Analisi completa della metilazione del DNA usando un metodo basato sulla cattura di dominio di metile-CpG in pazienti con leucemia linfocitica cronica

Summary

Questo lavoro descrive un protocollo di sequenziamento del dominio di binding di metil-CpG (MBD) ottimizzato e una pipeline computazionale per identificare le regioni ricche di CpG riccamente differenziate in pazienti con leucemia linfocitaria cronica (CLL).

Abstract

Il ruolo di lunghi RNA non codificanti (lncRNA) nel cancro sta arrivando all'avanguardia a causa del crescente interesse per comprendere le loro funzioni meccaniche durante lo sviluppo e la progressione del cancro. Nonostante questo, la regolazione epigenetica globale dei lncRNA e delle sequenze ripetitive nei tumori non è stata ben studiata, in particolare nella leucemia linfocitaria cronica (CLL). Questo studio si concentra su un approccio unico: la cattura a base di immunoprecipitazione di frammenti di DNA a doppio filamento e metilato usando proteine ​​del dominio di legame di metile (MBD), seguito da sequenziamento di nuova generazione (MBD-seq). In questo studio sono stati utilizzati campioni di pazienti CLL appartenenti a due sottogruppi prognostici (5 campioni mutati IGVH + 5 IGVH campioni non mutati). L'analisi ha rivelato 5.800 ipermetilati e 12.570 glicini differenzialmente metilati specifici CLL-ipometilati (cllDMGs) rispetto ai normali controlli sani. Importante, questi risultati hanno identificato diversi lncRNA specifici CLL, differenzialmente metilatiElementi petitive e geni che codificano la proteina con potenziale valore prognostico. Questo lavoro descrive un protocollo dettagliato per una pipeline MBD-seq e bioinformatica sviluppata per l'analisi completa dei profili di metilazione globale in regioni altamente ricche di CpG usando campioni di pazienti CLL. Infine, un gene codificante proteina e un lncRNA sono stati convalidati usando il pirosequencing, che è un metodo altamente quantitativo per analizzare i livelli di metilazione di CpG per corroborare ulteriormente i risultati del protocollo MBD-seq.

Introduction

L'utilizzo di tecniche di sequenziamento di nuova generazione per l'analisi dei profili di metilazione del DNA globale è diventato sempre più popolare negli ultimi anni. I metodi di metilazione a livello genomico, compresi metodi basati su microarray e non microarray, sono stati sviluppati in base a quanto segue: la conversione di bisulfite di DNA genomico, digestioni enzimatiche di restrizione sensibile alla metilazione e l'immunoprecipitazione del DNA metilato usando anticorpi specifici di metil CpG .

La metilazione aberrante del DNA è uno dei segni distintivi della leucemia e dei linfomi, inclusa la leucemia linfocitica chi....

Protocol

L'approvazione etica per la raccolta dei campioni CLL è dal 2007-05-21, con il seguente numero di registrazione: EPN Gbg dnr 239/07. Tutti i pazienti affetti da CLL sono stati diagnosticati in base ai criteri di revisione recenti ⁸ , ei campioni sono stati raccolti al momento della diagnosi. I pazienti dello studio sono stati inclusi in diversi reparti di ematologia nella parte occidentale della Svezia dopo che era stato ottenuto il consenso scritto. In questo studio sono stati selezionati solo i campioni di cellule mononucleari del sangue periferico CLL (PBMC) con una percentuale tumorale di cellule leucemiche ≥70%.

Results

MBD-seq è stato recentemente eseguito su pazienti affetti da CLL e controlli abbinati, normali e sani per identificare geni differenziali iper- e ipometilati specifici CLL ⁷ . La pipeline sperimentale e bioinformatica utilizzata per analizzare i dati generati da CLL e campioni sani normali sono mostrati in Figura 1A e 1B . Queste analisi identificarono diverse regioni differenzialmente metilate specifiche CLL (cllDMRs.......

Discussion

MBD-seq è una tecnica basata su costo-efficacia basata sull'immunoprecipitazione che può essere utilizzata per studiare i modelli di metilazione con copertura completa a livello genomico. Sia MeDIP seq (immunoprecipitazione metilata DNA seguita da sequenziamento) e MBD-seq provocano l'arricchimento di DNA metilato ricco di CpG. Tuttavia, MBD-seq mostra maggiore affinità verso l'adesione a regioni ricche di CpG molto elevate rispetto a MeDIP seq ¹⁹ . Utilizzando un kit di arricchimento.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dneasy Kit per sangue e tessuti	Qaigen	69504
Soluzione di linfoprep	A X, I, S-S, H I E L D
Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
	Diagenode	UCD-200
mL	Diagenode	C30010010-300
3 M Acetato di sodio	Diagenode	C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-gel 2% Gel di agarosio	Thermo Fischersceintific	G441002
Methylminer Kit di arricchimento del DNA metilato	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake Agitatore/Rotatore di Tubi	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
Miscelatore a vortice	VWR	12620-848
Etanolo Assoluto	Qualsiasi azienda
70% Etanolo	Qualsiasi azienda
Acqua priva di DNAsi	Milli Q
Precipitante di DNA (acetato di sodio 3M)	Diagenode	C03030002
Sigillo di sicurezza Provette Eppendorf da 1,5 mL	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsKit di analisi DNA HS	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0,5 mL Provette	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
Piattaforma Illumina Hiseq2000	Illumina
Water  Bath	Grant
Heat block	grant Tubo
rotatore	Labquake