Method Article

Studiare l'espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riportiamo due protocolli di sincronizzazione delle celle che forniscono un contesto per studiare eventi legati a fasi specifiche del ciclo cellulare. Mostriamo che questo approccio è utile per analizzare la regolazione di geni specifici in un ciclo cellulare non selettivo o su esposizione ad agenti che interessano il ciclo cellulare.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il programma di espressione genica del ciclo cellulare rappresenta un passo fondamentale per comprendere i processi dipendenti dal ciclo cellulare e il loro ruolo in malattie come il cancro. L'analisi dell'espressione genica a ciclo-regolazione cellulare dipende dalla sincronizzazione cellulare in fasi specifiche. Qui descriviamo un metodo che utilizza due protocolli complementari di sincronizzazione comunemente usati per studiare la variazione periodica dell'espressione genica durante il ciclo cellulare. Entrambe le procedure sono basate sul blocco temporaneo del ciclo cellulare in un punto definito. Il protocollo di sincronizzazione con il trattamento con idrossiurea (HU) porta all'arresto cellulare nella fase tardiva G1 / fase iniziale S e la liberazione dall'arresto mediato da HU fornisce una popolazione cellulare che procede uniformemente attraverso S e G2 / M. Il protocollo di sincronizzazione da parte di timidina e nocodazolo (Thy-Noc) blocca le cellule in fase iniziale di mitosi e rilascio da arresto mediato da Thy-Noc fornisce una popolazione cellulare sincronizzata adatta per la fase G1 e la fase SProva gli studi. L'applicazione di entrambe le procedure richiede il monitoraggio dei profili di distribuzione del ciclo cellulare, che viene tipicamente eseguito dopo la colorazione del ioduro di propidium (PI) delle cellule e l'analisi della citometria a flusso analizzata del contenuto del DNA. Mostriamo che l'uso combinato di due protocolli di sincronizzazione è un approccio robusto per determinare chiaramente i profili trascrizionali di geni regolati in modo differenziato nel ciclo cellulare ( cioè E2F1 e E2F7) e di conseguenza avere una migliore comprensione del loro ruolo nel ciclo cellulare processi. Inoltre, dimostriamo che questo approccio è utile per lo studio di meccanismi che stanno alla base di terapie a base di droga ( cioè mitomicina C, un agente anticancro), perché consente di discriminare i geni che rispondono all'agente genotossico da quelli esclusivamente colpiti dalle perturbazioni del ciclo cellulare Imposto dall'agente.

Introduction

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La transizione attraverso tutte le fasi del ciclo cellulare è accoppiata ad un programma di espressione genica fortemente regolamentato. Si ritiene che questa coordinata "on and off" della trascrizione genica per tutto il ciclo cellulare sia sotto il controllo di sistemi regolatori transcrittivi complessi, che regola non solo la tempistica ma anche i livelli di espressione genica. La deregulation dei componenti chiave del ciclo cellulare è noto per contribuire allo sviluppo di diverse malattie ed è un segno distintivo ben consolidato della tumorigenesi 1 , 2 . Le analisi trascrizionali a livello genomico effe....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sincronizzazione cellulare, rilascio e monitoraggio della progressione del ciclo cellulare

  1. Sincronizzazione e rilascio di cellule U2OS a base di timidina e nocodazolo (Thy-Noc) dalla mitosi
    1. Preparare il mezzo di coltura della cellula desiderato. Le cellule U2OS vengono coltivate regolarmente nel mezzo di DMEM-glutamina integrato con il 10% (vol / vol) FBS (opzionale: 1% di penicillina / streptomicina). Eseguire tutta la preparazione e manipolazione media in condizioni sterili e riscaldare il mezzo complementare (da ora in poi denominato "mezzo completo") a 37 ° C prima dell'uso.
    2. Seme 2 x 10 6 cellule U2....

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Results

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Rappresentazione schematica di protocolli Thy-Noc e HU per la sincronizzazione delle cellule.

La figura 1 sintetizza le fasi necessarie per la sincronizzazione delle cellule U2OS e la successiva raccolta dei campioni per verificare la progressione attraverso il ciclo cellulare e per eseguire analisi dell'espressione genica.

La colorazione di Phospho-H3 e .......

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Discussion

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L'analisi dei geni regolati a fine sintonia coinvolti in ruoli transitori e specifici nel ciclo cellulare richiede una popolazione cellulare uniforme. Molti ricercatori utilizzano rutinamente linee di cellule tumorali di lunga durata per questi scopi e sono state sviluppate vari metodi per ottenere popolazioni di cellule sincrone (o parzialmente sincrone), allo scopo di accumulare il maggior numero di cellule in fasi definite di ciclo cellulare. Inoltre, sono stati intrapresi forti sforzi per migliorare e ottimizzar.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo i membri del laboratorio Zubiaga e dei laboratori Altmeyer per un utile colloquio e per un supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del ministero spagnolo (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), del governo basco (IT634-13 e KK-2015/89) e dell'Università del Paese basco UPV / EHU UFI11 / 20).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, alto glucosio, integratore GutaMAXThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, qualificato, approvato dall'UE, origine sudamericanaThermo Fisher Scientific10270-106
Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0,25% tripsina-EDTA (1x), rosso fenoloThermo Fisher Scientific25200-072
ThymidineSIGMAT1895-5GPreparato al momento. Un leggero riscaldamento potrebbe aiutare a sciogliere la timidina.
NocodazoloSIGMAM-1404Soluzione madre in DMSO conservato a -20 º C in piccole aliquote
IdrossiureaSIGMAH8627Mitomicina C appena preparata
da Streptomyces caespitosusSIGMAM42871,5 mM soluzione madre in H2O sterile protetta dalla luce e conservata a 4 º C
DimetilsolfossidoSIGMAD2650
Ioduro di propidioSIGMAP4170Soluzione madre in PBS sterile a 5 mg/ml, conservato a 4 º C protetto dalla luce.
PBS pH 7.6Etanolo fatto in casa
PANREACA3678,2500
CloroformioSIGMAC2432
Citrato di sodioPANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAsi AThermo Fisher ScientificEN0531
ReagenteTRIzolLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacitàThermo Fisher Scientific4368814
Anticorpo anticiclina E1Segnalazione cellulare4129Diluizione 1:1000 in latte al 5%, o/n, 4 º C
Anti-ciclina B1 anticorpoCell Signaling4135Diluizione 1:1000 in latte al 5%, o/n, 4 º C
Anti-β-actinaSIGMAA-5441Diluizione 1:3000 in latte al 5 %, 1 ora, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antibotyMillipore06-570Specificato nel protocollo
Anticorpo secondario anti-coniglio AlexaFluor 488InvitrogenR37116Specificato nel protocollo
Anticorpo secondario anti-topo-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-3697Diluizione 1:3000 in latte al 5 %, 1 ora,
anticorpo RT Forward E2F1 (umano)                                      TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Anticorpo E2F1 inverso (umano)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Anticorpo E2F7 in avanti (umano)                                      GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Anticorpo E2F7 inverso (umano)                                      TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGAAGABiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 anticorpo (umano)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 anticorpo (umano)                                      TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Gene di riferimento dell'anticorpo TBP (umano) in avanti                                       BiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Anticorpo TBP inverso (umano)                                       BiolegioProgettato dallo strumento PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Gene di riferimento dell'anticorpo Forward Oxa1L (umano)    CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                                 BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L   anticorpi (umani)      CACAGGGAGAATGAGGTTTATAG                               BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp Piastra di reazione ottica a 96 pozzettiThermo Fisher ScientificN8010560
Corning Piastra di coltura trattata TC da 100 mmCorning Corning
35066 pozzettiCorning
Eppendorf5415 R
Centrifuga da banco refrigerata Jouan CR3.12Jouan743205604
Spettrofotometro NanoDrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow CytometerBD Bioscience
QuantStudio 3 Sistema di PCR in tempo realeThermo Fisher ScientificA28567
Costar Piastre per colture cellulari Corning a Microcentrifuga da banco refrigerata 3506

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, ....

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