Articolo metodologico

In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

DOI:

10.3791/55757

⸱

9 agosto 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un metodo per sfruttare in modo efficiente il potenziale di differenziazione cardiache di giovane fonti di cellule staminali mesenchimali umane al fine di generare cellule funzionali, contraenti, del cardiomyocyte-come in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infarto miocardico e la successiva cascata ischemica causare la vasta perdita di cardiomiociti, che porta a insufficienza cardiaca congestizia, la principale causa di mortalità in tutto il mondo. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono un'opzione di promessa per le terapie basate sulle cellule sostituire tecniche attuali, invasive. MSCs possono differenziare in lignaggi mesenchymal, inclusi i tipi di cellule cardiache, ma completa differenziazione in cellule funzionali non è ancora stato raggiunto. Metodi precedenti di differenziazione sono stati basati su agenti farmacologici o fattori di crescita. Tuttavia, le strategie più fisiologicamente pertinenti anche possono abilitare MSCs per subire la trasformazione cardiomiogenici. Qui, presentiamo un metodo di differenziazione utilizzando MSC aggregati sugli strati dell'alimentatore del cardiomyocyte per produrre del cardiomyocyte-come le cellule contraenti.

Cellule perivascolari del cordone ombelicale umano (HUCPVCs) sono state indicate per avere una maggiore differenziazione potenziale più comunemente studiato tipi di MSC, quali midollo osseo (BMSC) MSCs. Come fonte di ontogeneticamente più giovane, abbiamo studiato il potenziale di cardiomiogenici di HUCPVCs di primo-acetonide (FTM) rispetto alle più vecchie fonti. HUCPVCs FTM sono una romanzo, ricca fonte di MSCs che mantengono la loro nell'utero nuova proprietà una volta coltivate in vitro. Utilizzando questo protocollo di differenziazione, FTM e termine HUCPVCs raggiunto cardiomiogenici significativamente maggiore differenziazione rispetto alle BMSCs, come indicato da aumentata espressione di marcatori dei cardiomiociti (cioè, il fattore di rinforzatore del miocita 2C, troponina cardiaca T, miosina cardiaca catena pesante, segnale proteina regolatrice α e connexin 43). Mantennero anche significativamente più bassa immunogenicità, come dimostrato dalla loro espressione di HLA-A più bassa e più alta espressione di HLA-G. L'applicazione basata su aggregazione differenziazione, FTM HUCPVCs ha mostrato formazione aumentata aggregata potenziale e generato contraenti cluster di cellule entro 1 settimana di co-coltura su livelli cardiaci alimentatore, diventando il primo tipo MSC a farlo.

I nostri risultati dimostrano che questa strategia di differenziazione può sfruttare efficacemente il potenziale cardiomiogenici di giovani cellule staminali mesenchimali, quali HUCPVCs FTM e suggerisce che in vitro pre-differenziazione potrebbe essere una strategia potenziale per aumentare la loro efficacia rigenerativa in vivo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insufficienza cardiaca congestizia (CHF) persiste come delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Il CHF accade spesso seguendo la perdita massiccia di cardiomiociti e lo sviluppo del tessuto di cicatrice senza cellula come risultato patologico di un infarto miocardico (MI)1. Mentre il cuore è un organo parzialmente autorinnovabile, piscina di cella residente, staminali e progenitrici, responsabile per l'esecuzione di rigenerazione tissutale significativamente diminuisce in abbondanza e la funzione in pazienti invecchiati, diventando spesso insufficiente per un recupero ottimale dopo la ferita. Così, c'è grande interesse nello sviluppo di trattamenti sperimentali che coinvolgono il trapianto delle cellule del donatore sano nel miocardio danneggiato. È imperativo che le cellule del donatore non solo ripristino la struttura del tessuto, ma anche realizzare il recupero funzionale del miocardio interessato.

Cuore natale impiega cuore tessuto residenti e cellule staminali endogene del midollo osseo-originario di alberino-ferita riparazione2,3,4. Donatore-derivati rigenerativa e di cellule-host allo stesso modo, deve avere la capacità di ottenere il fenotipo appropriato e funzione nel microambiente del miocardio che ritocco, insieme alla capacità di efficienza e sicurezza sostituire le cellule perse. Metodi di differenziazione in vitro sono stati ampiamente utilizzati per realizzare dei cardiomiociti ad alta efficienza, basati su cellule staminali produzione5,6. Il profilo di espressione di marcatori di linea cardiaca viene utilizzato per definire il processo di differenziazione delle cellule staminali verso la linea cardiaca7. Marcatori di precoce differenziazione, quali NKX 2.5, fattore di rinforzatore del miocita 2C (Mef2c) e GATA48,9, può essere un'indicazione dell'inizio del processo di cardiomiogenici. Marcatori del cardiomyocyte maturo comunemente usati per valutare l'efficacia di differenziazione sono segnale proteina regolatrice α (SIRPA)10, troponina cardiaca T (cTnT)11, catena pesante della miosina cardiaca (MYH6)8,12,13e connessina 43 (Cx43)14,15,16. I metodi di utilizzo di cellule staminali embrionali (ESCs) e cellule staminali pluripotenti (PSC) sono stati accuratamente ottimizzati e discussi per quanto riguarda i dettagli di fattori induttivi, ossigeno e nutrienti gradienti e l'esatta tempistica di azione5,6,7,17,18. Ciò nonostante, tecnologie basate su ESC e PSC presentano ancora più preoccupazioni etiche e sicurezza, insieme non ottimali caratteristiche elettrofisiologiche ed immunologiche19,20. Padroni di casa trapiantati con queste cellule spesso esperienza immunorejection e richiedono l'immunosoppressione permanente. Ciò è dovuto principalmente molecole di istocompatibilità (MHC) complesse nell'ospite ed il donatore e il risultante della T-cellula risposta21di disadattamento. Mentre singoli MHC di classe I di corrispondenza è una possibile soluzione, una pratica clinica più accessibile richiederebbe una fonte di cellule che universalmente è nuova per superare la preoccupazione del rifiuto.

Come fonte alternativa cellulare per l'uso in applicazioni cliniche, MSCs e in particolare, BMSC, sono stati studiati per l'uso nella rigenerazione del tessuto dalla loro descrizione iniziale nel 199522. MSCs sono creduti per essere cellule rigenerative residenti che possono essere trovate in quasi qualsiasi tessuto vascolarizzato23. Isolamento dalla sorgente desiderata, MSCs possono essere facilmente espanse in coltura, hanno capacità estesa paracrine e possiedono spesso nuova o immunomodulatori proprietà24,25. Loro sicurezza ed efficacia hanno già dimostrati in parecchi studi pre-clinici, in particolare per la rigenerazione cardiaca3,26.

Molte strategie di differenziazione di MSC utilizzano agenti farmacologici, quali 5-azacytidine22 e DMSO27e crescita o fattori morfogenetici, come BMPs5,7,28,29 o dell'angiotensina-II30, con efficienza variabile. Queste strategie, tuttavia, non sono basate sugli ostacoli che una cella rigenerativa ingenuo è probabile incontrare dopo homing o recapitati al sito della lesione in vivo. Strategie più fisiologicamente rilevanti, mentre più difficile da definire e manipolare, si basano sulla premessa che MSC differenziazione può essere indotta attraverso segnali dal microambiente del tessuto stesso. Gli studi precedenti hanno dimostrato che l'esposizione alla cellula cardiaca lisati31 o miocardio ventricolare32,33, o diretto contatto con primaria cardiomiociti in vitro15,34, può aumentare l'espressione di marcatori cardiaci in MSCs. Gli altri hanno dimostrato cardiomiogenesi spontanea dopo trattamento di lesioni cardiache con MSCs35,36,37,38, anche se in parte, la fusione di BMSC e cardiomiociti39,40 generato il miocardio nascente. A nostra conoscenza, non sono ancora stati segnalati cardiomiociti funzionali, spontaneamente contraenti da MSCs umane (hMSCs) di qualsiasi origine di tessuto.

Il consenso corrente è che tutti i MSCs derivano da perivascolari cellule23. MSCs giovane con proprietà Pericita può essere isolato dalla regione perivascolare del cordone ombelicale umano tessuto41,42,43. Rispetto alle BMSCs, HUCPVCs possiedono una maggiore differenziazione potenziale e diversi altri vantaggi rigenerative, entrambi in vitro41,44 ed in vivo45,46,47. In particolare, la fonte che è l'interfaccia materno-fetale, HUCPVCs le immunogenicità significativamente più basso rispetto alle fonti di adulti di MSCs. La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione e applicazioni pre-cliniche di FTM HUCPVCs, la fonte più giovane di MSCs studiato, che precedentemente abbiamo indicato sono aumentati multilineage proliferative e superiore capacità di differenziazione, tra cui nel lignaggio cardiomiogenici41.

Qui, presentiamo un protocollo che unisce formazione aggregata e strati dell'alimentatore primario delle cellule cardiache come forze induttive per raggiungere la differenziazione di cardiomiogenici completa di MSCs. aggregati forniscono un ambiente 3D, che modelle migliori condizioni in vivo rispetto al 2D culture aderente. Utilizzando livelli cardiaci alimentatore fornisce un ambiente che è rappresentante del sito ultimate trapianto per MSCs. Dimostriamo che più giovane fonti di cellule staminali mesenchimali isolate da cordone ombelicale pre- o post-natali hanno una maggiore capacità di formare aggregati e raggiungere il fenotipo cardiaco rispetto al BMSCs adulto, mantenendo comunque il loro privilegio immunitario. Oltre la ripida elevazione dei geni marcatori di linea cardiaca e l'espressione indotta di intracellulare (cioè, cTnT e MYH6) e proteine di superficie cellulare (vale a dire, SIRPA e Cx43) specifico per cardiomiociti, indichiamo che il potenziale di differenziazione di FTM HUCPVCs possa essere imbrigliato con questo metodo e che possono dare origine a spontaneamente contraenti del cardiomyocyte-come le cellule.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti e riportati secondo le linee guida ARRIVED48. Tutti gli studi sono stati condotti con l'approvazione del comitato etico della ricerca istituzionale (REB numero 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Università di Toronto, Toronto, Canada). Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali della University Health Network (Toronto, Canada) e tutti gli animali hanno ricevuto cure umane in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8a edizione (National Institutes of Health 2011).

1. Coltura dei tessuti

  1. Coltura FTM HUCPVCs, termine HUCPVCs (precedentemente stabilito, n ≥ 3 linee indipendenti per ciascuna)42 e BMSC disponibili in commercio in terreno alfa-minimo essenziale (MEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e un cocktail di penicillina/streptomicina (P/S) all'1%. Coltura di cardiomiociti primari di ratto e co-colture MSC-cardiomiociti nel terreno Eagle modificato di Dulbecco: miscela di nutrienti F-12 (DMEM-F12) contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S.
    NOTA: Sterilizzare il mezzo utilizzando un filtro da 0,2 μm. Conservare le soluzioni di terreno preparate a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
  2. Mantenere le colture cellulari in incubatori umidificati (95% di umidità relativa, 37 °C e 5% di CO2) e il passaggio al 70-80% di confluenza, determinato mediante microscopia a contrasto di fase. Utilizzare volumi di terreno adeguati alle dimensioni della piastra di coltura tissutale utilizzata (ad esempio, 10 mL in una piastra da 10 cm e 2 mL per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti). Utilizzare queste condizioni di cultura per la durata del protocollo.
  3. Dissociare i monostrati di MSC per il passaggio o l'instaurazione della co-coltura di MSC-cardiomiociti utilizzando una soluzione di enzima di dissociazione (2 mL/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e incubare a 37 °C per 4 minuti.
  4. Trasferire le cellule dissociate in una provetta da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti.
  5. Aspirare il surnatante senza interrompere il pellet cellulare e risospendere le cellule in 1 mL di un terreno di coltura appropriato per il conteggio utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Semina le celle come descritto nelle seguenti sezioni del protocollo.

2. Preparazione di co-colture primarie di cardiomiociti di ratto-MSC

  1. Ottenere il tessuto cardiaco per l'isolamento primario dei cardiomiociti.
    1. Eutanasia dei cuccioli di ratto (5-6 giorni dopo la nascita) utilizzando l'asfissia da CO2. Impostare le camere di CO2 al 20% di sostituzione del gas (portata = 0,2 x volume della camera al minuto). Confermare l'exitus con l'assenza del riflesso di pizzicamento.
    2. Rimuovere gli atri con i principali vasi sanguigni di collegamento utilizzando strumenti sterilizzati (ad esempio, pinze e forbici curve)41. Trasferire i cuori in provette da 50 ml contenenti PBS sterile con 1% P/S (PBS-P/S) su ghiaccio.
    3. Tagliare i ventricoli a metà e lasciare che il sangue venga lavato in un piatto di 10 cm con 10 ml di PBS-P/S con ghiaccio. Tagliare le pareti ventricolari in piccoli pezzi (diametro = 2-3 mm) utilizzando le forbici curve.
    4. Trasferire i pezzi di cuore di 10-12 animali in una provetta da 50 ml utilizzando una pipetta sierologica e lasciarli riposare.
    5. Rimuovere quanto più PBS-P/S possibile senza rimuovere alcun pezzo di cuore. Aggiungere 10 mL di nuovo PBS-P/S.
  2. Digerire il tessuto cardiaco per isolare i cardiomiociti.
    1. Lascia che i pezzi del cuore si depositino. Sostituire il PBS-P/S con 10 mL di tripsina allo 0,15% in PBS e agitare a 37 °C per 10 minuti.
    2. Scartare il surnatante. Ripetere la digestione descritta al punto 2.2.1 altre tre volte, ma travasare i surnatanti in provette di raccolta da 50 mL contenenti 10 mL di FBS al 100%.
  3. Centrifugare le cellule (400 x g, 5 min) e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in DMEM-F12 contenenti il 10% di FBS e l'1% di P/S e seminare su una piastra a 6 pozzetti (1 x 105 cellule/cm2, 2 mL di terreno per pozzetto).
  4. Dopo 1 ora, trasferire il terreno contenente le cellule non attaccate in una provetta da 50 ml ed eliminare le cellule attaccate. Contare le cellule in sospensione e ripiastarle in nuove piastre a 6 pozzetti (1 x 10,5 cellule/cm2, 2 mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S per pozzetto).
  5. Inibire la proliferazione cellulare con la bromodeossiuridina (BrdU).
    Attenzione: BrdU è un forte teratogeno e sospetto mutageno. Assicurarsi che venga fornita una formazione adeguata e fare riferimento alla scheda di sicurezza prima dell'uso.
    1. Una volta che le cellule si sono attaccate, sostituire il terreno nella piastra a 6 pozzetti con DMEM-F12 contenente il 10% di FBS, l'1% di P/S (2 mL di terreno per pozzetto) e 5 μM di BrdU. Incubare per 16 ore (37 °C, 5% CO2).
    2. Rimuovere il terreno contenente BrdU e sostituirlo con DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S (2 mL di terreno per pozzetto).
  6. Preparare MSC pre-colorate.
    1. Una volta che le colture di MSC hanno raggiunto la confluenza del 70-80% in piastre da 10 cm, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 3 mL di soluzione di dissociazione cellulare. Incubare la capsula a 37 °C e 5% di CO2 per 5 minuti.
    2. Trasferire le cellule dissociate in una provetta da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti.
    3. Aspirare il surnatante senza interrompere il pellet cellulare e risospendere le cellule in 1 mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S per il conteggio utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
    4. Diluire le cellule a una concentrazione di 1 x 106 MSC/mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S.
    5. Incubare le MSC con un colorante fluorescente vitale e non trasferibile (5 μM, 30 min, 37 °C, 5% CO2) in provette da centrifuga da 1,5 mL per 1 ora.
    6. Centrifugare le provette a 400 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S per una concentrazione cellulare di 1 x 106 MSC/mL. Ripeti l'operazione per un totale di 3 volte.
  7. Trasferire le MSC sui cardiomiociti (passaggio 2.5.2) a una concentrazione di 10 x 104 cellule per pozzetto della piastra a 6 pozzetti.

3. Preparazione di Co-culture Aggregate

  1. Preparare una sospensione unicellulare di MSC (2 x 10,4 cellule/mL di terreno, passaggio # ≤ 6) in alfa-MEM, addizionata con il 10% di FBS e l'1% di P/S (vedere il passaggio 2.6).
    NOTA: Fare riferimento alla sezione 1 del protocollo per il passaggio delle celle. In alternativa, pre-colorare le MSC come indicato al punto 2.6.
  2. Avviare la formazione degli aggregati posizionando 25 μl di gocce di sospensione cellulare (500 cellule) sulla superficie interna dei coperchi di piastre di coltura tissutale da 10 cm (fino a 50 gocce per coperchio). Posizionare i coperchi sulle controparti inferiori contenenti PBS-P/S. Incubare a 37 °C e 5% CO2.
    NOTA: Inserire 5-7 ml di PBS-P/S nel piatto di coltura sotto le gocce pendenti per evitare l'evaporazione delle gocce.
  3. Osservare la formazione di aggregati nelle gocce dopo 3 giorni utilizzando uno stereomicroscopio. Se più di 40 gocce su 50 contengono aggregati formati, raccogliere le gocce dai coperchi utilizzando una micropipetta da 1 ml e trasferire gli aggregati direttamente su monostrati primari di cardiomiociti di ratto (preparati nei passaggi 2.1-2.7; 10 gocce/pozzetto). Evitare il pipettaggio energico per preservare l'integrità dell'aggregato.
  4. Conservare le co-colture aggregate negli incubatori per un massimo di 2 settimane, cambiando l'intero volume del terreno (2 mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S per pozzetto) ogni 72 ore.
    1. Osserviamo quotidianamente gli aggregati che si attaccano agli strati di cellule di alimentazione utilizzando la microscopia a campo chiaro. Registra gli aggregati di contrattazione quando osservati.
  5. Preparare gli aggregati per l'analisi.
    1. Rimuovere il terreno e aggiungere 2 mL di PBS per pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti. Rimuovere il PBS e aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione per pozzetto. Incubare per 3 minuti a 37 °C e 5% CO2.
    2. Centrifugare a 400 x g per 5 min fino ad ottenere un pellet di cella. Risospendere in terreno, come specificato per le applicazioni descritte nei passaggi successivi (vedere i passaggi 4.1, 5.1 e 6.1) e passare attraverso un filtro a celle da 70 μm.

4. Citometria a flusso (FC) e selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS)

  1. Incubare sospensioni cellulari (1 x 105 cellule in 200 μl di PBS contenente il 3% di FBS) con anticorpi primari fluoroforo-coniugati (FITC o APC) (ad es. CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G e SIRPA per FC o TRA-1-85 per FACS; 1:40) a 4 °C per 30 minuti, al riparo dalla luce.
  2. Centrifugare (400 x g, 5 min) e risospendere le cellule in 1 mL di PBS con FBS al 3% per FC o PBS con FBS allo 0,5% per FACS.
    NOTA: La FC delle MSC è stata ottimizzata da Hong et al.41.
  3. Mantenere le celle a 4 °C al buio fino a quando non sono pronte per essere analizzate da FC (almeno 1 x 104 eventi) o FACS. Ordina le celle come descritto41. Ripiastrella le cellule selezionate ad alta positività TRA-1-85 in piastre a 6 pozzetti (1 x 104 cellule/pozzetto, 2 mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S) entro 1 h.
    NOTA: Per la strategia di gating dell'antigene di superficie cellulare umana TRA-1-85, vedere la figura supplementare.

5. Immunocitochimica (ICC) e microscopia

  1. Ri-placcare le sospensioni cellulari ottenute dalle co-colture (passaggio 3.5.2) o FACS (sezione 4) su vetrini da camera (1 x 104 cellule/pozzetto, 2 mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S per pozzetto). Lasciare che le cellule si attacchino per una notte in un incubatore per colture tissutali (vedere paragrafo 1 per le condizioni).
  2. Fissare le cellule utilizzando 3 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con 3 ml di PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina (BSA; PBS-BSA) per 5 minuti per lavaggio.
    Attenzione: Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati quando si maneggiano PFA.
  3. Permeabilizzare le cellule in 3 mL di PBS-BSA con Triton X-100 allo 0,1%. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per gli antigeni intracellulari (ad es. actinina alfa sarcomerica (aSarc) e Cx43) o 25 minuti per gli antigeni intranucleari (ad es. Mef2c e antigene nucleare umano (HuNu)). Lavare 3 volte con 3 ml di PBS-BSA per 5 minuti per lavaggio.
  4. Bloccare i campioni contro le reazioni anticorpali non specifiche con 3 mL di PBS contenente il 5% di siero di capra normale (NGS) e l'1% di BSA per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con 3 ml di PBS-BSA per 5 minuti per lavaggio.
  5. Incubare le cellule negli anticorpi primari (cioè Mef2c, aSarc, Cx43 e HuNu) diluiti 1:200 in 3 mL di PBS-BSA a 4 °C durante la notte.
  6. Lavare 3 volte con 3 mL di PBS-BSA per 5 minuti per lavaggio e incubare con anticorpi secondari per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con 3 ml di PBS-BSA per 5 minuti per lavaggio.
  7. Conservare i campioni colorati in 3 mL di terreno di montaggio.
  8. Acquisizione di immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza. Utilizzare un obiettivo 10X (NA = 0,3) e un obiettivo 20X (NA = 0,45) per immagini con ingrandimento inferiore. Utilizzare cubi filtranti a fluorescenza e lunghezze d'onda per GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) e RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) per gli anticorpi secondari utilizzati (vedere la tabella dei materiali e delle apparecchiature).
  9. Quantificare le immagini utilizzando il software di imaging (vedere la tabella dei materiali e delle attrezzature per il software consigliato). Normalizza le letture dell'intensità della fluorescenza per le acquisizioni di controllo secondario.

6. Isolamento dell'RNA e RT-PCR quantitativa

  1. Preparare campioni di RNA da colture di MSC indifferenziate o MSC selezionate da co-colture utilizzando l'isolamento dell'RNA basato su colonna, secondo le istruzioni del produttore. Preparare da 1 x 104 a 1 x 106 cellule in 0,7 mL di tampone di lisi cellulare (fornito con il kit di isolamento dell'RNA) per campione.
  2. Preparare il cDNA da un massimo di 2 μg di RNA per reazione RT da 100 μL.
  3. Eseguire la qPCR utilizzando 10 ng di cDNA per reazione (40 cicli, temperatura di ricottura/estensione a 60 °C).
    1. Utilizzare primer per MY6H e cTnT umani in una concentrazione di 500 nM e 1-100 ng di cDNA per reazione (vedere la tabella dei materiali e delle attrezzature). Utilizzare GAPDH, ACTB e HPRT come normalizzatori interni per la gestione delle pulizie. Utilizzare cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo disponibili in commercio come controllo positivo.
      NOTA: Esprimere il fold-change di espressione rispetto ai campioni di cDNA indifferenziati derivati da MSC.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli HUCPVC mostrano un potenziale di formazione aggregata e livelli di espressione CD49f più elevati rispetto ai BMSC:

Per indurre la differenziazione delle hMSC (cioè HUCPVC FTM, HUCPVC a termine e BMSC), sospensioni di singole cellule di MSC indifferenziate o gocce sospese contenenti MSC (Tabella 1) sono state trasferite su monostrati di cardiomiociti primari di ratto per stabilire ri...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La differenziazione delle cellule staminali cardiaca è stato in sviluppo per oltre 2 decenni, con diverse strategie diverse, viene utilizzate per generare del cardiomyocyte-come le cellule da fonti di MSC. Molte di queste strategie, tuttavia, sono inefficienti, e le condizioni utilizzate spesso non sono rappresentative dell'ambiente trapiantate cellule incontro in vivo.

In contrasto con i metodi esistenti, il protocollo presentato qui utilizza una combinazione di strati di alimentator...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Clifford L. Librach è contitolare del brevetto: metodi di isolamento e di uso di cellule derivate da tessuti di cordone ombelicale primo acetonide, concessa in Canada e in Australia.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziare i seguenti membri del personale e personale per i loro contributi di ricerca: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg e Andrée Gauthier-Fisher. Questo lavoro è stato supportato dal fondo di ricerca The Ontario - l'eccellenza della ricerca (ORF-RE, Round #7) e creare programma Inc.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% Tripsina/EDTAGibco25200056Per la dissociazione cellulare
Alpha-MEMGibco12571071Per terreni di coltura HUCPVC e BMSC.
Anticorpo CD49f anti-umano/topo coniugato PEBiolegend313612Marcatore di integrina per l'anticorpo
umano Cx43/GJA1 coniugato FC APCR& D SystemsFAB7737Amarcatore Connexin 43 per
l'anticorpo HLA-A2 coniugato FC FITCGenway Biotech Inc.GWB-66FBD2Marcatore di immunogenicità per
l'anticorpo FC FITC-coniugato anti-HLA-G [MEM-G/9]Abcamab7904Marcatore di immunogenicità per
l'anticorpo FC SIRPA/CD172a di topo coniugato con FC FITC anticorpo umano SIRPA/CD172aAbD Serotec/Bio-RadMCA2518FMarcatore cardiaco per
l'anticorpo umano coniugato FC APC TRA-1-85/CD147R& D SystemsFAB3195AMarcatore cellulare umano per FC e FACS
FITC-coniugato TRA-1-85/CD147 anticorpoR& D SystemsFAB3195FMarcatore cellulare umano per FC e FACS
Anticorpo anti-connessina 43/GJA1Abcamab11370Cx43. Per
l'anticorpo secondario ad assorbimento incrociato IgG (H+L) anti-coniglio di capra ICC, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428Per l'anticorpo anti-alfa
acticina [EA-53] anti-sarcomericoICC Abcamab9465aSARC. Per
l'anticorpo secondario ad assorbimento incrociato a catena pesante IgM anti-topo ICC Goat, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426per
l'anticorpo di coniglio ICC Mef2C (D80C1) XPNew England BioLabs Ltd.5030SPer ICC
Asino anti-coniglio Anticorpo IgG (H+L) anticorpo, Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206Per ICC
Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) AnticorpoEMD MilliporeMAB1281Per ICC
MZ9.5 StereomicroscopioLeicaPer aggregati di imaging.
Microprovette da centrifuga da 1,5 mlAxygenMCT-150-CPer la colorazione di MSC con colorante fluorescente.
ImageJSoftware open source per l'elaborazione delle immagini.
Aria II Struttura BDUHN SickKids FC. Per lo smistamento cellulare.
Cellule stromali mesechimali del midollo osseoLonzaPT-2501BMSC Albumina
sierica bovinaSigma-AldrichA7030-100GBSA. Per preparare le soluzioni per ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424Attenzione: BrdU è un forte teratogeno e sospetto mutageno. Assicurarsi di garantire una formazione adeguata e fare riferimento alla SDS prima dell'uso.
Canto IIBDUHN SickKids FC Facility. Per citometria a flusso.
cDNA EcoDry PremixClontech/Takara639570Per la preparazione di cDNA per qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025Imaging fluorescente del citoplasma cellulare
Contatore cellulare automatizzato CountessInvitrogen Inc.C10227Per la conta cellulare
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421Per il terreno di coltura primaria di cardiomiociti di ratto.
Gibcosalino tamponato con fosfato di Dulbecco10010023D-PBS, senza Ca2+, Mg2+
EVOSLife TechnologiesMicroscopio fluorescente interno
FACSCaliburBDIn-house. Per citometria a flusso.
Siero fetale bovino (Hyclone)GE HealthcareSH3039603FBS. Componente del terreno di coltura cellulare.
Sonde qPCR IDT Prime TimeTecnologie dati integrate FluoroforoFAMhttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Terreno di montaggio acquosoThermoScientificTA-030-FMPer la conservazione di cellule da sottoporre a ICC
LSR II Struttura BDUHN SickKids FC. Per citometria a flusso.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Facility. Per lo smistamento cellulare.
Siero di capra normaleTecnologia di segnalazione cellulare5425SNGS. Utilizzato nella soluzione di blocco per ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8 pozzettiThermo Scientific Nunc155409 Per preparare campioni per ICC
OmniPur Triton X-100 TensioattivoEMD Millipore9410-OPCome componente della soluzione permeabilizzante durante la preparazione di celle per ICC
Paraformaldeide, soluzione al 16%,Microscopia elettronicaScienze 15710Per il fissaggio di celle per ICC.
Penicillina/streptomicinaGibco15140122Componente del terreno di coltura cellulare.
PrimerSigmaCustom Standard DNA Oligos, Dissalato, 0.2 μ molCTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC A; CTnT_R: GAG GAG CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG
Quorum Disco rotante confocaleZeissSickKids Imaging Facility
ReproCardio Cardiomiociti derivati da cellule hiPSReproCellRCD001NControllo positivo per qPCR
RNeasy mini kitQiagen74106Per isolare l'RNA per qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074Per qPCR con master mix
RPMI 1640GibcoA1049101Per MSC, terreno di cocoltura di monociti.
Saggi di primer TaqMan qPCRThermo Fisher Scientific4444556Per qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Colorazione delle cellule per la vitalità e il conteggio
TripsinaGibco272500108Per la dissociazione cellulare
VolocityPerkin-ElmerVolocity 6.3Software di imaging
0,2 μ filtro a porim Thermo Fisher Scientific566-0020Per la sterilizzazione di terreni di coltura tissutale
HERAcell 150i CO2 IncubatoreThermo Fisher Scientific51026410Per l'incubazione di cellule
Soluzione salina tamponata con fosfato di DulbeccoSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio
PinzeAlmedic7727- A10-704Per la consegna del cuore di topo. Può usare qualsiasi pinza simile.
ForbiciFine Science Tools14059-11Per tritare il cuore di topo. Si consigliano forbici curve.
Provetta da 50 mLBD Falcon352070Per la raccolta durante la raccolta di cardiomiociti e le procedure generali di coltura tissutale
Tubo da 15 mLBD Falcon352096Per le procedure generali di coltura tissutale
6 pozzettiThermo Scientific NuncCA73520-906Per la coltura tissutale
Piastre per colture tissutali da 10 cmCorning25382-428Per la formazione di aggregati
Microscopio Axiovert 40CZeissPer l'imaging in campo chiaro attraverso la coltura dei tessuti e il resto del protocollo
70 μ filtro per cellule mFisherbrand22363548Per garantire una sospensione di una singola cellula prima della citometria a flusso o della selezione
Triton X-100EMD Millipore9410-1LUtilizzato nella soluzione di permeabilizzazione per ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Colorante utilizzato durante la visualizzazione della localizzazione Cx43
di grado EM piastre a

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1(2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767(2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4(2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252(2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Differenziamento dei cardiomiocitiformazione di aggregatistrati feeder cardiacicitometria a flussomicroscopia a fluorescenzamarcatori dei cardiomiocitidifferenziamento delle HUCPVCvalutazione dell immunogenicitcluster cellulari contrattili

Articoli correlati