Articolo metodologico

Modello di degenerazione del disco intervertebrale lombare di ovini Utilizzando un lesione laterale retroperitoneale laterale

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DOI:

10.3791/55753

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25 maggio 2017

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1Department of Surgery, Monash University, 2Department of Neurosurgery, Monash University, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute of Medical Research, 4Proteobioactives, Pty Ltd, 5Department of Neurosurgery, St Vincent's Hospital, 6Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, University of Queensland, 7School of Chemical Engineering, University of Queensland, 8Department of Neurosurgery, Monash Health

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La degenerazione del disco intervertebrale è un importante contributo al dolore alla schiena e alla causa principale di disabilità in tutto il mondo. Esistono numerosi modelli animali della degenerazione del disco intervertebrale. Abbiamo dimostrato un modello ovino di degenerazione del disco intervertebrale, utilizzando un bit di trapano, che raggiunge una lesione consistente del disco e un livello riproducibile di degenerazione del disco.

Abstract

La degenerazione del disco intervertebrale è un importante contributo allo sviluppo del dolore alla schiena e la principale causa di disabilità in tutto il mondo. Numerosi modelli animali della degenerazione del disco intervertebrale sono stati sviluppati. Il modello animale ideale dovrebbe similmente imitare il disco intervertebrale umano per quanto riguarda la morfologia, le proprietà biomeccaniche e l'assenza di cellule notochordali. Il modello del disco intervertebrale lombare delle pecore soddisfa questi criteri. Presentiamo un modello ovino di degenerazione del disco intervertebrale utilizzando un danno di trapano attraverso un approccio laterale retroperitoneale. L'approccio laterale riduce notevolmente l'incisione e la potenziale mortalità associata all'approccio tradizionale anteriore alla colonna vertebrale. L'utilizzo di un metodo di lesione a punta da trapano consente di produrre una lesione coerente e riproducibile, di dimensioni precise, che inizia un grado consistente di degenerazione del disco intervertebrale. La natura focale dell'anulareE il difetto del nucleus pulposus simula più da vicino la condizione clinica della herniation del disco intervertebrale focale. Le pecore si riprendono rapidamente seguendo questa procedura e sono tipicamente mobili e mangiando entro un'ora. La degenerazione del disco intervertebrale si verifica e le pecore subiscono la necropia e la successiva analisi a periodi di otto settimane. Riteniamo che il modello di lesioni a foro di drastica degenerazione dei dischi intervertebrali offre vantaggi rispetto ai modelli convenzionali di lesioni anulari.

Introduzione

Il dolore alla schiena è la causa principale della disabilità in tutto il mondo 1 . Il dolore discogeno associato alla degenerazione del disco intervertebrale lombare è considerato un contributo significativo al dolore alla schiena 2 . C'è una crescente domanda di modelli animali affidabili di malattia da disco intervertebrale per ampliare la comprensione del processo degenerativo e per l'indagine delle potenziali terapie.

Numerosi modelli animali di degenerazione del disco intervertebrale esistono 3 . I modelli di animali utilizzati nell'inchiesta di malattie degenerative del disco variano in dimensioni dai topi 4 , ai mammiferi più grandi come i cani 5 , le pecore 6 e i primati non umani 7 . I metodi utilizzati per indurre la degenerazione del disco intervertebrale possono essere classificati ampiamente nelle categorie meccaniche ( ad es. Compressione intervertebrale del disco N 8 o ferita chirurgica 6 ), chimica ( es. Nucleolisi chimica 5 ) o, meno comunemente, degenerazione spontanea ( es .

Data la complessità della degenerazione del disco intervertebrale umano, non esiste un modello animale perfetto. Tuttavia, sono state individuate importanti considerazioni nella scelta di un modello animale appropriato per simulare questa condizione da vicino. Tali considerazioni includono l'assenza di cellule notochordali (cellule primitive con funzionalità di cellule progenitori 10 assenti dal pulposo nucleo adulto in esseri umani, ovini, caprini e cani condrodrodrofici presenti nella maggior parte dei mammiferi), somiglianze nella dimensione del disco animale e intervertebrale rispetto agli esseri umani, Forze biomeccaniche paragonabili alla condizione clinica, considerazioni meccaniche ed etiche 3 .

Jove_content "> I primati non umani soddisfano molti dei criteri sopra elencati. I modelli babilonici e macaque della degenerazione del disco intervertebrale spontaneo sono stati descritti 11 , 12 , 13. Entrambe le specie trascorrono grandi quantità di tempo in posizioni erette o semi-erette - Rispetto ad altri modelli animali. Tuttavia, la considerazione etica e pratica ( ad es. Spese, alloggio, ritardato inizio della degenerazione spontanea) limita il loro utilizzo in molte istituzioni.

La colonna vertebrale ovina è un modello consolidato di degenerazione del disco intervertebrale, con vantaggi tra cui le somiglianze cellulari, biomeccaniche e anatomiche alla colonna vertebrale umana 10 , 14 , 15 . Nonostante la statura quadrupedale delle pecore, il disco intervertebrale lombare ovino è esposto a sollecitazioni simili al disco umanoS = "xref"> 14. Il modello ovino è anche più ampiamente accettato, dal punto di vista etico, rispetto ai modelli primati non umani. Sono stati descritti vari metodi per avviare il processo degenerativo, molti dei quali richiedono un accesso diretto al disco intervertebrale. A causa della terminazione del midollo spinale nella regione sacrale e dell'ossificazione del legamento longitudinale posteriore nella colonna lombare ovina, gli approcci posteriori al disco intervertebrale sono tecnicamente impegnativi e meno comunemente utilizzati nelle pecore16. Le vie tradizionali di accesso alla colonna lombare della pecora, cioè attraverso approcci anteriori o anterolaterali, richiedono grandi incisioni addominali, sono piene di rischi di ernia e danni alle viscere interne e alle strutture neurovascolari 16 . L'uso di una piccola incisione laterale relativamente piccola da zone dipendenti addominali può ridurre tali rischi 17 .

Presentiamo un mo ovinoDel degenerative malattia del disco intervertebrale lombare utilizzando lesioni di trapano eseguite attraverso un approccio laterale minimamente invasivo e ispirato dal lavoro di Zhang et. Al 18 . L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire un affidabile modello di lesioni lombari del disco che sia facilmente riproducibile, produce un danno consistente e sia sicuro e ben tollerato. Questo approccio è particolarmente adatto per gli investigatori che cercano di indurre un grado più debole di degenerazione del disco intervertebrale lombare rispetto a quello osservato con la tradizionale annulotomia chirurgica (dati non pubblicati) per l'analisi della degenerazione dei dischi intervertebrali o delle terapie rigenerative. Questi risultati saranno descritti in una prossima pubblicazione.

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Protocollo

Il protocollo dettagliato in questo manoscritto segue le linee guida per la cura degli animali di Monash University Ethics Animal. L'approvazione dell'etica animale per questo protocollo è stata concessa da Monash University Ethics Animal. Numero di omologazione etica: MMCA / 2014/55

1. Preparazione delle pecore

NOTA: sono state utilizzate le pelli di età compresa tra due e quattro anni.

  1. Pecore veloci per 18 ore prima dell'anestesia. Fornire agli animali l'accesso all'acqua fino a 6-12 h prima dell'operazione 19 .
  2. Sedate gli animali per iniezione endovenosa di medetomidine cloridrato (0,015-0,020 mg / kg) per facilitare il trasferimento alla suite operativa.
    NOTA: La medetomidina cloridrato serve a ridurre lo stress degli animali e l'agitazione associata alla separazione da altri animali per il trasferimento alla suite operativa.
  3. Iniettare il tiopentone (10-13 mL / kg) per l'induzione dell'anestesia all'arrivo nella suite operativa.
  4. Somministrare intra-profilatticoAntibiotici venosi (amoxicillina 1 g IV) subito dopo l'iniezione di tiopentone.
  5. Pecore intubate utilizzando un tubo endotracheale di diametro 7,5-9 mm (interno).
  6. Mantenere l'anestesia usando l'isoflurano inalato (2-3%) in ossigeno al 100% con una portata di 2 L / min. Attaccare un impulso ossimetrico all'orecchio della pecora.
  7. Monitorare attentamente i segni vitali delle pecore (frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e saturazione dell'ossigeno mediante ossimetro di impulso e osservazione) e livello di coscienza.
    NOTA: Gli indicatori di anestesia leggera come la masticazione spontanea, la rigurgita attiva ei movimenti spontanei dovrebbero indurre un aumento del livello di anestesia. I segni di bandiera rossa che indicano l'alleggerimento urgente dell'anestesia includono il compromesso respiratorio e la grave bradicardia. La rotazione dell'occhio non è un indicatore coerente della profondità dell'anestesia nelle pecore 19 .

2. Livello e incisione del disco

  1. Raccogliere la sUtensili urgenti necessari per questa procedura: tagliatori veterinari, 20 ml di siringa luer-lock, ago da 21G IV, manico a 4 bisturi, 22 lame a scalpello, forbici per tessuti Gillies, forbici per dissezione curve Metzenbaum, retrattore di Deaver, lama retrattrice Hohmann, 3,5 mm Brad Punta a punta, fresa a foro, trapano, borsa veterinaria autoclavabile, supporto per aghi, suture sintetiche sintetiche assorbibili da 2-0, sutura intrecciata sintetica da 3-0 e forbici per sutura Mayo.
  2. Preparare la suite operativa. Pulire la tavola operativa e il supporto dello strumento con il 70% di etanolo. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima dell'operazione. Effettuare un controllo anestetico preoperatorio.
  3. Posizionare le pecore sul tavolo operatorio nella posizione laterale destra.
  4. Utilizzando scalpellatrici elettroniche, raggruppa la regione definita in modo superiore per le nervature inferiori, inferiormente per l'osso iliaco, medialmente dai processi trasversali lombari contralaterali e circa 10 cm laterali ai processi trasversali lombari ipsilaterali.
  5. Palpate la cresta iliaca, i processi trasversali lombari (L1-6) e l'angolo costo-vertebrale per i punti di riferimento per il sito di incisione chirurgica. Segnare questi punti di riferimento con una penna sterile.
  6. Preparare l'addome laterale disinfettando con la cleressidina e il lavaggio antisettico alcolico-ioduro.
  7. Osservare le tecniche asettiche chirurgiche standard durante l'operazione. La squadra chirurgica lavora prima dell'operazione. Posizionare un drenaggio quadrato sterile fiancheggiato sul sito chirurgico e un grande quadrato sterile sul tavolo sovrapposto.
    1. Sterilizzare tutti gli oggetti da utilizzare all'interno del sito operativo prima dell'operazione. Monitorare e mantenere la sterilità del sito chirurgico durante l'operazione. Assicurarsi che tutti gli elementi introdotti nel campo sterile siano sterili e trasferiti in modo sterile.
  8. Utilizzare l'ingrandimento della lente chirurgica e un faro per facilitare la visualizzazione durante la procedura chirurgica.
  9. Fare un'incisione longitudinaleUtilizzando la lama di bisturi # 22 attaccata all'impugnatura a 4 braccioli parallela e 1 cm anteriore a uno a due processi trasversali lombari sopra e sotto i livelli di disco intervertebrali di interesse.
    NOTA: Ulteriori informazioni sulla pianificazione dell'incisione possono essere trovate nella discussione.
  10. Utilizzare la diatermia monopolare per dividere il sottostante tessuto sottocutaneo e l'aspetto laterale della muscolatura della parete addominale; Dirigono la dissezione verso le punte dei processi trasversali lombari sopra e sotto i dischi intervertebrali di interesse.
  11. Dividere longitudinalmente la fascia toracolumbar al suo attaccamento ai processi trasversali.
  12. Visualizzare e preservare il sottostante quadratus lumborum , i muscoli psoas ei fasci neurovascolari che attraversano.
  13. Mantenere l'emostasi attraverso la procedura usando la diatermia.
  14. Spazzare le dita tra il piano del peritoneo e la muscolatura posteriore della parete addominale all'intervertebraleSc per eseguire la dissezione digitale veloce.
  15. Ritirare i quadrori lumborum e muscoli psoas postolateralmente utilizzando un retrattore di Deaver per esporre ulteriormente i dischi intervertebrali.
  16. Palpate per i corpi concavo intervertebrali ei dischi intervertebrali convessi.
  17. Posizionare i retrattori immediatamente sui dischi e fare attenzione a garantire che i vasi lombari non siano danneggiati.
  18. Utilizzando l'ingrandimento delle lenti chirurgiche con un faro, individuare i vasi lombari situati circa 1 cm caudali verso l'estremità inferiore inferiore.
  19. Eseguire un raggio laterale intraoperatorio per confermare il livello del disco. 21
    Nota: Impostazioni radiografiche: 47kV; 4 mAs 21
  20. A seconda dei livelli di disco desiderati, esporre il disco intervertebrale separando le strutture e gli allegati circostanti come di seguito.
    1. Per i livelli L3 / 4 e superiori, spazzare via gli attacchi muscolari sopra la diSc usando le dissoluzioni digitali sbarrate.
    2. Per i livelli L4 / 5 e successivi, dividere con forza gli attacchi muscolari tendenziali più spessi sul disco utilizzando diatermia bipolare e forbici.
      NOTA: Il disco L6 / S1 può essere difficile da accedere a causa dell'ostruzione dalla cresta iliaca. Se l'accesso non può essere effettuato tramite l'approccio laterale, è possibile utilizzare un approccio anteriore.

3. Perdita di trapano

NOTA: la pianificazione preoperatoria include l'assegnazione dei livelli di lesioni / trattamento e dei livelli di controllo. Ulteriori informazioni sull'assegnazione del livello possono essere trovate nella discussione.

  1. Definire il punto di entrata del trapano osservando le estremità laterali e anteriori sinistra del disco intervertebrale.
    NOTA: Il punto di entrata si trova al centro di questo quadrante anterolaterale sinistro (definito dalle estremità anteriori e laterali del disco). Il bit di trapano viene inserito in questo punto di ingresso con una traiettoria mirataVerso il centro dei dischi intervertebrali e diretto leggermente cranico perpendicolare.
  2. Montare un foro di punta Brad-Punto nella trapanatrice. Assicurarsi che il diametro del foro sia leggermente inferiore all'altezza del disco intervertebrale, vale a dire 3,5 mm per il disco intervertebrale lombare in pecore da 60-70 kg.
    1. Applicare una punta di trapano per fornire una lunghezza di trapano non protetta di circa la metà del diametro del disco intervertebrale lombare, ovvero ~ 12 mm per i dischi intervertebrali lombari in pecore da 60-70 kg.
  3. Applicare il bit di trapano al punto di ingresso e indirizzarlo in una traiettoria leggermente cranica al centro del disco intervertebrale. La leggera angolazione cranica è quella di ridurre al minimo il rischio di lesioni endplate.
  4. Far avanzare lentamente il disco nel disco intervertebrale con il trapano a bassa potenza per 1 s. Regolare la traiettoria in un leggero modo cranico o caudale se si verifica una eccessiva resistenza
    NOTA: taleLa resistenza eccessiva indica probabilmente il contatto con la lastra.

4. Chiusura

  1. Una volta ottenuta l'emostasi, irrigare la ferita con la soluzione di Ringers.
  2. Eseguire una chiusura a strati, preferibilmente utilizzando suture intrecciate sintetiche 2-0 assorbibili ai tessuti laterali della parete addominale e continui a sutura subcuticolare sintetica intrecciata 3-0 non sottovalutata alla pelle.

5. Gestione postoperatoria

  1. Inserire una patch transdermica fentanile (75 μg / h) nella regione inguinale per l'analgesia post-chirurgica per 3 giorni.
  2. Inoltre, se necessario, utilizzare buprenorfina per via endovenosa (0,005-0,01 mg / kg) per l'analgesia top-up.
  3. Cessare l'anestetico inalatorio. Quando si verifica una respirazione spontanea, rimuovere il tubo endotracheale.
  4. Lasciare che l'animale si riprendi in una gabbia di tenuta sotto osservazione costante.
    NOTA: L'animale non deve essere lasciato incustodito finché non ha ottenuto sufficiente conscioLa usanza per mantenere la ricostruzione sternale.
  5. Una volta che l'animale è pienamente attento e in piedi, riappropriazione di cibo e acqua. Una volta recuperato completamente, restituire l'animale al suo impianto operativo che tiene la penna con altri animali.
  6. Monitorare attentamente per 24 ore e continuare l'osservazione per una settimana. Monitor per prove di dolore post-chirurgico o disturbo.
    NOTA: La patch transdermica post-operatoria fentanylica applicata per tre giorni dovrebbe fornire analgesia sufficiente. Ulteriori requisiti analgesici dovrebbero indurre una revisione degli animali.
  7. Alimentare normalmente le pecore e permettere alle pecore di svolgere attività normali senza restrizioni. Osservare le pecore per qualsiasi prova di deficit neurologico, come la lameness.
    NOTA: Il difetto del disco intervertebrale prodotto dal metodo di lesione del trapano è sull'aspetto anterolaterale del disco e la profondità di lesione è limitata dalla fermata del bit di trapano al nucleo centrale. Poiché gli elementi neurali sono posizionati posteriormente / posterolaterali al disco intervertebrale,Il rischio di un compromesso neuronale secondario al sintomo sintomo del pulposo è remoto. Questa caratteristica anatomica del modello preclude l'uso di esami neurologici per distinguere la degenerazione del disco intervertebrale con e senza nucleo pulse.
  8. Rimetti le pecore all'azienda universitaria per aspettare l'eutanasia e la necropia alla fine del periodo sperimentale.

6. Eutanasia

  1. Eseguire l'eutanasia di pecore ad un intervallo di tempo appropriato dopo la lesione del disco intervertebrale.
  2. Iniettare il pentobarbitone sodico per via endovenosa (> 100 mg / kg) per l'eutanasia.

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Risultati

Preoperatoria, le pecore hanno subito la rivelazione di risonanza magnetica 3T (MRI) per la valutazione della morfologia e della degenerazione del disco intervertebrale sottostante. Le pecore hanno subito ulteriori radiografia laterale intraoperatoria per la conferma del livello del disco intervertebrale e il calcolo dell'indice di altezza del disco. Un fascio sagittale preoperatorio da 3T MRI e una radiografia intraoperatoria sono mostrati in Figura 1 .

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Discussione

Questo approccio di accesso laterale minimamente invasivo è efficace e sicuro, senza alcuna ernia postoperatoria, deishenza della ferita addominale o infezione osservata in questa serie. L'utilizzo del modello di lesione intervertebrale del disco a foro con una profondità di profondità fornisce un metodo riproducibile per indurre una lesione intervertebrale consistente della dimensione nota ( vale a dire un infortunio di profondità di 3,5 mm di diametro x 12 mm in questo studio). Secondo la nostra esperienz...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti da divulgare.

Ringraziamenti

Il dottor Chris Daly è il destinatario della Borsa di studio della Fondazione per la chirurgia Richard Jepson. Gli autori vorrebbero ringraziare la dottoressa Anne Gibbon, il dottor Dong Zhang e il personale di Monash Animal Services, la Monash University per la loro assistenza con l'intervento chirurgico e la cura degli animali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Medetomidina cloridrato (10 mL per iniezione)Therapon/ZoetisPFIDOM10Fornitori multipli: Zoetis/Ilium
ThiopentoneTroyTriothiopentoneFornitori multipli: Neon Laboratories, Jagsonphal Pharmaceuticals
Isoflurano (2 - 3 % in ossigeno)BaxterAHN3636Fornitori multipli: Baxter/VetOne
Amoxicillina parenteraleGlaxoSmithKlineJO1CA04Fornitori multipli: GlaxoSmithKline/Merck
Bupivacaine (0,5% Iniezione 20 mL)Pfizer005BUP001Fornitori multipli: Pfizer/AstraZeneca
PVD Iodine SolutionJurox61330Fornitori multipli: Jurox/Orion
Clorexidina 5%w/vJuroxChlorhex C 5L (SCRUB)Fornitori multipli: Jurox/Pfizer
Cerotto transdermico Fental (75 μ g/h)Janssen-CilagS8-Dur7.5Fornitori multipli: Sandoz
Buprenorphine ivJurox504410Fornitori multipli: LGM Pharma
Atipamezole (Antisedan 0.06 mg/kg - 0.08 mg/kg)ZoetisPFIANT10Fornitori multipli: Ilium
Oster Golden A5 2-Speed ClippersOster078005-140-003Oster
20 mL siringa luer lockTerumo6SS+20LFornitori multipli: Medshop Australia/Terumo
21 G IV agoTerumoSG3-1225Fornitori multipli:Medshop Australia/Terumo
#4 manico bisturiAustvetAD010/04Fornitori multipli: Austvet/SurgicalInstruments
#22 bisturi calviAustvet
Gillies pinza per tessutiAustvetAB430/15Fornitori multipli: Austvet/SurgicalInstruments
Forbici da dissezione curve MetzenbaumAustvetAC101/14Fornitori multipli: Austvet/SurgicalInstruments
Divaricatore DeaverStrumenti chirurgici23.75.03Fornitori multipli: Strumento chirurgico/Divaricatore Austvet
HohmannAustvetKA173/35Fornitori multipli: Austvet/SurgicalInstruments
Forbici da sutura MayoAustvetAC911/14Fornitori multipli: Austvet/SurgicalInstruments
Portaaghi 14 cm EliteMedical18-1030Fornitori multipli: EliteMedical/Austvet
CMT 3.5 mm Brad-Point DrillCarbatec516-035-51Fornitori multipli: Southeast Tool/Carbatec
Drill Bit Stop 4 mmDrill Warehouse20121600Fornitori multipli: Amazon
Bosch 10.8 V Cordless Angle Drill GetTools DirectGWB10.8V-LIBBFornitori multipli:Bunnings/Get Tools Borsa
per trapano veterinario autoclavabileAustVetDRA043-AV
Suture intrecciate sintetiche assorbibili AustVet 2-0EthiconVCP335H
Suture intrecciate sintetiche assorbibiliEthiconVCP232HEthicon
Siemens 3 Tesla Skyra Widebore MRISiemensN/ASiemens
9.4 Tesla Agilent (Varian) MRIAgilent TechnologiesN/AAgilent Technologies
Atomscope HF 200 A RadiogaphRadlink330003AFornitori multipli: Radlink/DLC Australia
Veterinary Pulse OximiterDLC 192500AFornitori multipli: DLC Australi Pty Ltd/AustVet
diretta

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