Viene descritto un protocollo per la determinazione delle densità di fase vitrea di gocce di dimensioni micro-pico-litri di miscele acquose a temperature criogeniche.
Articolo metodologico
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Viene descritto un protocollo per la determinazione delle densità di fase vitrea di gocce di dimensioni micro-pico-litri di miscele acquose a temperature criogeniche.
Abbiamo dimostrato un metodo per determinare le densità di temperatura criogenica a fase vitrea di miscele acquose e altri campioni che richiedono un raffreddamento rapido, per preparare la fase di temperatura criogenica desiderata. I microlitri a gocce di dimensioni del picoliter vengono raffreddate proiettando in una miscela di azoto liquido (N 2 -Ar). La fase di temperatura criogenica della goccia viene valutata usando un test visivo correlato alle misure di diffrazione del raggio X. La densità della miscela liquida N 2 -Ar viene regolata aggiungendo N 2 o Ar finché la goccia diventa neutrale. La densità di questa miscela e quindi della goccia è determinata usando una massa di prova e il principio di Archimede. Con la cura appropriata nella preparazione della goccia, la gestione del gas sopra la miscela criogenica liquida per ridurre al minimo la gelosia e la miscelazione regolare della miscela criogenica per prevenire la stratificazione della densità e la separazione di fase, le densità accurate a <0,5% di gocce minori di 50 pLFacilmente determinato. Le misurazioni sulle miscele crioprotettanti acquose permettono di conoscere l'azione crioprotrattante e fornire dati quantitativi per facilitare la corrispondenza della contrazione termica nella crioconservazione biologica.
Le proprietà fisiche dell'acqua e delle miscele acquose nelle loro varie fasi sono di interesse fondamentale e sono importanti per la comprensione in vivo e in vitro dei sistemi biologici. Nella criobiologia contemporanea e nella crioconservazione biologica sono particolarmente interessanti le fasi vitreose o amorfe di miscele crioprotectanti acquose 1 , 2 . La nucleazione e la crescita dei cristalli di ghiaccio possono interrompere le cellule e i tessuti e promuovere la denaturazione e l'aggregazione delle proteine, per cui i protocolli di crioconservazione che vitrificano il solven....
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ATTENZIONE: Prima dell'utilizzo, consultare tutti i fogli di sicurezza relativi ai materiali di sicurezza (MSDS). Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si utilizzano gas compressi, inclusi regolatori e valvole di manipolazione del gas calibrati e tubi approvati del gas. Il contatto con criogenici liquidi può causare gravi lesioni o necrosi. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale (scudo a faccia, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse) che devono essere impermeabili all'azoto liquido. Rimanere in piedi e assicurare un percorso di uscita senza ostacoli dall'apparecchio quando si utilizzano ....
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Le misure di densità a T = 77 K per le gocce vitrificate di glicerolo acquoso e di glicole etilenico rispetto alla concentrazione di crioprotectant sono riportate rispettivamente in Figura 1 A e Figura 1 B e la corrispondente variazione del volume specifico tra T = 298 K e 77 K, calcolata utilizzando precedentemente Determinato T = 298 K densità, è mostrato in
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Gli attuali apparecchi e metodi, sviluppati principalmente da studenti universitari con accesso limitato a strumenti e macchine per la costruzione di strumenti, forniscono tuttavia misurazioni di densità estremamente accurate per singole gocce di liquidi minori di 50 pL. Nel campo di concentrazione vicino e al di sopra del 50% in peso, dove piccoli tassi di raffreddamento sono sufficienti per ottenere campioni vetrificati, le densità sono d'accordo con quelle ottenute nelle precedenti misurazioni sui campioni di mas.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato supportato dal NSF sotto il premio MCB-1330685. DWM riconosce un sostegno parziale dalla Grant di Formazione Molecolare Biofisica dell'Università Cornell (NIH T32GM0082567).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| provetta da centrifuga | Falcon | 6029236 | 15 mL provetta da centrifuga conica |
| glicerolo, >99,5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| glicole etilenico, >99,8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| microbilancia analitica | Mettler | AE240 | Bilancia analitica, risoluzione 0,01 mg, con gancio sul fondo per pesare sotto la bilancia |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparecchio intelaiatura della custodia | Unistrut | 1-5/8" intelaiatura in metallo | 48" di larghezza x 24" di profondità x 40" di altezza |
| Barriera d'aria per l'armadio dell'apparecchio | qualsiasi foglio di plastica trasparente disco | ||
| di gomma | da 1/8" di spessore | ||
| Scilogix Dilvac | SS333 | pallone dewar da 4,5 litri con custodia in acciaio e coperchio a morsetto | |
| camera | in rameQuesta parte fabbricata è composta da un tubo di rame da 1,43" di diametro, 0,017" di spessore della parete con una solida base cilindrica in rame saldata per sigillare un'estremità. La base in rame è alta 0,87" e l'altezza complessiva della camera è di 7". | ||
| gas azoto | Airgas | NI HP300 | 99.998% puro gas N2 |
| gas argon Airgas | AR HP300 | 99.998% puro Ar | |
| gas rotametro | Omega | FL3692ST | 2.52 L/min portata max portata |
| schiuma coperchio | Questa parte è fabbricata da 4 lb/ft3 schiuma di polietilene reticolato (fornita da Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), e ha un diametro esterno di 2,42", e un diametro interno di 1,52", e uno spessore di 0,79". | ||
| di prova in PTFE | Questa parte fabbricata è un cilindro di 0,246" di diametro, alto 0,580" con un foro di 0,060" di diametro che corre perpendicolarmente e interseca l'asse del cilindro ~0,10" da un'estremità. | ||
| Piattaforma microbalance | Unistrut | 1-5/8" telaio | metallico 11" di larghezza x 24" di lunghezza x 24" di altezza telaio rettangolare con un foglio di alluminio superiore contenente un foro per il monofilamento e la massa di prova sospesa |
| 2 mil (50 um) linea monofilamento | Berkley | NF1502-CM | Nanofil lenza |
| Tubo della bobina di preraffreddamento dell'argon | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD Tubo |
| in PVCMiscelatore | Diametro 1,4", disco di rame spesso 35 micron, tagliato da 1 oncia/ft2 foglio di rame e perforato con fori utilizzando un punteruolo o un altro strumento appuntito. Inserire al centro un'asta rigida termoisolante (plastica o legno) di 1-2 mm di diametro e fissarla con resina epossidica secondo necessità. | ||
| siringa | BD | 309628 | 1 mL Luer-Lok tip siringa |
| generatore di vuoto | Gast | VG-015-00-00 | aria compressa venturi monostadio |
| di vuoto spray per rivestimento idrofobico | RainX | 620036 | plastica idrorepellente |
| lunga lunghezza focale stereomicroscopio | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0,67-4 x zoom pod con oculari 20X, distanza di lavoro di 10 cm& nbsp; | |
| Illuminatore anulare a LED | Amscope | LED144S | |
| Illuminatore spot a LED | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED a collo d'oca clamp lampada |
| 1,8 ml fiala criogenica | Nunc | V7634-500EA | Qualsiasi crioviale da 1,8 o 2 mL è adeguato |
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