Integrazione di estrazione miniaturizzata di fase solida e rilevazione LC-MS / MS di 3-Nitrotirosina nell'urina umana per applicazioni cliniche

Summary

Una metodica di spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) cromatografica a liquido selettivo e sensibile, accoppiata con un'estrazione efficiente di fase solida su una micropiastra a 96 pozzetti di MCX, è stata sviluppata per la misura della libera 3-nitrotirosina ( 3-NT) in urine umane con un elevato throughput, che è adatto per applicazioni cliniche.

Abstract

La libera 3-nitrotirosina (3-NT) è stata ampiamente utilizzata come possibile biomarker per lo stress ossidativo. Sono stati riportati livelli aumentati di 3 NT in una grande varietà di condizioni patologiche. Tuttavia, i metodi esistenti non dispongono di sufficiente sensibilità e / o specificità necessarie per misurare in modo affidabile il basso livello endogeno di 3 NT e sono troppo ingombranti per le applicazioni cliniche. Quindi, è urgentemente necessario un miglioramento analitico per quantificare accuratamente i livelli di 3 NT e verificare il ruolo del 3-NT in condizioni patologiche. Questo protocollo presenta lo sviluppo di una nuova rivelazione di spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) cromatografica a liquido combinata con un'estrazione miniaturizzata di fase solida (SPE) per la misurazione rapida ed accurata di 3-NT nelle urine umane come biomarker non invasivo Per lo stress ossidativo. SPE usando una piastra a 96 pozzetti ha semplificato notevolmente il processo combinando l'arricchimento del campione e l'arricchimento dell'analita- zione senza derivatizzazione e fasi di evaporazione, Riducendo il consumo di solventi, lo smaltimento dei rifiuti, il rischio di contaminazione e il tempo complessivo di lavorazione. L'impiego di 25 mM acetato di ammonio (NH ₄ OAc) a pH 9 come soluzione di eluizione SPE ha migliorato sostanzialmente la selettività. La risposta al segnale di spettrometria di massa è stata migliorata attraverso la regolazione delle transizioni di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM). L'uso di 0,01% HCOOH come additivo su una colonna pentafluorofenile (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) ha migliorato la risposta del segnale di un'altra 2,5 volte e ha abbreviato il tempo di esecuzione totale a 7 minuti. È stato raggiunto un limite inferiore di quantitativi (LLOQ) di 10 pg / mL (0,044 nM), che rappresenta un significativo miglioramento della sensibilità rispetto ai dosaggi riportati. Questo metodo semplificato, rapido, selettivo e sensibile consente di elaborare due lastre di campioni di urina (n = 192) in un periodo di 24 ore. Considerando le prestazioni analitiche notevolmente migliorate e il campionamento di urina non invasivo e poco costoso, il saggio proposto è vantaggioso per pre-cliniche e clinichestudi.

Introduction

Gli effetti dello stress ossidativo sulla presentazione clinica sono stati spinti in prima linea negli ultimi anni ¹ . Uno dei biomarcatori esplorati è la 3-nitrotirosina (3-NT), un prodotto stabile stabile formato quando le specie di azoto reattivo (RNS) interagiscono con la tirosina, un precursore di neurotrasmettitore di catecolamine. Mentre 3-NT può avere un valore clinico come biomarker per RNS in vivo, i cambiamenti sostanziali delle proprietà e delle funzioni della tirosina possono influenzare negativamente le corrispondenti proteine ​​e le funzioni cellulari ^{1 , 2} . La ricerca emergente ha suggerito che il 3-NT può svolgere un ruolo importante nelle condizioni infiammatorie ³ , nei disturbi neurodegenerativi ^{4 , 5} , nella malattia cardiovascolare ⁶ e nel diabete ⁷ , nonché nelle condizioni correlate allo stress ossidativo. Tuttavia, questi obseLe risposte si basano sui risultati di metodologie prive di sensibilità e / o selettività ^{8 , 9 , 10 , 11} . Le enormi intervalli di concentrazione di 3 NT per i campioni biologici precedentemente riportati in letteratura rivelano che sono stati associati seri problemi analitici con questi dosaggi e sono necessari miglioramenti tecnici per quantificare accuratamente i livelli di 3 NT e verificarne il ruolo nella patologia di queste condizioni .

La quantitazione di 3 NT gratuite in matrici biologiche rappresenta una sfida speciale per l'uomo e lo strumento ^{8 , 9 , 10 , 11} . In primo luogo, il livello di traccia di 3-NT endogeno richiede una rilevazione ultra-sensibile; In secondo luogo, l'esistenza di numerosi analoghi strutturalmente simili, in particolare la tirosina, che è presenteVasto eccesso, richiede un elevato grado di selettività; In terzo luogo, la formazione artificiale di 3 NT per nitrazione di tirosina con nitrati e nitriti onnipresenti richiede particolare attenzione durante la preparazione del campione per evitare falsi sovrastimazioni di 3 NT.

Tra un'ampia varietà di metodologie utilizzate per misurare 3-NT, MS / MS è stato considerato il metodo del gold standard dovuto alla sua maggiore sensibilità e selettività ^{11 , 12 , 13 , 14} . La cromatografia a gas (GC) accoppiata MS / MS offre la migliore sensibilità, tuttavia i passi indispensabili di derivatizzazione del campione sono troppo noiosi e richiedono molto tempo per essere efficienti per l'utilità clinica ^{15 , 16} . LC-MS / MS non richiede una derivatizzazione complessa del campione, rendendola l'opzione più promettente. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli per superare come il seLa nsitività dei metodi LC-MS / MS riportati in letteratura deve essere migliorata per la misurazione della bassa abbondanza 3-NT ^{7 , 17 , 18} e il tempo di rotazione relativamente lungo deve essere abbreviato per applicazioni ad alta velocità ^{12 , 13 , 17 , 19} .

Inoltre, quando si considerano le applicazioni cliniche, la matrice biologica utilizzata svolge un ruolo significativo. Deve essere facile e poco costoso ottenere e non invasivo se possibile ^{20 , 21 , 22} . Il plasma, il campione tradizionalmente usato in letteratura, non è una matrice clinicamente desiderabile, quindi è stata ricercata una metodologia che utilizza urina non invasiva e conveniente.

Diversi tentativi di sviluppare relSono state effettuate metodologie LC-MS / MS specifiche e usando l'urina ^{9 , 10 , 11} . Tuttavia, essi non sono riusciti a essere selettivi, affidabili o efficienti per l'uso clinico. L'efficacia del SPE predominante che utilizza la cartuccia tradizionale a fase inversa (tipo C18) come pulizia del campione per l'analisi 3-NT è stata interrogata e è stato proposto un SPE sequenziale di scambio forte cation (SCX) e C18-OH in fase inversa ^{6 , 7 , 19} . Un metodo LC-MS / MS, recentemente sviluppato, ha utilizzato un processo di purificazione multipla di C18 SPE manuale, cromatografia liquida preparata ad alta pressione (HPLC) e SPE online per l'analisi di 3-NT ²³ . Sebbene questo metodo fosse sufficientemente sensibile per scopi clinici, con un LLOQ di 0,041 nM, il processo di pulizia era intenso e noioso e richiedevaRosso 3 ml di urina, limitandone la sua fattibilità ad alta produttività. Un polimero impressa in molecola è stato impiegato come sorbente SPE per migliorare l'efficienza del processo di pulizia ¹⁴ , ma il risultato LLOQ (0,7 μg / mL) non era abbastanza basso per gli esemplari clinici. Un altro metodo ha richiesto la cromatografia bidimensionale (2D) LC-MS / MS e l'immunoaffinita per la pulizia del campione per ottenere un limite di rilevazione (LOD) di 0,022 nM ²⁴ . Mentre tutti questi metodi hanno fatto progressi nella valutazione di 3-NT, nessuno ha raggiunto la sensibilità, l'affidabilità e l'efficienza necessaria per le applicazioni cliniche.

Per studiare la patologia del 3-NT libero e il suo ruolo di biomarker dello stress ossidativo in ambito clinico, abbiamo sviluppato una metodologia semplice, efficace, precisa e precisa, che consente di applicare applicazioni cliniche ad alto rendimento ²⁵ . Un cation miniaturizzato in modalità mista excHange (MCX) è stata implementata in micropiastre di estrazione a 96 pozzetti per ottenere un semplice ed efficace processo di pulizia e arricchimento di 3 NT in una singola estrazione, superando gli inconvenienti osservati nei metodi esistenti che richiedono derivatizzazione, evaporazione e 2D-LC. La cromatografia liquida con 0,01% HCOOH come additivo in fase mobile ha offerto una risposta di segnale avanzata con un rapido tempo di ciclo. La selettività è stata ulteriormente migliorata attraverso l'applicazione di una soluzione di eluzione NH ₄ OAc mite per l'eluizione selettiva di 3-NT e l'uso della transizione MRM per entrambi i 3 NT e lo standard interno (IS). L'effetto della matrice è stato compensato utilizzando una quantità ridotta di una isotopo preferito di ¹³ C-etero per la quantificazione. Con l'avvento di questa metodologia, i ricercatori e i clinici saranno in grado di verificare il ruolo di 3-NT nelle condizioni cliniche e di esplorare ulteriormente l'impatto dello stress ossidativo.

Protocol

Tutti gli studi che hanno coinvolto campioni di urina umana sono stati condotti aderenza alla procedura approvata da Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Determinazione del campione di urina e della determinazione della creatinina (Cr)

1. Raccogli 5 ml dei campioni di urina del mattino successivo dopo ca. 10 ore di digiuno in un tubo di trasporto da 5 mL contenente 250 μL di 3 N HCl come conservante e conservare a -20 ° C fino all'uso.
2. Sciogliere e vorticare 5 ml di urina di trasporto Un tubo e centrifugare in una centrifuga ( ad es. Sorvall) (2297 xg, 10 min).
3. Aliquota 1 ml di urina due volte dal tubo di trasporto 5 mL.
4. Determinare Cr con un metodo della creatinina urinaria ²⁶ .

2. Preparazione dei campioni Standard, IS e Quality Control (QC)

1. Preparare una soluzione di stock di 3 NT a 100 μg / mL in acqua con una fase mobile A (MA) di 0,01% HCOOH e conservare a -20 ° C.
2. RendereUna soluzione di lavoro standard di 3-NT a concentrazione di 100 ng / mL diluendo la soluzione di stock di 3-NT di 100 μg / mL con MA.
3. Generare standard che vanno da 5 a 2500 pg / mL per diluizione dello standard di lavoro di 100 ng / ml con 0,15 M HCl acidato vuoto in bianco senza 3 NT con campioni in bianco e doppio vuoto.
4. Preparare una soluzione a base di IS ¹³ C ₉ -3-NT a 100 μg / mL in acqua con MA e conservare a -20 ° C.
5. Realizzare una soluzione di lavoro IS a 500 pg / mL diluendo la soluzione di stock di 100 μg / mL ¹³ C ₉ -3-NT IS con MA.
6. Stabilire cinque livelli di campioni di QC che coprono i livelli LLOQ, bassi, medi e alti ( vale a dire , 10, 25, 100, 500 e 1.250 pg / mL), diluendo lo standard di lavoro 3-NT nell'urina vuota acidificata.

3. Procedura di estrazione a fase solida

1. Campioni di urina e di vortice, standard e campioni di QC.
2. Aggiungere campioni di urina, standard e QC sampLes (250 μL ciascuno) a 32 pozzetti di una piastra di raccolta a 96 pozzetti puliti da 2 ml.
3. Introdurre la soluzione di lavoro di 500 pg / ml IS (50 μL) ad ogni pozzetto, tranne il doppio campione di campioni vuoti. Aggiungere il 0,01% HCOOH (50 μL) al pozzetto campione doppio vuoto.
4. Aggiungere acqua LC-MS / MS con 0,1% HCOOH (250 μL).
5. Mescolare la miscela sopra con una pipetta a 8 canali tre volte.
6. Coprire la piastra fino al caricamento SPE.
7. Posizionare una piastra di estrazione MCX da 96 pozzetti e un serbatoio di raccolta su un processore a pressione positiva.
8. Condizionare la piastra di estrazione con MeOH fluido (200 μL) attraverso il sorbente.
9. Equilibrare con acqua corrente con 2% HCOOH (200 μL) attraverso il sorbente.
10. Caricare l'intero volume di ciascuno dei campioni prelevati sulla piastra di estrazione pre-condizionata con una pipetta a 8 canali.
11. Impostare una bassa pressione positiva ( ad esempio , 3 psi) sul processore di pressione positivo per consentire la miscelazione a fluireSe il sorbente è lento, regolare la pressione se necessario.
12. Lavare i pozzetti con acqua fluente con 2% HCOOH (200 μL) attraverso il sorbente.
13. Lavare i pozzetti facendo scorrere il metanolo (200 μL) attraverso il sorbente.
14. Lavare i pozzetti con acqua corrente (200 μL) attraverso il sorbente.
15. Asciugare completamente i pozzetti con un'alta pressione positiva ( es . 40 psi) sul processore di pressione positiva.
16. Sostituire il serbatoio con una piastra di raccolta a 96 pozzetti da 2 ml.
17. Applicare 25 mM NH ₄ OAc a pH 9 (50 μL) per eluire l'analita conservata e IS dalla piastra di estrazione.
18. Pipettare l'acqua LC-MS con 5% HCOOH (50 μL) per neutralizzare l'eluato.
19. Mescolare con la pipetta a 8 canali tre volte e inviare alla stazione LC-MS / MS per l'analisi.

4. Analisi LC-MS / MS

1. Misurare con precisione 2,000 ml di acqua LC-MS con un cilindro graduato e trasferirlo in una bottiglia da 2 L.
2. PImmergere 200 μL di HCOOH puro nella bottiglia sopra riportata contenente acqua LC-MS.
3. Mescolare accuratamente ed etichettare come fase mobile A (MA). Includi le iniziali, la data di preparazione e la data di scadenza.
4. Prendere una bottiglia da 2 L di metanolo LC-MS e l'etichetta come fase mobile B (MB) con data di inizio e data di scadenza.
5. Impostare la temperatura del campionatore automatico a 4 ° C.
6. Posizionare la lastra di raccolta con campioni preparati nell'autocampionatore.
7. Posizionare una colonna PFP (150 mm x 2,1 mm id, 3 μm) e una colonna di protezione nel forno.
8. Impostare la temperatura del forno a 30 ° C.
9. Equilibrare 10 min utilizzando il metodo di acquisizione con l'eluizione del gradiente LC come mostrato nella Tabella 1 .

Tempo (min)	Modulo	eventi	Parametro
0	pompe	Pompa B Conc.	5
0.5	pompe	Pompa B Conc.	20
1	pompe	Pompa B Conc.	50
3	pompe	Pompa B Conc.	80
4	pompe	Pompa B Conc.	90
4.01	pompe	Pompa B Conc.	95
5.5	pompe	Pompa B Conc.	95
5.6	pompe	Pompa B Conc.	5
7	controllore	Stop

Tabella 1: Condizioni di eluizione del gradiente di cromatografia liquida

10. Creare un elenco di batch inclusoStandard, QC e campioni di urina.
11. Avviare il lotto mediante l'iniezione dei campioni preparati (12 μL).

5. Identificazione del picco, integrazione e processo dei dati

1. Controlla l'acquisizione e l'elaborazione dei dati utilizzando il software.
2. Identificare e integrare picchi 3-NT e IS per tutti i campioni.
3. Stabilire una curva standard con l'intervallo di 10-2.500 pg / mL per la quantitativa 3-NT mediante regressione lineare del rapporto di area di picco di 3-NT e IS rispetto alla concentrazione nominale 3-NT con un fattore di ponderazione di 1 / x.
4. Quantifica tutti i campioni utilizzando la curva standard.
5. Determinare se i campioni di QC cadono nell'intervallo stabilito.
6. Convertire le concentrazioni rilevate di campioni di urina ai risultati finali nell'unità di nM o nmol / mmol Cr.

Results

La figura 1 illustra che 3-NT è completamente cromatograficamente separato da altri analoghi strutturali simili di tirosina sotto la condizione LC ottimizzata, che elimina le interferenze co-eluenti dovute a questi composti eccessivamente eccessivi e quindi aumenta il grado di selettività del dosaggio. Inoltre, l'eluizione di gradiente con 0,01% di HCOOH come additivo in MA e metanolo ad una velocità di flusso di 0,45 ml / min consente un'eluzione rapida di ...

Discussion

Le variazioni sostanziali delle concentrazioni precedentemente riportate in letteratura per i campioni di urina umana libera 3-NT endogene rivelano problemi metodologici associati ai dosaggi disponibili ^{8 , 9 , 10 , 11} . La precisa determinazione del basso livello basale di 3-NT nelle urine umane rimane un compito impegnativo che richiede particolari precauzioni per la preparazione del campion...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Nitro-L-tirosina	Sigma	N7389-5g
3-Nitro-L-tirosina-13C9	Sigma	652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine	Golden West Biologicals	MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-pozzetti &; Piastra di eluizione	Waters	186001830BA
2 mL piastra di raccolta a 96 pozzetti	Phenomenex	AH0-7194
96 processore positivo	Waters
LC-MS Ultra CHROMASOLV metanolo	Sigma	14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV acqua	Sigma	14263-2L
Acido formico per spettrometria di massa	Sigma	94318-50ML-F
Soluzione di idrossido di ammonio	Sigma	338818-1L
Colonne propiliche Ultra PFP	Restek	9179362
5500 Triple quad	AB Sciex	/	Contatta la produzione per maggiori dettagli
UFLC-XR	Shimadzu	/	Contatta la produzione per maggiori dettagli
Integra 400 Plus	Roche	/	Creatinina urinaria Jaffé Metodo Gen 2
Certificato LCMS Fiala con collo a vite da 12 x 32 mm	Waters	600000751CV
Certificato LCGC Fiala con collo a vite da 12 x 32 mm a recupero totale	Waters	186000384C
Provetta di trasporto da 5 ml	Phenix	TT-3205
50 mL Provetta da centrifuga	Crystalgen	23-2263
Provetta da centrifuga da 15 mL	Crystalgen	23-2266
Pipetta elettronica eLine	Sartorius	730391
Centrifuga Microfuge	Beckman Coulter	A46474
Bilancia OHAUS	Kennedy Scales, inc.	735
Miscelatore a vortice	Bernstead Thermolyne	M16715