Espressione transitoria e Localizzazione cellulare di proteine ​​ricombinanti in cellule in coltura per insetti

Summary

Nonlytic sistemi di espressione di cellule di insetto sono sottoutilizzate per la produzione, il traffico cellulare / localizzazione, e analisi funzionale proteina ricombinante. Qui, descriviamo metodi per generare vettori di espressione e successiva espressione proteica transiente in cellule lepidotteri disponibili in commercio. La co-localizzazione di Bemisia tabaci acquaporine con proteine marker fluorescenti subcellulare è anche presentato.

Abstract

Sistemi di espressione di proteine ​​eterologhi vengono utilizzati per la produzione di proteine ​​ricombinanti, l'interpretazione di cellulari traffico / localizzazione, e la determinazione della funzione biochimica delle proteine ​​a livello sub-organismi. Sebbene i sistemi di espressione baculovirus sono sempre più utilizzati per la produzione di proteine ​​in numerose biotecnologico, farmaceutico e applicazioni industriali, sistemi nonlytic che non coinvolgono infezione virale benefici evidenti ma sono spesso trascurati e sottoutilizzate. Qui, si descrive un metodo per la generazione di vettori di espressione nonlytic e l'espressione della proteina ricombinante transiente. Questo protocollo consente la localizzazione cellulare efficace delle proteine ​​ricombinanti e può essere utilizzato per discernere rapidamente proteina trafficking all'interno della cellula. Mostriamo l'espressione di quattro proteine ricombinanti in cellule di insetto commercialmente disponibile, inclusi due proteine acquaporina dalla insetto Bemisia tabaci, nonchécome proteine ​​marker subcellulari specifici per la membrana plasmatica delle cellule e per lisosomi intracellulari. Tutte le proteine ​​ricombinanti sono state prodotte come chimere con marcatori proteici fluorescenti a loro termini carbossile, che consente la rilevazione diretta delle proteine ​​ricombinanti. La doppia transfezione di cellule con plasmidi ospitare costrutti per i geni di interesse e di un marcatore subcellulare noto consente per l'imaging cellulare dal vivo e una migliore validazione di localizzazione delle proteine ​​cellulari.

Introduction

La produzione di proteine ​​ricombinanti utilizzando sistemi di espressione di cellule di insetto offre numerosi vantaggi per lo studio delle proteine ​​eucariotiche. Cioè, cellule di insetto possiedono simili modificazioni post-traduzionali, elaborazione e smistamento meccanismi come quelli presenti in cellule di mammifero, che è vantaggioso per la produzione di proteine correttamente ripiegate ^{1, 2, 3.} Sistemi cellulari di insetto anche in genere richiedono meno risorse e meno tempo e fatica per la manutenzione di linee cellulari di mammiferi ^4,

Protocol

1. OE-PCR per la costruzione di plasmidi di espressione

Nota: Vedi Tabella 1 per tutti i primer utilizzati in OE-PCR. L'uso di un DNA polimerasi ad alta fedeltà è consigliato per tutte le amplificazioni. Tuttavia, poiché questi enzimi spesso non lasciano 3' A, è necessario effettuare una breve non amplificando incubazione, con una polimerasi Taq DNA a 'A-coda' della PCR prodotti prima loro clonaggio in un'espressione TA cellula di insetto vettore. Questo protocollo illustra un metodo per generare i plasmidi di espressione insetti ospitare proteine chimeriche, con le proteine fluorescenti fuse in-frame al....

Results

OE-PCR

OE-PCR consente la sintesi di prodotti di DNA chimeriche che, una volta inserito in un vettore di espressione, per consentire la produzione di proteine ​​chimeriche ricombinanti corrispondenti a qualsiasi gene prova di interesse e l'proteina marcatore fluorescente. La figura 1 rappresenta uno schema generale per la produzione di vettori di espressione contenenti PiB B. aquaporin tabaci se.......

Discussion

Sistemi di espressione di proteine eterologhe sono strumenti importanti per la produzione di proteine ricombinanti utilizzati in numerose applicazioni a valle ^4. Scegliendo tra i diversi sistemi di espressione disponibili dipende l'obiettivo finale per la proteina di interesse. Diversi sistemi di espressione delle cellule di insetto sono disponibili che offrono alternative flessibili per sistemi di espressione delle cellule procariote ed eucariote ^5,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA polimerasi	EMD Millipore	71085-3	DNA polimerasi ad alta fedeltà utilizzata per l'amplificazione PCR di prodotti PCR di estensione di sovrapposizione
ExTaq DNA polimerasi	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polimerasi utilizzata per l'A-tailing di prodotti PCR
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA polimerasi Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polimerasi utilizzata per la PCR
di colonie battericheBiometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contiene i componenti necessari per clonare i prodotti della PCR di estensione della sovrapposizione, tra cui il vettore pIB/V5-His-TOPO linearizzato e topoisomerasi I-attivato, l'E. coli chimicamente competente One Shot TOP10 e la soluzione salina.
Kit QIAprep Spin MiniPrep	Qiagen	27104
QIAcube Postazione di lavoro robotica	Qiagen	9001292
Purificatore Banco pulito verticale	Labconco	3970401
Tni Linea di cellule di insetti coltivati	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 Linea di cellule di insetti coltivati	Allele	Biotech ABP-CEL-10002
Terreno di coltura per insetti senza siero	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Terreno per coltura di insetti	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Mezzo per insetti	ThermoFisher	11405081
Reagente di trasfezione Cellfectin II	ThermoFisher	10362100
Raschietti cellulari monouso da 16 cm	Sarstedt	83.1832	Cell raschietti con lama a due posizioni
25 cm2 (T25) Palloni per colture tissutali con tappi filtranti di sfiato Prodotti per	scienze della vita	CT-229331
Pipette di trasferimento	Fisher
sterili, provette per bioreazione da 50 mL Prodotti	le scienze della vita	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL sierologico Pipette	Sarstedt	86.1253.001
Provette per PCR a tappo piatto da 0,5 mL	Fisher	14230200
Polipropilene Sacchetti per autoclave a rischio biologico	Fisher	01828C
Piatti con fondo in vetro da 35 mm #1,5 mm Vetro	Matsunami	D35-14-1,5-U	Diametro del piatto da 35 mm, diametro del vetro da 14 mm, spessore del vetro da 1,5 mm, non rivestito
Incubatore, modello 1510E	VWR	35823-961
Contatore di cellule Countess II FL	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Vetrini per camera di conteggio cellulare con reagente blu di tripano allo 0,4%	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Microscopio confocale a scansione laser	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmidico DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
Reagente NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605