Protocollo ottimizzato per l'estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana

Summary

La composizione proteica della valvola mitrale umana è ancora parzialmente sconosciuta, perché la sua analisi è complicata da basse cellularità e quindi da bassa biosintesi proteica. Questo lavoro fornisce un protocollo per estrarre efficacemente proteine ​​per l'analisi della proteoma della valvola mitrale.

Abstract

L'analisi del proteome cellulare può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari che sottostanno le malattie dovute allo sviluppo di tecnologie che permettono l'identificazione e la quantificazione su larga scala delle proteine ​​presenti nei complessi sistemi biologici. Le conoscenze acquisite da un approccio proteomico possono portare a un Una migliore comprensione dei meccanismi patogeni che affrontano le malattie, consentendo l'individuazione di nuovi marcatori di malattia diagnostici e prognostici e, speriamo, di obiettivi terapeutici. Tuttavia, la valvola cardiaca mitrale rappresenta un campione molto impegnativo per l'analisi proteomica a causa della bassa mobilità in proteoglicano e matrice extracellulare ricca di collagene. Questo rende impegnativo estrarre le proteine ​​per un'analisi proteomica globale. Questo lavoro descrive un protocollo compatibile con l'analisi proteica successiva, come proteomica quantitativa e immunoblotting. Ciò può consentire la correlazione dei dati riguardantiG con dati sull'espressione mRNA quantitativa e analisi immunoistochimica non-quantitativa. Infatti, questi approcci, se eseguiti insieme, porteranno ad una comprensione più completa dei meccanismi molecolari che stanno alla base di malattie, da mRNA a modifica della proteina post-traduzionale. Quindi, questo metodo può essere rilevante per i ricercatori interessati allo studio della fisiopatologia della valvola cardiaca.

Introduction

Recenti testimonianze hanno alterato la comprensione dei ruoli dei molti meccanismi regolatori che si verificano dopo la sintesi di mRNA. Infatti, i processi traslazionali, post-trascrizionali e proteolitici possono regolare l'abbondanza e la funzione proteica. Il dogma, che afferma che le concentrazioni di mRNA sono proxy a quelle delle proteine ​​corrispondenti, assumendo che i livelli di trascritture sono il determinante principale dell'abbondanza di proteine, è stata parzialmente riveduta. In effetti, i livelli di trascrizione solo parzialmente prevedono l'abbondanza di proteine, suggerendo che gli eventi post-trascrizionali Si verificano per regolare le proteine ​​all'interno delle cellule ^{1 , 2} .

Inoltre, le proteine ​​infine dettano la funzione della cellula e quindi dettano il suo fenotipo, che può subire variazioni dinamiche in risposta ai fattori autocrini, paracrini e endocrini; Mediatori di sangue; temperatura; Trattamento farmacologico; E la malattia si sviluppament. Pertanto, un'analisi di espressione incentrata sul livello della proteina è utile per caratterizzare il proteome e per svelare i cambiamenti critici che si verificano come parte della patogenesi della malattia ³ .

Pertanto, le opportunità che la proteomica presenta per chiarire le condizioni della salute e delle malattie sono formidabili, nonostante le sfide tecnologiche esistenti. Le aree particolarmente promettenti di ricerca a cui la proteomica può contribuire comprendono: l'individuazione dell'espressione alterata di proteine ​​a qualsiasi livello ( cioè cellule intere o tessuti, compartimenti subcellulari e fluidi biologici); L'identificazione, la verifica e la convalida di nuovi biomarcatori utili per la diagnosi e la prognosi della malattia; E, auspicabilmente, l'individuazione di nuovi bersagli proteici che possono essere utilizzati per scopi terapeutici, nonché per la valutazione dell'efficacia e della tossicità farmacologica ⁴ .

Catturare la complessità diIl proteome rappresenta una sfida tecnologica. Gli attuali strumenti proteomici offrono l'opportunità di eseguire analisi su larga scala e ad alto rendimento per l'identificazione, la quantificazione e la convalida dei livelli alterati di proteine. Inoltre, l'introduzione di tecniche di frazionamento e arricchimento, mirante ad evitare le interferenze causate dalle proteine ​​più abbondanti, ha anche migliorato l'identificazione delle proteine ​​includendo le proteine ​​meno abbondanti. Infine, la proteomica è stata completata dall'analisi delle modificazioni post-traduzionali, che emergono progressivamente come importanti modulatori della funzione proteica.

Tuttavia, la preparazione del campione e il recupero delle proteine ​​nei campioni biologici in analisi rimangono ancora i passi limitanti nel flusso di lavoro proteomico e aumentano il potenziale di eventuali insidie ⁵ . Infatti, nella maggior parte delle tecniche di biologia molecolare che devono essere ottimizzate, i primi passi sono l'omogeneizzazione dei tessutiIoni e cellule, soprattutto durante l'analisi di proteine ​​a bassa abbondanza per le quali non esistono metodi di amplificazione. Inoltre, la natura chimica delle proteine ​​può influenzare il proprio recupero. Ad esempio, l'analisi delle proteine ​​altamente idrofobiche è molto impegnativa, perché facilmente precipitano durante la messa a fuoco isoelettrica, mentre le proteine ​​di trans-membrana sono quasi insolubili (esaminate nel Reference 5). Inoltre, la variabilità della composizione tissutale crea una barriera significativa allo sviluppo di un metodo di estrazione universale. Infine, poiché quasi tutti gli esemplari clinici sono di quantità limitata, è essenziale consentire la preparazione di proteine ​​con il massimo recupero e riproducibilità da quantità minime di campioni ⁶ .

Questo lavoro descrive un protocollo ottimizzato per l'estrazione proteica dalla valvola mitrale normale cardiaca umana, che rappresenta un campione molto impegnativo per l'analisi proteomica. La normale valvola mitrale è un compLex che si trova tra l'atrio sinistro e il ventricolo sinistro del cuore ( Figura 1 ). Esso svolge un ruolo importante nel controllo del flusso di sangue dall'atrio al ventricolo, impedendo il flusso di riflusso e assicurando il corretto livello di alimentazione dell'ossigeno per tutto il corpo, mantenendo così un'adeguata uscita cardiaca. Tuttavia, è spesso considerato un tessuto "inattivo", con una bassa cellularità e pochi componenti, principalmente nella matrice extracellulare. Ciò è dovuto al fatto che, in condizioni normali, le cellule interstiziali valvolari residenti (VIC) presentano un fenotipo di riposo con una bassa percentuale di biosintesi proteica ⁷ .

Tuttavia, è stato dimostrato che, in uno stato patologico, il numero di VICs nella spongiosa aumenta e la loro sintesi proteica è attivata, insieme ad altri cambiamenti funzionali e fenotipici ⁸ . Pertanto, non sorprende che i dati minimi disponibili inLa letteratura si concentra sull'analisi delle valvole mitraliche patologiche ^{9 , 10} , in cui l'aumento del numero di VIC attivato potrebbe spiegare il numero relativamente elevato di proteine ​​identificate.

In conclusione, il presente protocollo può servire a sviluppare la comprensione dei meccanismi patogeni responsabili delle malattie delle valvole mitraliche attraverso lo studio di componenti proteici della valvola mitrale. Infatti, una maggiore comprensione dei processi patologici sottostanti potrebbe contribuire a migliorare la gestione clinica delle malattie delle valvole, le cui attuali indicazioni per l'intervento sono in gran parte predicate sulle considerazioni emodinamiche.

Protocol

In questo protocollo, i cuori umani vengono raccolti durante l'esplorazione multiorgano (tempi di ischemia fredda di 4-12 h, media 6 ± 2 h) dai donatori multi-organi esclusi dal trapianto di organi per motivi tecnici o funzionali, nonostante i normali parametri ecocardiografici. Sono inviati alla Banca Tissue Cardiovascolare di Milano, Centro Cardiologico Monzino (Milano, Italia) per l'attività bancaria delle valvole aortiche e polmonari. I volantini posteriori mitraali non vengono utilizzati per scopi clinici, quindi vengono raccolti durante l'isolamento delle valvole aortiche e delle valvole polmonari, dopo che il consenso informato è ottenuto dai parenti dei donatori. Il tessuto per il trapianto e la ricerca viene raccolto solo dopo il consenso dei genitori; Sul foglio di autorizzazione, autorizzano (o non) l'uso del tessuto cardiaco per la ricerca solo se non è idoneo all'uso clinico umano ( ad esempio, problemi microbiologici, funzionali e sierologici), seguendo le linee guida del comitato eticoCentro Cardiologico Monzino.

1. Preparazione della valvola mitrale

1. Raccogliere la valvola mitrale umana il più presto possibile dopo l'esplosione dell'organo (tempo di ischemia fredda di 4-12 h).
2. In una stanza pulita, togliere il cuore dalla borsa di trasporto contenente una soluzione fredda (4 ° C) ( cioè soluzione salina o medie equilibrate Eurocollins o Wisconsin). Metterlo in un secchio e collocarlo in un armadio di biosicurezza (classificazione della classe A, Good Manufacturing Practices (GMP)) per procedere alla preparazione della valvola.
3. Posizionare il cuore su un drappo monouso sterile nell'armadio. Usando un bisturi monouso sterile, tagliare completamente il cuore, perpendicolarmente al suo asse principale, sul livello dei ventricoli sinistro e destro, circa 4 cm di distanza dall'apice.
4. Spostare l'aorta ascendente e l'arteria polmonare per visualizzare il tetto atriale sinistro.
5. Con pinze e scatti sterilizzabili sterilizzabili, tagliare attorno all'orecchio sinistro sullaTetto atriale sinistro, rendendo visibile la valvola mitrale e consentendo di identificare il grande foglietto mitrale (anteriore) e il piccolo foglio mitrale (posteriore).
   NOTA: Gli antero laterali e le commissioni mediali posteriori definiscono il bordo del foglio anteriore e della zona posteriore.
6. Utilizzando forbici sterilizzabili autoclavabili e pinze non traumatiche, dissectare l'atrio sinistro e lo spessore della parete del ventricolo attorno alla circonferenza di tutta la valvola mitrale .
7. Identificare la continuità della valvola mitro-aortica.
   NOTA: Il ventricolo sinistro contiene l'intera valvola mitrale e gli accordi.
8. Separare il foglietto della valvola mitrale anteriore dal foglietto della valvola mitrale posteriore, tagliando il foglio posteriore lungo l'inserimento con il ventricolo (commissure).
9. Lavare il foglietto posteriore nella soluzione salina. Tagliare il foglietto in piccoli pezzi (<1 cm ² ) e avvolgerli individualmente in fogli di alluminio. Snap-congelare con azoto liquido.
   Attenzione: Seguire le procedure di sicurezza organizzative quando si utilizza azoto liquido.
   1. Sanitizzare la tabella dell'armadio con una soluzione alcolica al 70% di isopropilato e una soluzione al perossido di idrogeno al 6% alla fine della procedura.

2. Estrazione della proteina

1. Utilizzare pinze per prelevare il campione immagazzinato in azoto liquido e posizionarlo immediatamente in ghiaccio secco mentre ancora avvolto nel foglio di alluminio. Non lasciare scongelare il campione durante qualsiasi trasferimento.
2. Prima della macinazione, raffreddare il malta di porcellana / zirconio e pestelli di un sistema di macinazione ( ad esempio, CryoGrinder), insieme al campione, inserendoli in un pallone Dewar contenente azoto liquido (~ 500 mL).
   Attenzione: Seguire le procedure di sicurezza organizzative quando si utilizza azoto liquido.
3. Mettere il mortaio e il pestello in una scatola di polistirolo contenente ghiaccio secco. Rimuovere il campione dal foglio di alluminio e inserirlo nella malta.
4. Grind tCampione con il grande pestello contro la malta 15-20 volte, utilizzando il cacciavite per ruotare il pestello. Mescolare il campione con la punta di una spatola pre-raffreddata durante il processo di macinazione.
   1. Ripeti con il piccolo pestello.
5. Trasferire il campione di massa a un tubo precedentemente pesato ( es. Tubo da centrifuga da 15 ml) invertendo il tubo, ponendolo sopra la malta e invertendo insieme per spostare il campione sul tubo. Utilizzare una spatola pre-raffreddata per recuperare tutto il materiale dalla malta.
   1. Tenere il tubo con il campione su ghiaccio secco per evitare il disgelo del campione durante il trasferimento.
6. Calcolare il peso netto del campione.
7. Pulire la malta e il pestello dopo ogni campione e decontaminarli mediante autoclave o riscaldandoli a 200 ° C per 2 ore.
8. Trasferire il campione in polvere dal tubo di centrifuga al tubo di vetro di un omogeneizzatore per inversione.
9. Aggiungere bufere filtrato in ureaR (8 M urea, 2 M tiourea, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris e 55 mM dithiotreitolo) al tubo di vetro, 200 μl di buffer urea per ogni 10 mg di tessuto in polvere.
   NOTA: Il campione in polvere residuo lasciato nel tubo di centrifuga può essere recuperato usando una parte del volume calcolato di buffer urea.
10. Homogenizzare il campione utilizzando un agitatore dotato di un mulino di vetro borosilicato e un pestello di politetrafluoroetilene (PTFE). Premere lentamente il pestello sul campione con un movimento di torsione (1.500 giri / min) 10 volte.
11. Recuperare il surnatante e trasferirlo in un tubo centrifugo da 1,7 ml. Riprendere il campione rimanente con il buffer di urea fresco, aggiungendo metà del volume utilizzato durante la prima estrazione.
12. Ripetere il passaggio 2.10.
13. Recuperare il surnatante e combinarlo con il surnatante dal punto 2.11. Posizionare il supernatante combinato su un rotatore di tubo per 30 min.
14. Centrifugare il tubo per 30 minuti a 13.000 xg e 4 ° C.
15. Recuperare il surnatante anD misurare la concentrazione proteica utilizzando il saggio della proteina Bradford, secondo le istruzioni del produttore. Conservare il campione a -80 ° C fino all'uso.

Results

L'estrazione e la dissoluzione delle proteine ​​nel buffer urea è direttamente compatibile con i metodi proteomici basati su isoelectrofocusing (elettroforesi bidimensionale (2-DE) ¹¹ e fuoco isoelettrico a fase liquida (IEF) ¹² ) e con immunoblotting dopo la diluizione in tampone Laemmli ¹³ Contenente un cocktail inibitore della proteasi ¹⁴ .

Discussion

Un passo critico di questo protocollo è l'uso di azoto liquido per congelare il campione e per raffreddare il sistema di macinazione. L'utilizzo di azoto liquido evita il degrado biologico e consente una polverizzazione efficace, ma richiede una formazione specifica per una manipolazione sicura.

In questo protocollo è previsto un sistema di macinazione per la macinazione del campione in quanto i piccoli campioni sono difficili da recuperare da mortai e pestelli standard. In questo ca...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione			0,9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Mezzo di trasporto d'organo bilanciato. Combinare 400 mL di Eurocollins A con 100 mL di Eurocollins B per ottenere un terreno bilanciato Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	Terreno di trasporto d'organo bilanciato. Combinare 400 mL di Eurocollins A con 100 mL di Eurocollins B per ottenere un mezzo bilanciato Eurocollins
Wisconsin	Bridge life	RM/N 4081	Mezzo di trasporto d'organo bilanciato Aria a
flusso verticale a rischio biologico	Burdinola		Classe A Classificazione GMP
Dewar Flask	Thermo Scientific	Nalgene 4150-1000
Sistema Cryogrinder	OPS diagnostics	CG 08-01	Sistema di smerigliatrice contenente mortai, pestelli e cacciavite
Pinze
Spatola
Bisturi sterile monouso	Medisafe	MS-10
Forbici			Autoclavabili
Plettri			Autoclavabili
Panno sterile monouso	Mon& Tex	3.307.08
Soluzione sterilizzante con alcool			70% alcool isopropilico
Soluzione sterilizzante con perossido di idrogeno Perossido			di idrogeno 6%
Micropipetta, 1 mL, con puntali
Provette da centrifuga da 15 mL	VWR international	9278
Provette da centrifuga da 1,7 mL	VWR internazionale	PIER90410
Tampone			8 M urea, 2 M tiourea, 4 % p/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Ditiotreitolo
Urea	Sigma aldrich	U6504-1KG	Da utilizzare per il tampone ureico
Thiourea	Sigma aldrich	T8656	Da utilizzare per il tampone ureico
CHAPS	Sigma aldrich	C3023-5GR	Da utilizzare per il tampone
ureicoDitiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	Da utilizzare per la siringa del tampone Urea
50 mL	PIC		Da utilizzare per filtrare il tampone Urea
0,22 & micro; m filtro	Millipore	SLGP033RB	Da utilizzare per filtrare il tampone urea
PFTE Pestle, 2 mL	Kartell	6302	Parte dell'omogeneizzatore Potter-Elvehjem
Malta in vetro borosilicato	Kartell	6102	Parte dell'omogeneizzatore Potter-Elvehjem
Agitatore	VELP scientifica	Agitatore DLH	Da utilizzare per l'omogeneizzazione mediante Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay	Laboratori Bio-Rad	5000006
Rotatore di tubi	Pbi International	F205
Azoto
Foglio
Ghiaccio
			di polistirene
Ghiaccio secco
Centrifuga			Per la centrifugazione di provette da centrifuga da 1,7 mL a 13.000 x g
Congelatore -80° C
Bilancia
Autoclave			Per sterilizzazione
Guanti criogenici per azoto
Guanti
Forno			Per sterilizzazione
Cocktail inibitore della proteasi	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	versione 2.7	Piattaforma software per l'analisi dell'ontologia genica
BiNGO		http://apps.cytoscape.org/apps/bingo versione 3.0.3	Plugin per analisi di ontologia genica
Anticorpo AlphaB Crystallin/CRYAB	Novus Biologicals	NBP1-97494	Anticorpo monoclonale di topo contro CryAB
Anticorpo Septin-11	Novus Biologicals	NBP1-83824	Anticorpo policlonale di coniglio contro septin-11
Anticorpo FHL1	Novus Biologicals	NBP-188745	Anticorpo policlonale di coniglio contro FHL-1
Anticorpo dermatopontino	Novus Biologicals	NB110-68135	Anticorpo policlonale di coniglio contro la dermatopontina
Capra Anti topo IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0.5ML	Anticorpo secondario per immunoblotting
Capra Anti coniglio IgG HRP	Bio-Rad laboratories	170-5046	Anticorpo secondario per immunoblotting