Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

Summary

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Abstract

L'uso di topi geneticamente modificati ha contribuito in maniera significativa agli studi sui processi fisiologici e patologici in vivo . L'iniezione pronucleare di espressioni del DNA in oociti fecondati rimane la tecnica più comunemente utilizzata per generare topi transgenici per sovraespressione. Con l'introduzione della tecnologia CRISPR per il targeting genico, l'iniezione pronucleare in oociti fecondati è stata estesa alla generazione di topi di knockout e knockin. Questo lavoro descrive la preparazione del DNA per l'iniezione e la generazione di guide CRISPR per il targeting genico, con particolare attenzione al controllo di qualità. Le procedure di genotipizzazione necessarie per l'identificazione dei potenziali fondatori sono critiche. Le strategie innovative di genotipizzazione che sfruttano le funzionalità "multiplexing" di CRISPR sono qui presentate. Sono inoltre descritte procedure chirurgiche. Insieme, i passaggi del protocollo consentiranno la generazione di genI topi eticamente modificati e per la successiva istituzione di colonie del mouse per una pletora di campi di ricerca, tra cui immunologia, neuroscienza, cancro, fisiologia, sviluppo e altri.

Introduction

I modelli animali, sia in vertebrati che in invertebrati, sono stati strumentali ad esaminare la fisiopatologia delle condizioni umane come la malattia di Alzheimer ^{1 , 2} . Sono anche strumenti preziosi per la ricerca di modificatori della malattia e per sviluppare in ultima analisi nuove strategie di trattamento nella speranza di una cura. Sebbene ogni modello abbia limiti intrinseci, l'uso degli animali come interi modelli sistemici è fondamentale per la ricerca biomedica. Questo perché l'ambiente fisiologico metabolico e complesso non può essere interamente simulato nella cultura del tessuto.

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Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dall'Università del Nuovo Galles del Sud.

1. Preparazione del transgene (integrazione casuale)

1. Elettroforesi analizzante per gel agarosio.
   1. Digestare il plasmide per accise il transgene usando enzimi appropriati (1 h di incubazione) o enzimi digestivi (15-30 minuti di incubazione) in un termociclista seguendo le raccomandazioni del produttore (vedere la figura 2A e la sua leggenda).
   2. Condurre un agarosio di 1% di tris-acetato-etilendiammeto-tetraacetico (EDTA) (TEA), colorato con 0,5-1,0 μg / ml di etidio bromuro (EtBr). ....

Results

Di seguito sono descritti i flussi di lavoro per la microinjection in caso di integrazione casuale e CRISPR-mediated gene targeting ( Figura 1 ).

Figura 1: flusso di lavoro tipico per la generazione di topi modificati geneticamente. Per l'integrazione casuale, il transgene purificato viene iniett.......

Discussion

Fasi critiche all'interno del protocollo

La generazione di topi geneticamente modificati è noto per essere tecnicamente impegnativa. Tuttavia, il protocollo qui presentato è un metodo ottimizzato e semplificato che consente di masterizzare e risolvere la tecnica in tempo record. Ci sono due fasi necessarie per il completamento della tecnica. In primo luogo, la sintesi di modelli lineari del DNA (per la sintesi di sgRNAs) può essere ottenuta senza cloruro di magnesio (MgCl2). Tuttavia, è alt.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipetta 0,1-2,5 μ L	Eppendorf	4920000016
Micropipetta 2 - 20 μ L	Eppendorf	4920000040
Micropipetta 20 - 200 μ L	Eppendorf	4920000067
Micropipette 100 - 1.000 μ L	Eppendorf	4920000083
Marcatore di peso molecolare	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1 kb
Marcatore di peso molecolare	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
Agarosio	Bioline	BIO-41025
tampone EDTA	Sigma-Aldrich	93296	10x - Diluire a 1x
bromuro di etidio	Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Safe gel colorante	Invitrogen	S33102
Kit di estrazione del gel	Qiagen	28706
Kit di purificazione PCR (Qiaquick)	Qiagen	28106
Sistema per vuoto (collettore)	Promega	A7231
Tampone per microiniezione senza nucleasi	Millipore	MR-095-10F
Ultrafree-MC	Millipore	UFC30GV00
Cas9 mRNA	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
plasmide che esprime CRISPR (px330)	Addgene	42230
Acqua priva di nucleasi	Sigma-Aldrich	W4502
Phusion polimerasi	New England Biolabs	M0530L
T7 Kit RNA rapido ad alto rendimento	New England Biolabs	E2050S
Colonne di spin per purificazione dell'RNA (NucAway)	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
Plasmide donatore	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
Hyaluronidasi	Sigma-Aldrich	H3884
KSOMaa terreno di coltura embrionale	Zenith Biotech	ZEKS-100
Olio minerale	Zenith Biotech	ZSCO-100
M2 Medium	Sigma-Aldrich	M7167
Citocalasina B	Sigma-Aldrich	C6762
Bocchino	Sigma-Aldrich	A5177
Microcapillari in vetro	Strumento Sutter	BF100-78-10
Proteinasi K	Applichem	A3830.0100
Dumont #5 pinza	Strumenti di Fine Science	91150-20
Forbici per iride	Strumenti per la scienza fine	91460-11
Morsetto per vasi	Fine Science Tools	18374-43
Clip per ferite	Strumenti di Fine Science	12040-01
Clip applicatore	Strumenti di Fine Science	12018-12
Micro-forbici	Strumenti di Fine Science	15000-03
Cauterizzatore	Strumenti per la scienza fine	18000-00
Suture chirurgiche non assorbibili (Ethilon 3-0)	Ethicon	1691H
5% CO2 incubatore	MG Scientific	Galaxy 14S
	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000c
Thermocycler	Eppendorf	6321 000.515
Impostazione dell'elettroforesi	BioRad	1640300
Transilluminatore UV	BioRad	1708110EDU
Termociclatore	Eppendorf	6334000069
Microscopio stereoscopico	Olympus	SZX7
Microscopio invertito	Olympus	IX71
2x Micromanipolatori	Eppendorf	5188000.012
Ovociti manipolatore	Eppendorf	5176000.025
Microiniettore (Femtojet)	Eppendorf	5247000.013
Topi C57BL/6J ceppo	Australian BioResources	C57BL/6JAusb