici per fosfo-istone H3 in Serine 10 (pH3). Una colorazione concomitante di PI è utile per determinare la distribuzione del DNA sul contenuto della popolazione cellulare. Sono necessari 5 campioni per le configurazioni ottimali delle impostazioni FACS: vuoto, solo PI, solo a pH3, solo anticorpo secondario e doppia colorazione.
    1. Centrifugare le cellule fisse (450 xg, 5 min, 4 ° C) e scartare il surnatante. Le seguenti fasi sono descritte per eseguire la colorazione in tubi da 15 mL.
    2. Lavare le cellule aggiungendo 1ML PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) al pellet e centrifuga (450 xg, 5 min, 4 ° C). Rimuovere il surnatante.
    3. Aggiungere un anticorpo anti-pH3 diluito (1: 500) in 100-200 μL di PBS-T + 3% BSA e incubare con dondolo per 2 ore a RT (o O / N a 4 ° C).
    4. Aggiungere 2 mL PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) e centrifugare (450 xg, 5 min, 4 ° C). Rimuovere il surnatante.
    5. Lavare ancora una volta aggiungendo 2 mL PBS-T al pellet, centrifugare e scartare il surnatante.
    6. Aggiungere un anticorpo secondario (anti-coniglio AlexaFluor 488 nel caso di un anticorpo selezionato pH3) diluito (1: 500) in 100-200 μL di PBS-T + 3% BSA e incubare con oscillazione per 1 h a RT (o O / N A 4 ° C). Proteggere i campioni dalla luce.
    7. Lavare due volte con PBS-T (2 mL) per centrifugazione come descritto al punto 1.5.4.
    8. Eseguire la colorazione PI come descritto (passaggi da 1.4.1 a 1.4.6).

2. Raccolta e lavorazione del campione per l'analisi dell'espressione di geni

  1. Prendere1,5 ml di campioni di microcentrifuga nel reagente di isolamento RNA dal congelatore e lasciarli scongelare a RT all'interno di un armadietto di sicurezza per le sostanze chimiche.
  2. Aggiungere 400 μL di cloroformio a ciascun campione e agitare energicamente (ma non vorticarsi) fino alla completa miscelazione. Incubare i campioni per 5 minuti a RT.
  3. Centrifugare i tubi per 15 minuti (≥8.000 xg, 4 ° C) in una microcentrifuga da banco.
  4. Trasferire la fase acquosa (superiore) a un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e registrare il volume trasferito (per semplificare la procedura, si raccomanda di raccogliere volumi uguali in tutti i campioni dell'esperimento).
  5. Aggiungere 1 volume di etanolo al 100% lentamente (goccia a goccia) alla fase acquosa durante la miscelazione. Non centrifugare.
  6. Eseguire i passaggi successivi con il kit di preparazione mini RNA commerciale. Pipettare fino a 700 μL di ogni campione, incluso qualsiasi precipitato che può essere formato, in una colonna di rotazione in un tubo di raccolta da 2 ml (fornito dal produttore).
  7. Chiudi ilCoperchio e centrifuga (≥ 8.000 g, RT) per 15 s. Scartare il flusso. Ripetere il passo precedente con il campione rimanente (se presente).
  8. Seguire le istruzioni dei produttori per il lavaggio e l'eluizione di RNA (eluire ogni campione in 30 - 40 μl H 2 O senza nucleasi per ottenere una concentrazione appropriata di RNA per il passo successivo).
  9. Determinare la concentrazione di RNA e la purezza dei campioni mediante misure di assorbanza (un rapporto A 260/280 di 2,0-2,1 indica una buona purezza del campione RNA). Conservare i campioni di RNA a -80 ° C fino all'uso per l'analisi RT-qPCR.
  10. Per la conversione di RNA in cDNA e successivo PCR quantitativo, prendere 1 μg di RNA per campione e preparare la reazione di retrotransprasasi secondo le istruzioni del produttore. I campioni di cDNA ottenuti possono essere conservati a 4 ° C (per un paio di giorni) oa -20 ° C (per periodi più lunghi).
    NOTA: la preparazione del campione, la progettazione dei primer e altre considerazioni per PCR in tempo reale sono state exTesi descritti in letteratura 22 , 23 .

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Risultati

Rappresentazione schematica di protocolli Thy-Noc e HU per la sincronizzazione delle cellule.

La figura 1 sintetizza le fasi necessarie per la sincronizzazione delle cellule U2OS e la successiva raccolta dei campioni per verificare la progressione attraverso il ciclo cellulare e per eseguire analisi dell'espressione genica.

La colorazione di Phospho-H...

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Discussione

L'analisi dei geni regolati a fine sintonia coinvolti in ruoli transitori e specifici nel ciclo cellulare richiede una popolazione cellulare uniforme. Molti ricercatori utilizzano rutinamente linee di cellule tumorali di lunga durata per questi scopi e sono state sviluppate vari metodi per ottenere popolazioni di cellule sincrone (o parzialmente sincrone), allo scopo di accumulare il maggior numero di cellule in fasi definite di ciclo cellulare. Inoltre, sono stati intrapresi forti sforzi per migliorare e ottimizzar...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del laboratorio Zubiaga e dei laboratori Altmeyer per un utile colloquio e per un supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del ministero spagnolo (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), del governo basco (IT634-13 e KK-2015/89) e dell'Università del Paese basco UPV / EHU UFI11 / 20).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM, alto glucosio, integratore GutaMAXThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, qualificato, approvato dall'UE, origine sudamericanaThermo Fisher Scientific10270-106
Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0,25% tripsina-EDTA (1x), rosso fenoloThermo Fisher Scientific25200-072
ThymidineSIGMAT1895-5GPreparato al momento. Un leggero riscaldamento potrebbe aiutare a sciogliere la timidina.
NocodazoloSIGMAM-1404Soluzione madre in DMSO conservato a -20 º C in piccole aliquote
IdrossiureaSIGMAH8627Mitomicina C appena preparata
da Streptomyces caespitosusSIGMAM42871,5 mM soluzione madre in H2O sterile protetta dalla luce e conservata a 4 º C
DimetilsolfossidoSIGMAD2650
Ioduro di propidioSIGMAP4170Soluzione madre in PBS sterile a 5 mg/ml, conservato a 4 º C protetto dalla luce.
PBS pH 7.6Etanolo fatto in casa
PANREACA3678,2500
CloroformioSIGMAC2432
Citrato di sodioPANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAsi AThermo Fisher ScientificEN0531
ReagenteTRIzolLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacitàThermo Fisher Scientific4368814
Anticorpo anticiclina E1Segnalazione cellulare4129Diluizione 1:1000 in latte al 5%, o/n, 4 º C
Anti-ciclina B1 anticorpoCell Signaling4135Diluizione 1:1000 in latte al 5%, o/n, 4 º C
Anti-β-actinaSIGMAA-5441Diluizione 1:3000 in latte al 5 %, 1 ora, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antibotyMillipore06-570Specificato nel protocollo
Anticorpo secondario anti-coniglio AlexaFluor 488InvitrogenR37116Specificato nel protocollo
Anticorpo secondario anti-topo-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-3697Diluizione 1:3000 in latte al 5 %, 1 ora,
anticorpo RT Forward E2F1 (umano)                                      TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Anticorpo E2F1 inverso (umano)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Anticorpo E2F7 in avanti (umano)                                      GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Anticorpo E2F7 inverso (umano)                                      TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGAAGABiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 anticorpo (umano)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 anticorpo (umano)                                      TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Gene di riferimento dell'anticorpo TBP (umano) in avanti                                       BiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Anticorpo TBP inverso (umano)                                       BiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Gene di riferimento dell'anticorpo Forward Oxa1L (umano)    CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                                 BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L   anticorpi (umani)      CACAGGGAGAATGAGGTTTATAG                               BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp Piastra di reazione ottica a 96 pozzettiThermo Fisher ScientificN8010560
Corning Piastra di coltura trattata TC da 100 mmCorning Corning
35066 pozzettiCorning
Eppendorf5415 R
Centrifuga da banco refrigerata Jouan CR3.12Jouan743205604
Spettrofotometro NanoDrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow CytometerBD Bioscience
QuantStudio 3 Sistema di PCR in tempo realeThermo Fisher ScientificA28567
Costar Piastre per colture cellulari Corning a Microcentrifuga da banco refrigerata 3506

Riferimenti

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