Purificazione delle proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate da Rhipicephalus microplus Cellule epiteliali delle ghiandole

Summary

Una metodologia basata sulla gradiente di centrifugazione a densità modificata è stata utilizzata per isolare le cellule epiteliali del tessuto intestinale di Rhipicephalus microplus . Le proteine ​​legate alle superfici sono state biotinilate e purificate mediante perline magnetiche di streptavidina per l'utilizzo nelle applicazioni a valle.

Abstract

Rhipicephalus microplus - il bestiame bestiame - è l'ectoparasite più significativo in termini di impatto economico sul bestiame come vettore di diversi agenti patogeni. Gli sforzi sono stati dedicati al controllo del bestiame da bere per diminuire i suoi effetti deleteri, con particolare attenzione alla scoperta di candidati vaccinali, come BM86, localizzati sulla superficie delle cellule epiteliali delle ghiandole. La ricerca attuale si concentra sull'utilizzo di cDNA e librerie genomiche, per la ricerca di altri candidati vaccinali. L'isolamento delle cellule gutricole costituisce un importante vantaggio nell'individuare la composizione delle proteine ​​superficiali sulla membrana delle cellule gutiche. Questa carta costituisce un metodo nuovo e fattibile per l'isolamento delle cellule epiteliali, dal contenuto di gocce del polmone R. microplus semiaffuso. Questo protocollo utilizza TCEP e EDTA per rilasciare le cellule epiteliali dai tessuti di supporto subepitheliali e una gradi di centrifugazione a densità discontinuaNt per separare le cellule epiteliali da altri tipi di cellule. Le proteine ​​superficiali delle cellule sono state biotinilate e isolate dalle cellule epiteliali delle ghiandole, usando branelli magnetici legati alla streptavidina, che consentono applicazioni a valle in analisi FACS o LC-MS / MS.

Introduction

Rhipicephalus microplus , il segno del bestiame, è l'ectoparasite più significativo in termini di impatto economico sull'industria del bestiame delle regioni tropicali e subtropicali in quanto vectors bovine tick-tick (babesiosis), anaplasmosis e piroplasmosis equestre ^{1 , 2 , 3 , 4} . Gli sforzi sono stati dedicati al controllo dei bovini da bestiame, per diminuire l'effetto deleterio, tuttavia i metodi convenzionali come l'uso di acaricidi chimici hanno inconvenienti impliciti, come la presenza di residui chimici n....

Protocol

1. Dissezione dell'epitelio di Gut da R. microplus

1. Raccogli le zecche semi-inguine dal bestiame nel giorno dell'esperimento. Disseccare le zecche entro 24 ore dopo la rimozione dall'ospite.
2. Aderire una striscia di nastro adesivo alla parte inferiore del piatto di Petri da 92 mm x 16 mm. Aggiungere una goccia di colla super al nastro. Posizionare il ticchettio, lato ventrale verso il basso sulla colla super, lasciare asciugare per 2 minuti.
3. Versare 100 ml di soluzione salina fosfata (PBS) nel piatto di Petri, o fino a quando la zecca è completamente sommersa.
4. Utilizzando uno scalpello di taglia 11, taglia....

Results

Le cellule epiteliali sono state isolate dai tessuti intestinali di R. microplus secondo lo schema presentato in Figura 1 . Le rappresentazioni rappresentative di microscopia a fluorescenza delle cellule epiteliali delle ghiandole del guscio preparate usando questo protocollo sono mostrate nella Figura 2A E 2B. Poiché l'isolamento delle cellule è .......

Discussion

Le infestazioni di zootecnia costituiscono un grave problema per l'industria del bestiame nelle regioni tropicali e subtropicali del mondo, con il metodo più comune di controllo dipendente dall'uso degli acaricidi ^{1 , 4} . Bm86 è stato precedentemente individuato all'interno della superficie epiteliale della ghiera di zecca come antigene protettivo contro l'infestazione di R. microplus ¹⁰ , con un successo limitato.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific 15250061
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL	Eppendorf	3322
100mM Carbonato Tampone			3,03 g Na2CO3, 6,0 g NaHCO3 1000 ml di acqua distillata pH 9,6
Provette da centrifuga da 16 mL con tappo di chiusura	Thermo Scientific	3138-0016	Raffreddare in ghiaccio prima del gradiente
250 &; Filtro cellulare M	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina (TMB) Sistema di substrato liquido per ELISA	Sigma	T0440	Conservato a 4C
30% Perossido di idrogeno	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-Cloro-1-naftolo compressa	Sigma-Aldrich	C6788
Provetta Falcon da 50 mL	Corning Blue		stile 30 x 115 mm. Tubo conico in polipropilene.
70 µ Filtro cellulare M	BD Falcon	352350
AP15 carta da filtro	Millipore	AO1504200
Biotina (Tipo A) Kit di coniugazione	Abcam	Ab102865
Microscopio di dissezione	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Software di immagini cellulari
Nastro adesivo	Home Handyman		48mm x 25mm Nastro adesivo
Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - ghiacciato per protocollo
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
Microscopio a fluorescenza	Olimpo	BX51
Fluoroshield con DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
Pinze	Dumont	#9 Dumont
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G5516	Glicerolo per biologia molecolare >99%
Glicina	Sigma-Aldrich	410225
Portatile	banco	JA0376230
Hank' s Soluzione salina bilanciata	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS - ghiaccio freddo per protocollo
Emacitometro	Optik Layor	-
L-Glutatione ossidato	Sigma-Aldrich	G4376
Supporto di separazione magnetica	Novagen-4-Tube		Rack di separazione magnetica
Metanolo	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Sistema integrato di purificazione dell'acqua per acqua ultrapura
Membrana in nitrocellulosa Life	Sciences	66485	Membrana in nitrocellulosa pura 30 cm x 3 M
PageRuler Scala per proteine prestate	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1,16 g Na2HPO4, 0,1 g KCl, 0,1 g K3PO4, 4,0 g NaCl (500 ml di acqua distillata) pH 7,4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Pompa peristaltica	Masterflex	7518-10
Acido fosforico	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Tampone bloccante P20 PBS privo di proteine	Thermo-Scientific	37573	conservato a 4C. Tampone bloccante
inibitore della proteasi Cocktail	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – conservato a -20 deg; C
Avvio rapido Bradford Reagente colorante 1x	Biorad	500-0205	Per Bradford Assay
Quick Start Standard BSA	Biorad	500-0207	Standard BSA per Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Size 11 Bisturi
SilverQuest TM Kit di colorazione	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuga	Thermo Scientific	46910
Streptavidin (HRP)	Abcam	AB7403
Streptavidin Perle Magnetiche New	England Biolabs	S1420S
Super Colla - Ultra Fast Mini	UHU		UHU Super Colla 1mg. Ultra veloce mini
centrifuga da tavolo	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Miscelatore a vortice	Ratek	VM1
Bagno d'acqua	Grant	GD100