Method Article

Integrazione di estrazione miniaturizzata di fase solida e rilevazione LC-MS / MS di 3-Nitrotirosina nell'urina umana per applicazioni cliniche

DOI:

10.3791/55778

⸱

July 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una metodica di spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) cromatografica a liquido selettivo e sensibile, accoppiata con un'estrazione efficiente di fase solida su una micropiastra a 96 pozzetti di MCX, è stata sviluppata per la misura della libera 3-nitrotirosina ( 3-NT) in urine umane con un elevato throughput, che è adatto per applicazioni cliniche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La libera 3-nitrotirosina (3-NT) è stata ampiamente utilizzata come possibile biomarker per lo stress ossidativo. Sono stati riportati livelli aumentati di 3 NT in una grande varietà di condizioni patologiche. Tuttavia, i metodi esistenti non dispongono di sufficiente sensibilità e / o specificità necessarie per misurare in modo affidabile il basso livello endogeno di 3 NT e sono troppo ingombranti per le applicazioni cliniche. Quindi, è urgentemente necessario un miglioramento analitico per quantificare accuratamente i livelli di 3 NT e verificare il ruolo del 3-NT in condizioni patologiche. Questo protocollo presenta lo sviluppo di una nuova rivelazione di spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) cromatografica a liquido combinata con un'estrazione miniaturizzata di fase solida (SPE) per la misurazione rapida ed accurata di 3-NT nelle urine umane come biomarker non invasivo Per lo stress ossidativo. SPE usando una piastra a 96 pozzetti ha semplificato notevolmente il processo combinando l'arricchimento del campione e l'arricchimento dell'analita- zione senza derivatizzazione e fasi di evaporazione, Riducendo il consumo di solventi, lo smaltimento dei rifiuti, il rischio di contaminazione e il tempo complessivo di lavorazione. L'impiego di 25 mM acetato di ammonio (NH 4 OAc) a pH 9 come soluzione di eluizione SPE ha migliorato sostanzialmente la selettività. La risposta al segnale di spettrometria di massa è stata migliorata attraverso la regolazione delle transizioni di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM). L'uso di 0,01% HCOOH come additivo su una colonna pentafluorofenile (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) ha migliorato la risposta del segnale di un'altra 2,5 volte e ha abbreviato il tempo di esecuzione totale a 7 minuti. È stato raggiunto un limite inferiore di quantitativi (LLOQ) di 10 pg / mL (0,044 nM), che rappresenta un significativo miglioramento della sensibilità rispetto ai dosaggi riportati. Questo metodo semplificato, rapido, selettivo e sensibile consente di elaborare due lastre di campioni di urina (n = 192) in un periodo di 24 ore. Considerando le prestazioni analitiche notevolmente migliorate e il campionamento di urina non invasivo e poco costoso, il saggio proposto è vantaggioso per pre-cliniche e clinichestudi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli effetti dello stress ossidativo sulla presentazione clinica sono stati spinti in prima linea negli ultimi anni 1 . Uno dei biomarcatori esplorati è la 3-nitrotirosina (3-NT), un prodotto stabile stabile formato quando le specie di azoto reattivo (RNS) interagiscono con la tirosina, un precursore di neurotrasmettitore di catecolamine. Mentre 3-NT può avere un valore clinico come biomarker per RNS in vivo, i cambiamenti sostanziali delle proprietà e delle funzioni della tirosina possono influenzare negativamente le corrispondenti proteine ​​e le funzioni cellulari 1 , 2 . La....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli studi che hanno coinvolto campioni di urina umana sono stati condotti aderenza alla procedura approvata da Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Determinazione del campione di urina e della determinazione della creatinina (Cr)

  1. Raccogli 5 ml dei campioni di urina del mattino successivo dopo ca. 10 ore di digiuno in un tubo di trasporto da 5 mL contenente 250 μL di 3 N HCl come conservante e conservare a -20 ° C fino all'uso.
  2. Sciogliere e vorticare 5 ml di urina di trasporto Un tubo e centrifugare in una centrifuga ( ad es. Sorvall) (2297 xg, 10 min).
  3. Aliquota 1 m....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figura 1 illustra che 3-NT è completamente cromatograficamente separato da altri analoghi strutturali simili di tirosina sotto la condizione LC ottimizzata, che elimina le interferenze co-eluenti dovute a questi composti eccessivamente eccessivi e quindi aumenta il grado di selettività del dosaggio. Inoltre, l'eluizione di gradiente con 0,01% di HCOOH come additivo in MA e metanolo ad una velocità di flusso di 0,45 ml / min consente un'eluzione rapida di .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le variazioni sostanziali delle concentrazioni precedentemente riportate in letteratura per i campioni di urina umana libera 3-NT endogene rivelano problemi metodologici associati ai dosaggi disponibili 8 , 9 , 10 , 11 . La precisa determinazione del basso livello basale di 3-NT nelle urine umane rimane un compito impegnativo che richiede particolari precauzioni per la preparazione del campion.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori avrebbero riconosciuto Scott Howard e Abigail Marinack per il sostegno generale e il coordinamento di questo lavoro.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-Nitro-L-tirosinaSigmaN7389-5g
3-Nitro-L-tirosina-13C9Sigma652296-5.0mg
Mass Spec Gold UrineGolden West BiologicalsMSG 5000-1L
Oasis MCX 96-pozzetti &; Piastra di eluizioneWaters186001830BA
2 mL piastra di raccolta a 96 pozzettiPhenomenex   AH0-7194
96 processore positivoWaters
LC-MS Ultra CHROMASOLV metanolo   Sigma14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV acquaSigma14263-2L
Acido formico per spettrometria di massaSigma94318-50ML-F
Soluzione di idrossido di ammonioSigma338818-1L
Colonne propiliche Ultra PFPRestek9179362
5500 Triple quadAB Sciex /Contatta la produzione per maggiori dettagli
UFLC-XRShimadzu /Contatta la produzione per maggiori dettagli
Integra 400 Plus Roche/Creatinina urinaria Jaffé Metodo Gen 2
Certificato LCMS Fiala con collo a vite da 12 x 32 mmWaters600000751CV
Certificato LCGC Fiala con collo a vite da 12 x 32 mm a recupero totaleWaters186000384C
Provetta di trasporto da 5 mlPhenixTT-3205
50 mL Provetta da centrifugaCrystalgen 23-2263
Provetta da centrifuga da 15 mLCrystalgen 23-2266
Pipetta elettronica eLineSartorius730391
Centrifuga Microfuge Beckman CoulterA46474
Bilancia OHAUS   Kennedy Scales, inc.735
Miscelatore a vortice Bernstead ThermolyneM16715
186005521

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3 Nitrotyrosine DetectionSolid Phase ExtractionLC MS MS AnalysisHuman Urine SamplesOxidative Stress BiomarkerMiniaturized SPE MethodAmmonium Acetate ElutionPFP Column ChromatographyMultiple Reaction MonitoringLower Limit Quantitation

Related Articles