Method Article

Analisi delle interazioni proteine-proteine ​​e co-localizzazione tra i componenti di giunzione, stretti e giunti aderenti in ghiandole mammarie murine

DOI:

10.3791/55772

⸱

May 30th, 2017

 , 
1INRS, Institut Armand-Frappier, 2Biomed, UQAM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le giunzioni intercellulari sono requisiti per le funzioni specifiche e lo sviluppo delle ghiandole mammarie. Questo manuale fornisce un protocollo dettagliato per lo studio delle interazioni proteico-proteiche (PPIs) e la co-localizzazione usando le ghiandole mammarie murine. Queste tecniche consentono l'analisi della dinamica dell'associazione fisica tra giunzioni intercellulari a differenti fasi di sviluppo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le interazioni delle cellule cellulari svolgono un ruolo fondamentale nel preservare l'integrità dei tessuti e la barriera tra i diversi compartimenti della ghiandola mammaria. Queste interazioni sono fornite da proteine ​​junctional che formano nexus tra cellule adiacenti. La misloalizzazione della proteina giunzionale e la riduzione delle associazioni fisiche con i loro partner di legame possono provocare la perdita di funzione e, di conseguenza, la disfunzione dell'organismo. Quindi, identificare la localizzazione proteica e le interazioni proteine-proteine ​​(PPI) nei tessuti normali e legati alla malattia è essenziale per trovare nuove evidenze e meccanismi che conducano alla progressione di malattie o alterazioni nello stato di sviluppo. Questo manuale presenta un metodo in due fasi per valutare i PPI in ghiandole mammarie murine. Nella sezione 1 del protocollo, è descritto un metodo per eseguire co-immunofluorescenza (co-IF) usando anticorpi sollevati contro le proteine ​​di interesse, seguite da anticorpi secondari etichettati con fluorochromi. Anche se co-IF tuttiPer la dimostrazione della vicinanza delle proteine, rende possibile studiare le loro interazioni fisiche. Di conseguenza, un protocollo dettagliato per la co-immunoprecipitazione (co-IP) è fornito nella sezione del protocollo 2. Questo metodo è utilizzato per determinare le interazioni fisiche tra le proteine, senza confermare se queste interazioni sono dirette o indirette. Negli ultimi anni, le tecniche co-IF e co-IP hanno dimostrato che alcuni componenti delle giunzioni intercellulari co-localizzano e interagiscono insieme, creando nexus giunzionali dipendenti da fase che variano durante lo sviluppo della ghiandola mammaria.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La crescita e lo sviluppo delle ghiandole mammarie si verificano principalmente dopo la nascita. Questo organo si rinnova costantemente per tutta la vita riproduttiva di un mammifero1. L'epitelio adulte della ghiandola mammaria è composto da uno strato interno di cellule epiteliali luminali e da uno strato esterno di cellule basali, composto principalmente da cellule mioepiteleali, circondate da una membrana basale 2 . Per una buona revisione della struttura e dello sviluppo delle ghiandole mammarie, il lettore può fare riferimento a Sternlicht 1 . Le interazioni delle cellule cellulari attraverso il divario (GJ), i giunti stretti (TJ) e gli aderenti (AJ) sono necessari per lo sviluppo normale e la funzione della ghiandola 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Le principali componenti di queste giunzioni nella ghiandola mammaria murina sono Cx26, Cx30, Cx32 e Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 e -7 eZO-1 (TJ); E E-cadherina, P-cadherina e β-catenina (AJ) 7 , 8 . I livelli di espressione di queste diverse proteine ​​junzionali variano in modo dipendente dalla fase durante lo sviluppo della ghiandola mammaria, suggerendo requisiti di interazione cellulare-cellule differenziali 9 . GJ, TJ e AJ sono collegati strutturalmente e funzionalmente e collegano altre proteine ​​strutturali o regolamentari ai siti vicini di cellule adiacenti, creando così un collegamento giunzionale 10 . La composizione del nesso giunzionale può influenzare il ponte con il citoscheletro sottostante, nonché la permeabilità e la stabilità del nesso e può quindi influenzare la funzione della ghiandola 8 , 9 , 10 , 11 . I componenti delle giunzioni intercellulari che risiedono in nexus giunzionali o interagiscono tra di loro a diffLe fasi di sviluppo progressive dello sviluppo delle ghiandole mammarie sono state recentemente analizzate utilizzando co-immunofluorescenza (co-IF) e co-immunoprecipitazione (co-IP) 9 . Mentre altre tecniche consentono la valutazione dell'associazione funzionale tra proteine, questi metodi non sono presentati in questo manoscritto.

Poiché le proteine ​​agiscono solo per funzionare, studiare le interazioni proteine-proteine ​​(PPI), quali trasduzione di segnali e cascate biochimiche, è essenziale per molti ricercatori e può fornire informazioni significative sulla funzione delle proteine. Co-IF e analisi microscopica aiutano a valutare alcune proteine ​​che condividono lo stesso spazio subcellulare. Tuttavia, il numero degli obiettivi è limitato dagli anticorpi che devono essere elevati in diversi animali e dall'accesso a un microscopio confocale dotato di diversi laser a lunghezza d'onda e di un rivelatore spettrale per il multiplexing. Co-IP conferma o rivela interazioni fisiche di elevata affinità tra i dueDue o più proteine ​​che risiedono all'interno di un complesso proteico. Nonostante lo sviluppo di nuove tecniche, come il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) 12 e il test di legatura di prossimità (PLA) 13 , che possono contemporaneamente rilevare la localizzazione e le interazioni delle proteine, il co-IP rimane una tecnica appropriata e conveniente per studiare le interazioni tra Proteine ​​endogene.

Il metodo passo-passo descritto in questo manoscritto agevolerà lo studio della localizzazione proteica e dei PPI e segna le insidie ​​per evitare quando studia PPI endogeni nelle ghiandole mammarie. La metodologia inizia con la presentazione delle diverse procedure di conservazione dei tessuti necessari per ogni tecnica. La Parte 1 illustra come studiare la co-localizzazione proteica in tre fasi: i) la sezione delle ghiandole mammarie, ii) la doppia o tripla etichettatura di diverse proteine ​​usando la tecnica co-IF, e iii) l'imaging diLocalizzazione proteica. La seconda parte mostra come precipitare una proteina endogena e identificare le sue proteine ​​interagenti in tre fasi: i) preparazione di lysate, ii) immunoprecipitazione indiretta di proteine ​​e iii) identificazione del partner di legame mediante SDS-PAGE e Western blot. Ogni fase di questo protocollo è ottimizzata per i tessuti delle ghiandole mammarie di roditore e genera risultati di alta qualità, specifici e riproducibili. Questo protocollo può anche essere utilizzato come punto di partenza per gli studi PPI in altri tessuti o linee cellulari.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i protocolli animali utilizzati in questo studio sono stati approvati dal comitato universitario di cura degli animali (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).

1. Identificazione della co-localizzazione della proteina

  1. Dal tessuto alle diapositive microscopiche
    NOTA: I tessuti e le sezioni devono essere trattati su ghiaccio secco.
    1. Incisa le ghiandole mammarie da un animale (per una descrizione completa di questa procedura, fare riferimento a Plante et al. ) 14 .
    2. Incorporare il tessuto in eccedenza nel mezzo di congelamento / montaggio su ghiaccio secco. Aggiungere abbastanza mezzo per coprire la ghiandola. Quando il mezzo è solidificato, trasferire i tessuti in un congelatore a -80 ° C per un uso successivo 9 .
    3. Utilizzando un set di criomicrotoma a ≤ -35 ​​° C tagliate i tessuti in sezioni spesse da 7-10 μm e posizionatele su vetrini a microscopio.
      NOTA: quando possibile, posizionare due sezioni su ciascuna diapositiva; La sezione sinistra verrà utilizzata come unaPer verificare la specificità degli anticorpi e l'autofluorescenza del tessuto, mentre il lato destro sarà etichettato con gli anticorpi.
    4. Tenere le sezioni a -80 ° C per un uso successivo.
  2. Co-IF colorazione
    1. Recuperare le diapositive microscopiche appropriate dal congelatore e fissare immediatamente le sezioni immersandole in formaldeide 4% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
    2. Quindi immergere le diapositive in salina fosfata-bufferizzata (PBS) a RT. Lasciare le diapositive in PBS a RT fino al passo successivo.
    3. Cerchi ciascuna sezione della diapositiva usando una barriera idrofoba disponibile in commercio o una penna di laboratorio idrorepellente (vedi tabella dei materiali ). Fare attenzione a non toccare il tessuto. Aggiungere immediatamente gocce di PBS al tessuto e posizionare la diapositiva in una camera istologica umida per il resto della procedura.
      NOTA: Le sezioni dei tessuti devono rimanere idratate. AlternativaUtilizzare una scatola con un coperchio e posizionare gli asciugamani bagnati sul fondo.
    4. Bloccare ogni sezione tissutale con 100-200 μL di 3% di albumina bovina del siero (BSA) -Tris-buffered salina (TBS) -0,1% di polisorbato 20 (vedi tabella dei materiali ) per 30 minuti a RT. Mentre i campioni bloccano, preparare le soluzioni anticorpali primarie e secondarie diluendo gli anticorpi in polisorbato 20 in TBS-0.1%.
      NOTA: la concentrazione richiesta per l'anticorpo è fornita dal produttore; Vedere la tabella dei materiali e le figure 1 e 2 per esempi, nonché Dianati et al. 9 . Anche se non è necessario lavorare al buio quando si utilizza la maggior parte degli anticorpi coniugati con fluoroforo, evitare di esporre le soluzioni anticorpali oi tessuti macchiati ad una luce intensa e luminosa.
    5. Rimuovere la soluzione di blocco aspirando e incubare le sezioni in 100-200 μL dell'anticorpo primario diluito per 60 min a RT. AlternativelY, incubare con l'anticorpo primario per una notte a 4 ° C.
    6. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria aspirando e lavare le sezioni con 250-500 μL di polisorbato 20 di TBS-0,1% per 5 min. Rimuovere la soluzione di lavaggio aspirando e ripetere due volte il lavaggio.
    7. Rimuovere la soluzione di lavaggio aspirando ed incubare le sezioni con 100-200 μL dell'appropriato anticorpo secondario coniugato con fluoroforo per 60 min a RT.
    8. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria aspirando e lavare le sezioni con 250-500 μl di polisorbato 20 TBS-0,1% per 5 min. Rimuovere la soluzione di lavaggio e ripetere due volte.
    9. Ripetere il passaggio 2.5-2.8 usando la combinazione appropriata di anticorpi primari e secondari per le successive proteine ​​di interesse.
    10. Rimuovere la soluzione di lavaggio mediante aspirazione e eseguire la colorazione dei nuclei incubando la sezione con 100-200 μL di 1 mg / ml 4 ', 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) in polisorbato 20 TBS-0,1% per 5 minRT.
    11. Rimuovere la soluzione DAPI per aspirazione e montare le diapositive utilizzando un supporto di montaggio non fluorescente solubile in acqua (vedere la tabella dei materiali ) e le copertine. Procedere una diapositiva alla volta.
      NOTA: L'incubazione del nucleo per più di 5 minuti non cambierà l'intensità della colorazione. In alternativa, rimuovere la soluzione DAPI su tutte le diapositive e incubare i tessuti in PBS durante il montaggio delle diapositive.
    12. Posizionare le diapositive in un frigorifero da 4 ° C per almeno 8 ore. Procedere all'immagine microscopica a fluorescenza (vedere le figure 1 e 2 ).
  3. Imaging microscopico
    1. Visualizzare gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo utilizzando un microscopio confocale dotato dei vari laser necessari per eccitare i fluorofori alle loro lunghezze d'onda specifiche.
      Nota: Per poter visualizzare i canali e gli alveoli, è suggerito un obiettivo 40X con apertura numerica di 0,95. Un esempioE delle impostazioni specifiche è riportato in Figura 1 .
    2. Verificare la localizzazione di ciascuna proteina singolarmente eseguendo la scansione dell'immagine una lunghezza d'onda all'epoca.
      Nota: in questa fase è importante analizzare criticamente la localizzazione delle proteine ​​junctional. Per essere in grado di formare i nexus giunzionali, queste proteine ​​devono essere localizzate alla membrana plasmatica.
    3. Determinare la co-localizzazione delle proteine ​​unendo le immagini scansionate con i laser alle diverse lunghezze d'onda.
      Nota: la co-localizzazione della proteina può essere visualizzata con la variazione del colore risultante dall'emissione di due o più fluorofori nella stessa posizione e può essere misurata utilizzando il software appropriato ( figure 1 e 2 , vedi anche il riferimento 9).

2. Studiare i PPI

NOTA: Le ghiandole mammarie addominali dovrebbero essere utilizzate per studiare i PPI, poiché le ghiandole toraciche sono in stretta associazione con il pettoralemuscoli. Incise le ghiandole mammarie (per una descrizione completa di questa procedura, fare riferimento a Plante et al .) 14 e mantenerli a -80 ° C per un uso successivo.

  1. Preparazione al lisato
    1. Posizionare la carta di pesatura e 2 ml di microcentrifuga sui ghiaccioli secco per pre-raffreddare prima di procedere con i passi successivi.
    2. Prendi il tessuto delle ghiandole mammarie da -80 ° C e tenerli su ghiaccio secco.
    3. Pesare i tessuti sui fogli di pesatura pre-refrigerati e trasferire il tessuto a 2 ml di tubi di microcentrifuga (manico sul ghiaccio secco). Utilizzare tra 50 e 100 mg di tessuto per campione. Tenere il tessuto in ghiaccio secco fino al punto 2.1.5.
    4. Preparare la quantità richiesta di triplicato tampone di lisi detergente integrato con NaF, NaVO 3 e inibitore della proteasi / fosfatasi, come indicato nella tabella dei materiali , utilizzando le seguenti formule. Mouse: buffer richiesto (μL) = peso del tessuto del mouse (mg) x 3; Ratto: obbligatorioBuffer (μL) = peso del tessuto ratto (mg) x 5.
    5. Aggiungere la quantità necessaria di tampone di lisi a ghiaccio (calcolato al punto 2.1.4) nel tubo da 2 mL contenente il tessuto.
      NOTA: nei passaggi 2.1.5-2.1.6, procedere con un singolo tubo alla volta.
    6. Homogenizzare il tessuto per 30-40 s usando l'omogeneizzazione continua su un macinino di tessuto; Tenere sempre il tubo sul ghiaccio. Regolare l'omogeneizzatore tissutale a velocità media e spostare delicatamente il macinatore verso l'alto e verso il basso all'interno del tubo.
    7. Ripetere i passi 1.6 e 1.7 con gli altri tubi.
    8. Incubare i lisati in ghiaccio per 10-30 min.
    9. Centrifugare i tubi a 170 xg per 10 minuti a 4 ° C.
    10. Nel frattempo, individuare 6-10 microcentrifuga tubi (0,6 mL) per ogni campione e tenerli in ghiaccio.
    11. Una volta effettuata la centrifugazione, controllare i tubi. Assicurarsi di contenere uno strato superiore di lisati grassi, chiari, giallo-rosa (a seconda dello stadio di sviluppo) e di un pallone.
    12. Crea un buco nello strato lipidicoUtilizzando una punta pipetta da 200 μl per accedere alla fase liquida. Cambiare la punta e raccogliere il lisato senza disturbare il pellet o aspirare lo strato lipidico. Aliquota il lisato in tubi pre-etichettati su ghiaccio (punto 2.1.11) e conservarli a -80 ° C.
    13. Utilizzare un'aliquota per quantificare la concentrazione proteica usando un apposito kit disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali ).
  2. Immunoprecipitazione indiretta
    1. Su ghiaccio, scongelare due aliquote dei lisati delle ghiandole mammarie preparate in precedenza.
      NOTA: Una aliquota verrà utilizzata per l'IP della proteina bersaglio, mentre l'altra servirà come controllo negativo.
    2. Raccogliere 500-1000 μg di lisato e diluirlo in PBS per raggiungere un volume finale di 200 μL in ogni tubo da 1,5 ml.
      NOTA: La quantità di lisato da utilizzare dipende dall'abbondanza della proteina di interesse e dall'efficienza dell'anticorpo (vedere la figura 3 per unN esempio, nonché la tabella dei materiali ). Per ottimizzare per ogni obiettivo, dovrebbero essere utilizzate diverse quantità di lisato ( es. 500, 750 e 1000 μg) e di anticorpi (5, 10 e 20 μg). Procedere con le seguenti fasi (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Aggiungere l'anticorpo contro l'antigene di interesse al primo tubo di lisato e tenerlo su ghiaccio.
      NOTA: L'importo richiesto viene generalmente suggerito nel foglio istruzioni fornito da ciascuna società (vedi tabella dei materiali ).
    4. Nel secondo tubo, preparare un controllo negativo aggiungendo la stessa concentrazione di controllo isotipo IgG come l'anticorpo utilizzato nel passaggio 2.2.3.
    5. Incubare i tubi durante la notte a 4 ° C su un rullo-miscelatore a bassa velocità.
    6. Il giorno seguente, aggiungere 50 μL di perline magnetiche a nuovi tubi da 1,5 ml per il pre-lavaggio.
      1. Selezionare le perline magnetiche Protein A o Protein G basate sull'affinità relativa all'anticorpo.
      2. È importante evitare l'utilizzo di perline aggregate; Mescolare delicatamente la sospensione del tallone fino a riposizionarla uniformemente prima di aggiungerla ai tubi.
    7. Posizionare i tubi che contengono le perle sul supporto magnetico e consentire ai perline di migrare verso il magnete. Rimuovere il buffer di memoria dalle perle usando una pipetta da 200 μL.
    8. Lavare le perle aggiungendo 500 μL di PBS-0.1% polysorbato 20 e vortexare i tubi vigorosamente per 10 s.
    9. Mettete di nuovo i tubi sul supporto magnetico e lasciate che i branelli migrano verso il magnete.
    10. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso pipettando con una pipetta da 200 μL.
    11. Aggiungere il complesso di reazione (antigene lisato) dal punto 2.2.5 alle perle e incubare per 90 minuti a RT sul mixer a rulli.
    12. Posizionare i tubi sul supporto magnetico e permettere ai branelli di migrare verso il magnete. Usando una pipetta da 200 μL, aspirare e scartare il lisato e mettere i tubi sul ghiaccio.
    13. Lavare il talloneS aggiungendo 500 μL di PBS, posizionando i tubi sul supporto magnetico e rimuovendo il liquido usando una pipetta da 200 μL. Ripetere questo passaggio di lavaggio. Durante i passaggi di lavaggio, evitare di vortexare e conservare i campioni in ghiaccio.
    14. Lavare le perle una volta con PBS-0,1% di polisorbato 20 senza vortice e scartare l'ultimo tampone di lavaggio usando una punta da pipetta da 200 μL.
    15. Per eluire, aggiungere 20 μL di glicina acido 0,2 M (pH = 2,5) ai tubi e agitare per 7 minuti sul mixer a rulli.
    16. Centrifugare ad alta velocità per alcuni secondi (rotazione rapida) e raccogliere il surnatante in un tubo fresco ghiacciato.
    17. Ripetere i passaggi 2.2.14 e 2.2.15 per ogni tubo.
      NOTA: Il volume finale sarà di 40 μL.
    18. Aggiungere 10 μl di tampone 4 mg Laemmli al campione eluito da 40 μl dalla fase 2.2.16.
      NOTA: il colore diventerà giallo a causa del pH acido.
    19. Aggiungere immediatamente 1 M Tris (pH = 8), una goccia alla volta, al campione eluito dalla fase 2.2.18 fino al suo coloreDiventa blu. Procedere ai tubi successivi.
    20. Boilare i campioni dal punto 2.2.18 a 70-90 ° C per 10 min. Procedere immediatamente all'elettroforesi gel. In alternativa, trasferire i campioni in un congelatore a -80 ° C fino al caricamento.
  3. Applicazione a valle: elettroforesi a gel seguita da Western blot
    1. Preparare separare e impilare gel SDS-PAGE acrilammide (spessore 1,5 mm) seguendo le procedure standard 15 .
      NOTA: La scelta del gel (8-15% di acrilammide, gradiente: vedi tabella dei materiali ) deve essere determinata sulla base della dimensione molecolare della proteina da precipitare e dei potenziali partner di legame da analizzare. Queste proteine ​​devono essere risolte l'una dall'altra per consentire una corretta immunodezione.
    2. Sciogliere i campioni selezionati con immunoprecipitazione (IP) (punto 2.2.20) sul ghiaccio.
    3. Preparare i lisati proteici dagli stessi campioni (utilizzati per la procedura IP sopra). Usa 50Μg di lisato totale e aggiungere 4 volte il campione di tampone Laemmli. Boilare i campioni a 70-90 ° C per 5 minuti e mettere in ghiaccio fino al caricamento.
      NOTA: Questi campioni saranno caricati accanto al campione IP eluito per dimostrare la presenza di proteine ​​precipitate nel lisato totale.
    4. Caricare i lisati preparati dalla fase 2.3.3 e i campioni precipitati dal punto 2.2.20 in un gel di acrilammide e farli scorrere in tampone di esecuzione (tampone di esecuzione 10 volte: 30,3 g di Tris, 144,1 g di glicina e 10 G di SDS in 1 L di acqua distillata) a 100 V per circa 95 minuti, o fino a quando il bordo delle proteine ​​migratorie raggiunge il fondo del gel.
    5. Trasferire i gel a una membrana di nitrocellulosa o PVDF utilizzando un protocollo standard 9 , 15 .
    6. Bloccare la membrana per 1 h su un bilanciere a bassa velocità in 5% di latte secco-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl e 0,05% polisorbato 20).
    7. Identificare se la precipitazione fosse stata eseguitacessful.
      1. Sonda la membrana utilizzando il primo anticorpo contro la proteina precipitata, diluito in 5% di latte secco-TTBS alla concentrazione raccomandata dal produttore, durante la notte a 4 ° C su una piattaforma a dondolo con agitazione lenta.
        NOTA: Consultare la tabella dei materiali per le raccomandazioni.
      2. Il giorno seguente, lavare la membrana 3 volte per 5 minuti ciascuno con TTBS su una piattaforma a dondolo con agitazione alta.
      3. Incubare la membrana nell'appropriato anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP), diluito in TTBS, per 1 h a RT su una piattaforma a dondolo con agitazione lenta.
        NOTA: In alternativa, un anticorpo secondario coniugato con un fluorochrome può essere utilizzato se è disponibile un apparecchio appropriato per rilevare il segnale.
      4. Eseguire da 3 a 6 lavaggi, ciascuno per 5 minuti, con TTBS su una piattaforma a dondolo ad alta agitazione. Analizzare il segnale dell'anticorpo secondario incubando la membrana con un commercialmente a(Vedere la tabella dei materiali ) e seguire le istruzioni del produttore. Rileva il segnale utilizzando un sistema di imaging chemiluminescenza (vedere la tabella dei materiali ).
        NOTA: Per un protocollo dettagliato sull'analisi della blot western, vedere il riferimento 16.
    8. Per identificare le proteine ​​interattive, eseguire i passaggi 2.3.7.1-2.3.7.4 utilizzando gli anticorpi appropriati sulla stessa macchia.
      NOTA: Se le proteine ​​stanno interagendo, i partner di legame saranno co-immunoprecipitati con la proteina bersaglio e saranno così rilevabili mediante Western blotting. Il punto 2.3.8 può essere ripetuto con più anticorpi per determinare se altre proteine ​​risiedono nello stesso complesso di proteine, a patto che i pesi molecolari delle proteine ​​abbiano sufficientemente diversi da essere ben separati sul gel e sulla membrana.
    9. Per confermare che i partner di identificazione identificati non sono artefatti, è necessario eseguire IP reciproci.
      NOTA: questo viene eseguito ripetendoPassaggi 2.2.1-2.2.20 con lo stesso lisato, ma precipitando uno dei partner di rilegatura individuati al punto 3.8. Quindi, i punti 3.1-3.8 vengono ripetuti utilizzando l'anticorpo primario contro la prima proteina di interesse.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per determinare se i componenti GJ, AJ e TJ possono interagire insieme nella ghiandola mammaria, sono stati eseguiti primi test di co-IF. Cx26, una proteina GJ e una beta-Catenina, una proteina AJ, sono stati saggiati con anticorpi specifici e sono stati rivelati rispettivamente con gli anticorpi coniugati con fluoroforo (verde, pseudocolore) e capra-568 (rosso) ( figura 1B e C ) . I dati hanno dimostrato che essi co-localizzano alla membrana cellulare d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le interazioni cellulare attraverso le giunzioni sono necessarie per la corretta funzione e lo sviluppo di molti organi, come la ghiandola mammaria. Gli studi hanno dimostrato che le proteine ​​giunzionali possono regolare la funzione e la stabilità dell'altro e attivare la trasduzione del segnale legandosi tra loro alla membrana cellulare 10 . I protocolli presentati nel manoscritto attuale hanno fornito interessanti risultati sull'espressione, la localizzazione e l'interazione tra p...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IP è finanziato da una sovvenzione scientifica di scienze naturali e ingegneria del Canada (NSERC # 418233-2012); Un Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), un premio per la carriera di Cancer Breast Cancer di Quebec, e una sovvenzione di Leader Found della sovvenzione Canadian Foundation for Innovation. ED ha ricevuto una borsa di studio dalla Fondation universitaire Armand-Frappier.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Topi ceppo e stadioSt. Constant, Quebec, CanadaC57BL / 6 Femals; gravidanza giorno 18 (P18) e lattazione giorno 14 (L14), Charles River Canada
PBS 10x (brodo)1) Sciogliere 80 g di NaCl (F.W.: 58.44), 2 g di KCl (P.F. 74.55), 26.8 g di Na2HPO4· 7H2O (F.W. 268.07) e 2,4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 ml di acqua distillata;
2) Regolare il PH a 7,4;
3) Aggiungere acqua fino a raggiungere il volume finale di 1 L.
TBS 10x (stock)1) Sciogliere 60,5 g di TRIS, 87,6 g di NaCl in 800 ml di acqua distillata;
2) Regolare il pH a 7,5;
3) Aggiungere acqua fino a raggiungere il volume finale di 1 L.
Parte 1: Immunofluorescenza
Terreno di congelamentoVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada95067-840VMR composto di sezioni congelate 
MicrotomoMississauga, ON, Canada956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
LameC.L. Sturkey, Inc. Scientifiques  ESBE  St-Laurent, QC, CanadaBLM1001CLame rivestite in oro di alto profilo
Pap penCedarlane, Burlington, ON, Canada8899Super PAP Pen, Thermo fisher scientifico
Vetrini microscopiciFisher Scientific, Burlington, ON, Canada12-550-15Fisherbrand  Vetrini per microscopio Superfrost Plus
FormaldeideBioShop Canada Inc, Burlington, ON, CanadaFOR201.1Forlmadehyde
Siero bovino Albumina (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Soluzione bloccante3% BSA in TBS
Soluzione di lavaggioTBS-Tween 20 0,1%
Polisorbato 20Oakville, ON, CanadaP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Supporti di montaggioCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
Primi e secondari anticorpiCell Signaling, Beverly, MA, USAVedi commentiE-Caderina (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) con anti-topo IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
Anticorpi primi e secondari Tecnologie per la vita, Waltham, MA, USA & Segnalazione cellulare, Beverly, MA, USAVedi commentiClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) con anti-coniglio IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Segnalazione cellulare) 
Anticorpi primi e secondari Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, Stati Uniti; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada Vedi Commentiβ-Anticorpo Catenina (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) con anti-IgG di Capra (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
Anticorpi primi e secondari Tecnologie per la vita, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USAVedi commentiConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) con anti-topo IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Colorazione dei nucleiFisher Scientific, Burlington, ON, CanadaD1306DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato) 1/1.000 in PBS
Microscopio fluorescenteNikon Canada, Mississauga, On, CanadaLaser microscopico confocale Nikon A1R+ dotato di un rivelatore spettrale 
Software di analisi delle immagini IFNikon Canada, Mississauga, On, CanadaSoftware NIS-elements (versione 4)
Parte 2: Immunoprecipitazione
Tampone di lisi triplo detergente (100  mL) pH=8,01) Miscela 50 mM TRIS (F.W.: 121,14), 150  mM NaCl (F.W.: 58,44), 0,02% azoturo di sodio, 0,1% SDS, 1% NONIdET P40, 0,5% desossicolato di sodio in 80 mL di H2O.
2) Regolare il pH a 8,0 con HCl 6  N (~0,5  mL).
3) Regolare il volume a 100  mL. Conservalo in frigorifero.
Il giorno dell'estrazione delle proteine, utilizzare 1/100 di NaVo3, 1/100 di inibitore della proteasi/fosfatasi e 1/25 di NAF in quantità calcolata di tampone di lisi detergente tripla:
Soluzione di fluoruro di sodio (stock) 1,25  M (F.W.: 41,98), Soluzione di Ortovanadato di Sodio (stock) 1  M (F.W.: 183.9)
Inibitore della proteasi/fosfatasiFisher Scientific, Burlington, ON78441Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi Halt, senza EDTA (100x)
Dosaggio delle proteineThermo Scientific, Rockford, Illinois, USA23225Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA 
Macinatore di tessutiFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Modello FTH-115
Perline magnetiche e supportoMillipore, Etobicoke, ON, CanadaPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Soluzione di lavaggio per IPPBS o PBS-Tween20 0,1% a seconda del passo
Anticorpi primari per l'immunoprecipitazioneCell Signaling, Beverly, MA, USAVedi commentiIgG Coniglio (coniglio (DA1E) mAb Controllo dell'isotipo IgG (#3900s) (Segnalazione cellulare) 0,5 &; L/200 & micro; L
Anticorpi primari per l'immunoprecipitazioneSegnalazione cellulare, Beverly, MA, USAVedi commentiIgG Topo di topo (G3A1) mAb Controllo dell'isotipo IgG (#5415s) (Segnalazione cellulare) 0,5 &; L/200 & micro; L
Anticorpi primari per l'immunoprecipitazioneSigma-Aldrich, Oakville, ON, CanadaVedi commentiConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4  µ L/200  µ L
Anticorpi primari per l'immunoprecipitazioneSegnalazione cellulare, Beverly, MA, USAVedi commentiE-caderina (4A2) Trombo monoclonale di topo (#14472s) (Segnalazione cellulare) 1 &; L/200 & micro; L
Laemmli buffer BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada16107474x tampone campione Laemmli (aggiungere β-mercaptoetanolo seguendo le raccomandazioni del produttore)
Glicina acida Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50,2 M glicina; regolare il pH=2,5 con HCl 
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
Gel di acrilammide SDS-PAGE BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1610180 -5soluzioni di acrilammide FastCast senza macchie TGX (7,8%, 10%, 12%)
Tampone di funzionamento 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272Tris 30.3  g/glicina 144,1  g /SDS 10  g in 1 L di acqua distillata
MembraneBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272Membrane PVDF, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer
Kit Metodo di trasferimentoBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704155Trans-Blot Turbo Transfer System
LatteSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, CanadaLatte scremato istantaneo senza grassi,
soluzione di blocco dei garofani per blot5% latte in polvere in TBS-Tween 20 0,1%
Soluzioni di lavaggio per blotsTBS-Tween 20 0,1%
Anticorpi primari e secondari per blot (10  mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, CanadaVedi commentiConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2.500 con HRP-coniugato Veriblot per anticorpo secondario IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Anticorpi primari e secondari per blot (10  mL)Segnalazione cellulare, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaVedi commentiE-caderina (24E10) mAb di coniglio 1/1.000 (#3195s) (Segnalazione cellulare) 1/1.000 con anticorpo secondario coniugato HRP Veriblot per IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Anticorpi primari e secondari per blot (10  mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaVedi commentiClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1.000 con HRP-coniugato Veriblot per anticorpo secondario IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Anticorpi primari e secondari per blots (10  mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1.000 con HRP-coniugato Veriblot per anticorpo secondario IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Soluzione di luminol per il rilevamento del segnale su blotBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1705061Clarity Western ECL Blotting
Imaging Imaging blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1708280ChemiDoc MP imaging sistema
Macchie analiticheBIO-RAD, Mississauga, ON, CanadaImageLab 5.2 software 
secco

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074(2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

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