Protocolli per l'assemblaggio standard di DNA C-Brick utilizzando Cpf1

Sommario

La proteina Cpf1 associata a CRISPR può essere guidata da un CRISPR RNA (crRNA) appositamente progettato per separare il DNA a doppio filamento nei siti desiderati, generando estremità appiccicose. Sulla base di questa caratteristica, è stato stabilito un standard di assemblaggio del DNA (C-Brick) e qui viene descritto un protocollo che descrive il suo utilizzo.

Abstract

La proteina Cpf1 associata a CRISPR fila il DNA a doppio filamento sotto la guida di CRISPR RNA (crRNA), generando estremità appiccicose. A causa di questa caratteristica, Cpf1 è stato utilizzato per la creazione di un sistema di assemblaggio del DNA chiamato C-Brick, che ha il vantaggio di lunghi siti di riconoscimento e brevi cicatrici. Su un vettore standard C-Brick, ci sono quattro siti di riconoscimento Cpf1 - il prefisso (siti T1 e T2) e il suffisso (siti T3 e T4) - parti del DNA biologico flanking. La scissione dei siti T2 e T3 produce estremità appiccicose complementari, che consentono l'assemblaggio di parti del DNA con i siti T2 e T3. Nel frattempo, una breve cicatrice "GGATCC" viene generata tra le parti dopo l'assemblaggio. Poichè il plasmide appena costituito contiene ancora i quattro siti di scissione di Cpf1, il metodo consente l'assemblaggio iterativo di parti del DNA, che è simile a quello di standard BioBrick e BglBrick. Una procedura che descrive l'utilizzo dello standard C-Brick per assemblare parti del DNAÈ descritto qui. Lo standard C-Brick può essere ampiamente usato da scienziati, laureati e studenti universitari, e anche dilettanti.

Introduzione

La standardizzazione delle parti biologiche del DNA è importante per lo sviluppo della biologia sintetica ¹ . Lo sviluppo di una procedura di assemblaggio del DNA può sostituire disegni sperimentali ad hoc e rimuovere molti dei risultati imprevisti che si verificano durante l'assemblaggio di componenti genetici in sistemi più grandi. Lo standard BioBrick (BBF RFC 10) è stato uno dei più antichi standard di assemblaggio del DNA proposto. Utilizza la sequenza di prefisso (contenente i siti di taglio EcoRI e XbaI) e la sequenza di suffisso (contenente siti di taglio SpeI e PstI) ^{2 ,}

Protocollo

1. Preparazione di crRNA

1. Preparazione di modelli di crRNA
   1. Riassemblare singoli oligonucleotidi ( Tabella 1 ) in acqua libera da RNasi a una concentrazione di 10 μM.
   2. Aggiungere 22,5 μL di oligonucleotide di prima riga (T7-F nella tabella 1 ), 22,5 μL oligonucleotide a filo di fondo ( Tabella 1 ) e 5 μl di tampone di ricottura 10 volte a un tubo PCR da 0,2 ml. Assicurarsi che il volume totale sia di 50 μL.
      NOTA: Sei differenti oligonucleotidi di fondo sono riportati nella Tabella 1 , ognuno dei quali deve essere accoppiato singolarmente con il top-s....

Risultati

Questo protocollo ha dimostrato l'assemblaggio di tre cassette di cromoproteine ​​(cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) e amilGFP (BBa_K592010)). In primo luogo, le sequenze di codificazione dei tre geni e terminatori sopra menzionati sono stati clonati individualmente in un vettore standard C-Brick. Brevi parti del DNA, promotore e terminatore, sono state introdotte nel vettore C-Brick mediante amplificazione PCR utilizzando primer contenenti le parti corte del DNA sul .......

Discussione

Questo protocollo descrive una procedura per lo standard di assemblaggio del DNA C-Brick. Il passo più importante in questo protocollo è la linearizzazione del vettore standard C-Brick; La scissione incompleta del vettore potrebbe influenzare seriamente il tasso di successo. Inoltre, sebbene Cpf1 praticamente abbia sequenze di DNA bersaglio nel pattern di scissione "18-23", è stata rilevata anche una scissione inesatta vicino alle due basi ⁴ , che possono causare un piccolo numero di mu.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Comercial Oligonucleotide	Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer	Transgen	#J40928
Acqua distillata ultra pura	Invitrogen	10977-015
5x RNA Trascrizione Buffer	Thermo Scientific	K0441
T7 RNA polimerasi	Thermo Scientific	#EP0111
Miscela NTP	Sangon	#ND0056
RRI (inibitore della RNasi ricombinante)	Takara	2313A
RNA Clean & Concentratore-5	Zymo Research	R1015
Spettrometro UV-Vis	Thermo Scientific	Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer	Vazyme	PB505	PCR tampone
dNTP	Transgen	AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polimerasi	Vazyme	P505-d1
Ezmax per clonazione in un solo passaggio	Tolobio	24303-1	kit di montaggio senza saldatura
5x Buffer per clonazione Ezmax in un solo passaggio	Tolobio	32006
BamHI	NEB	#R0136L
BamHI-HF	NEB	#R3136L
BglII	NEB	#R0144L
XbaI	NEB	#R0145L
SpeI	NEB	#R3133L
10x Buffer 3	NEB	#B7003S
10x CutSmart Buffer	NEB	B7204S
10x T4 DNA ligasi Buffer	Tolobio	32002
T4 PNK	Tolobio	32206
T4 DNA ligasi	Tolobio	32210
DpnI	NEB	#R01762
SV Sistema di purificazione con gel e PCR	Promega	A9282
Mini kit plasmidico I	Omega	D6943-02	kit di preparazione del plasmide
fosfatasi alcalina termosensibile	Thermo Scientific	#EF0651
FastAP 10x Cpf1 tampone	Tolobio	32008
Cpf1	Tolobio	32105	FnCpf1
termociclatore	Applied Biosystems	veriti 96 well
C-Brick vettore standard	Tolobio	98101
E. coli [DH10B]	Invitrogen	18297010
Terreni Luria-Bertani (triptone)	Oxoid	LP0042
Terreni Luria-Bertani (estratto di lievito)	Oxoid	LP0021
Terreni Luria-Bertani (NaCl)	Sangon Biotech	B126BA0007