Le giunzioni intercellulari sono requisiti per le funzioni specifiche e lo sviluppo delle ghiandole mammarie. Questo manuale fornisce un protocollo dettagliato per lo studio delle interazioni proteico-proteiche (PPIs) e la co-localizzazione usando le ghiandole mammarie murine. Queste tecniche consentono l'analisi della dinamica dell'associazione fisica tra giunzioni intercellulari a differenti fasi di sviluppo.
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Articolo metodologico
Analisi delle interazioni proteine-proteine e co-localizzazione tra i componenti di giunzione, stretti e giunti aderenti in ghiandole mammarie murine
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni delle cellule cellulari svolgono un ruolo fondamentale nel preservare l'integrità dei tessuti e la barriera tra i diversi compartimenti della ghiandola mammaria. Queste interazioni sono fornite da proteine junctional che formano nexus tra cellule adiacenti. La misloalizzazione della proteina giunzionale e la riduzione delle associazioni fisiche con i loro partner di legame possono provocare la perdita di funzione e, di conseguenza, la disfunzione dell'organismo. Quindi, identificare la localizzazione proteica e le interazioni proteine-proteine (PPI) nei tessuti normali e legati alla malattia è essenziale per trovare nuove evidenze e meccanismi che conducano alla progressione di malattie o alterazioni nello stato di sviluppo. Questo manuale presenta un metodo in due fasi per valutare i PPI in ghiandole mammarie murine. Nella sezione 1 del protocollo, è descritto un metodo per eseguire co-immunofluorescenza (co-IF) usando anticorpi sollevati contro le proteine di interesse, seguite da anticorpi secondari etichettati con fluorochromi. Anche se co-IF tuttiPer la dimostrazione della vicinanza delle proteine, rende possibile studiare le loro interazioni fisiche. Di conseguenza, un protocollo dettagliato per la co-immunoprecipitazione (co-IP) è fornito nella sezione del protocollo 2. Questo metodo è utilizzato per determinare le interazioni fisiche tra le proteine, senza confermare se queste interazioni sono dirette o indirette. Negli ultimi anni, le tecniche co-IF e co-IP hanno dimostrato che alcuni componenti delle giunzioni intercellulari co-localizzano e interagiscono insieme, creando nexus giunzionali dipendenti da fase che variano durante lo sviluppo della ghiandola mammaria.
Introduzione
La crescita e lo sviluppo delle ghiandole mammarie si verificano principalmente dopo la nascita. Questo organo si rinnova costantemente per tutta la vita riproduttiva di un mammifero1. L'epitelio adulte della ghiandola mammaria è composto da uno strato interno di cellule epiteliali luminali e da uno strato esterno di cellule basali, composto principalmente da cellule mioepiteleali, circondate da una membrana basale 2 . Per una buona revisione della struttura e dello sviluppo delle ghiandole mammarie, il lettore può fare riferimento a Sternlicht 1 . Le interazioni delle cellule cellulari attraverso il divario (GJ), i....
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Protocollo
Tutti i protocolli animali utilizzati in questo studio sono stati approvati dal comitato universitario di cura degli animali (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).
1. Identificazione della co-localizzazione della proteina
- Dal tessuto alle diapositive microscopiche
NOTA: I tessuti e le sezioni devono essere trattati su ghiaccio secco.- Incisa le ghiandole mammarie da un animale (per una descrizione completa di questa procedura, fare riferimento a Plante et al. ) 14 .
- Incorporare il tessuto in eccedenza nel mezzo di congelamento / montaggio su ghi....
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Risultati
Per determinare se i componenti GJ, AJ e TJ possono interagire insieme nella ghiandola mammaria, sono stati eseguiti primi test di co-IF. Cx26, una proteina GJ e una beta-Catenina, una proteina AJ, sono stati saggiati con anticorpi specifici e sono stati rivelati rispettivamente con gli anticorpi coniugati con fluoroforo (verde, pseudocolore) e capra-568 (rosso) ( figura 1B e C ) . I dati hanno dimostrato che essi co-localizzano alla membrana cellulare d.......
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Discussione
Le interazioni cellulare attraverso le giunzioni sono necessarie per la corretta funzione e lo sviluppo di molti organi, come la ghiandola mammaria. Gli studi hanno dimostrato che le proteine giunzionali possono regolare la funzione e la stabilità dell'altro e attivare la trasduzione del segnale legandosi tra loro alla membrana cellulare 10 . I protocolli presentati nel manoscritto attuale hanno fornito interessanti risultati sull'espressione, la localizzazione e l'interazione tra p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
IP è finanziato da una sovvenzione scientifica di scienze naturali e ingegneria del Canada (NSERC # 418233-2012); Un Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), un premio per la carriera di Cancer Breast Cancer di Quebec, e una sovvenzione di Leader Found della sovvenzione Canadian Foundation for Innovation. ED ha ricevuto una borsa di studio dalla Fondation universitaire Armand-Frappier.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi ceppo e stadio | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL / 6 Femals; gravidanza giorno 18 (P18) e lattazione giorno 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10x (brodo) | 1) Sciogliere 80 g di NaCl (F.W.: 58.44), 2 g di KCl (P.F. 74.55), 26.8 g di Na2HPO4· 7H2O (F.W. 268.07) e 2,4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 ml di acqua distillata; 2) Regolare il PH a 7,4; 3) Aggiungere acqua fino a raggiungere il volume finale di 1 L. | ||
| TBS 10x (stock) | 1) Sciogliere 60,5 g di TRIS, 87,6 g di NaCl in 800 ml di acqua distillata; 2) Regolare il pH a 7,5; 3) Aggiungere acqua fino a raggiungere il volume finale di 1 L. | ||
| Parte 1: Immunofluorescenza | |||
| Terreno di congelamento | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR composto di sezioni congelate |
| Microtomo | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz |
| Lame | C.L. Sturkey, Inc. Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | Lame rivestite in oro di alto profilo |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientifico |
| Vetrini microscopici | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Vetrini per microscopio Superfrost Plus |
| Formaldeide | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Siero bovino Albumina (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Soluzione bloccante | 3% BSA in TBS | ||
| Soluzione di lavaggio | TBS-Tween 20 0,1% | ||
| Polisorbato 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Supporti di montaggio | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| Primi e secondari anticorpi | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Vedi commenti | E-Caderina (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) con anti-topo IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| Anticorpi primi e secondari | Tecnologie per la vita, Waltham, MA, USA & Segnalazione cellulare, Beverly, MA, USA | Vedi commenti | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) con anti-coniglio IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Segnalazione cellulare) |
| Anticorpi primi e secondari | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, Stati Uniti; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Vedi Commenti | β-Anticorpo Catenina (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) con anti-IgG di Capra (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| Anticorpi primi e secondari | Tecnologie per la vita, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Vedi commenti | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) con anti-topo IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Colorazione dei nuclei | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato) 1/1.000 in PBS |
| Microscopio fluorescente | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Laser microscopico confocale Nikon A1R+ dotato di un rivelatore spettrale | |
| Software di analisi delle immagini IF | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Software NIS-elements (versione 4) | |
| Parte 2: Immunoprecipitazione | |||
| Tampone di lisi triplo detergente (100 mL) pH=8,0 | 1) Miscela 50 mM TRIS (F.W.: 121,14), 150 mM NaCl (F.W.: 58,44), 0,02% azoturo di sodio, 0,1% SDS, 1% NONIdET P40, 0,5% desossicolato di sodio in 80 mL di H2O. 2) Regolare il pH a 8,0 con HCl 6 N (~0,5 mL). 3) Regolare il volume a 100 mL. Conservalo in frigorifero. Il giorno dell'estrazione delle proteine, utilizzare 1/100 di NaVo3, 1/100 di inibitore della proteasi/fosfatasi e 1/25 di NAF in quantità calcolata di tampone di lisi detergente tripla: Soluzione di fluoruro di sodio (stock) 1,25 M (F.W.: 41,98), Soluzione di Ortovanadato di Sodio (stock) 1 M (F.W.: 183.9) | ||
| Inibitore della proteasi/fosfatasi | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi Halt, senza EDTA (100x) |
| Dosaggio delle proteine | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA |
| Macinatore di tessuti | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Modello FTH-115 |
| Perline magnetiche e supporto | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Soluzione di lavaggio per IP | PBS o PBS-Tween20 0,1% a seconda del passo | ||
| Anticorpi primari per l'immunoprecipitazione | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Vedi commenti | IgG Coniglio (coniglio (DA1E) mAb Controllo dell'isotipo IgG (#3900s) (Segnalazione cellulare) 0,5 &; L/200 & micro; L |
| Anticorpi primari per l'immunoprecipitazione | Segnalazione cellulare, Beverly, MA, USA | Vedi commenti | IgG Topo di topo (G3A1) mAb Controllo dell'isotipo IgG (#5415s) (Segnalazione cellulare) 0,5 &; L/200 & micro; L |
| Anticorpi primari per l'immunoprecipitazione | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Vedi commenti | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µ L/200 µ L |
| Anticorpi primari per l'immunoprecipitazione | Segnalazione cellulare, Beverly, MA, USA | Vedi commenti | E-caderina (4A2) Trombo monoclonale di topo (#14472s) (Segnalazione cellulare) 1 &; L/200 & micro; L |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x tampone campione Laemmli (aggiungere β-mercaptoetanolo seguendo le raccomandazioni del produttore) |
| Glicina acida | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0,2 M glicina; regolare il pH=2,5 con HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| Gel di acrilammide SDS-PAGE | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | soluzioni di acrilammide FastCast senza macchie TGX (7,8%, 10%, 12%) |
| Tampone di funzionamento 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3 g/glicina 144,1 g /SDS 10 g in 1 L di acqua distillata |
| Membrane | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Membrane PVDF, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer |
| Kit Metodo di trasferimento | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Latte | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Latte scremato istantaneo senza grassi, | |
| soluzione di blocco dei garofani per blot | 5% latte in polvere in TBS-Tween 20 0,1% | ||
| Soluzioni di lavaggio per blots | TBS-Tween 20 0,1% | ||
| Anticorpi primari e secondari per blot (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Vedi commenti | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2.500 con HRP-coniugato Veriblot per anticorpo secondario IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Anticorpi primari e secondari per blot (10 mL) | Segnalazione cellulare, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Vedi commenti | E-caderina (24E10) mAb di coniglio 1/1.000 (#3195s) (Segnalazione cellulare) 1/1.000 con anticorpo secondario coniugato HRP Veriblot per IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Anticorpi primari e secondari per blot (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Vedi commenti | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1.000 con HRP-coniugato Veriblot per anticorpo secondario IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Anticorpi primari e secondari per blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1.000 con HRP-coniugato Veriblot per anticorpo secondario IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) | |
| Soluzione di luminol per il rilevamento del segnale su blot | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting |
| Imaging Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging sistema |
| Macchie analitiche | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software |
Riferimenti
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J.
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Ristampe e permessi
