Viene presentato un protocollo per la cristallografia a raggi X utilizzando microcristalli di proteine. Sono stati confrontati due esempi che analizzano microcristalli in vivo dopo la purificazione o in cellulo .
Articolo metodologico
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Viene presentato un protocollo per la cristallografia a raggi X utilizzando microcristalli di proteine. Sono stati confrontati due esempi che analizzano microcristalli in vivo dopo la purificazione o in cellulo .
L'avvento di linee di microfocus di alta qualità in molti impianti di sincrotrone ha consentito l'analisi di routine di cristalli inferiori a 10 μm nella loro dimensione più grande, che rappresentavano una sfida. Presentiamo due flussi di lavoro alternativi per la determinazione della struttura di microcristalli proteici mediante cristallografia a raggi X con particolare attenzione ai cristalli in vivo . I microcristalli vengono estratti dalle cellule per ultrasuoni e purificati mediante centrifugazione differenziale o analizzati in cellulo dopo la selezione delle cellule mediante citometria a flusso di cellule contenenti cristalli. Opzionalmente, cristalli purificati o cellule contenenti cristalli vengono imbevuti in soluzioni di atomi pesanti per la fase di sperimentazione. Questi campioni vengono quindi preparati per esperimenti di diffrazione in modo analogo mediante applicazione su un supporto micromesh e raffreddamento a flash in azoto liquido. Breve descrizione e confronto di esperimenti di diffrazione seriale di microcristalli isolati e di cristallo-Contenenti le cellule utilizzando un beamline di sincrotrino microfocus per produrre set di dati adatti per la fase di fasi, la costruzione di modelli e la raffinatezza.
Questi flussi di lavoro sono esemplificati con i cristalli del polyhedrin Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) prodotto dall'infezione di cellule insettiche con un baculovirus ricombinante. In questo caso, l'analisi cellulare è più efficace dell'analisi dei cristalli purificati e produce una struttura in ~ 8 giorni dall'espressione al raffinamento.
L'uso della cristallografia a raggi X per la determinazione di strutture ad alta risoluzione di macromolecole biologiche ha registrato una costante progressione negli ultimi due decenni. La crescente assunzione di cristallografia a raggi X da ricercatori non esperti esemplifica la democratizzazione di questo approccio in molti settori della scienza della vita 1 .
Storicamente, i cristalli con dimensioni inferiori a ~ 10 μm sono state considerate come impegnative, se non inutilizzabili, per la determinazione della struttura. La crescente disponibilità di microfocus dedicate a fonti di radiazione di sincrotrone i....
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Nota: La cristallizzazione in vivo è stata segnalata in molti organismi, inclusi batteri, lieviti, piante, insetti e mammiferi (riveduti al punto 21 ). La cristallizzazione delle proteine ricombinanti è stata inoltre ottenuta in laboratorio utilizzando transfection transitoria di cellule di mammiferi e infezione da baculovirus di cellule insettiche. Il seguente protocollo è stato sviluppato utilizzando il gene polyhedrin di Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) clonato in un baculovirus ricombinante sotto il promotore di polyhedrin baculovirus, generato secondo le istruzioni del riferimento 22 . Pertanto,....
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Viene presentata una panoramica di entrambi i metodi alternativi per la determinazione della struttura utilizzando microcristalli in vivo ( Figura 1 ). La polihedra può essere facilmente purificata mediante sonicazione e centrifugazione. A causa della loro densità, formano uno strato nella parte inferiore del tubo sotto uno strato di detriti che possono essere rimossi pipettando ( Figura 3a e 3b ). Il c.......
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Questo protocollo fornisce due approcci per analizzare i microcristalli allo scopo di facilitare l'analisi di cristalli molto piccoli che sarebbero stati trascurati in passato.
Fasi critiche per la purificazione microcristallina
Il protocollo presentato è stato ottimizzato utilizzando il polyhedrin Bombyx mori CPV1 espresso in cellule Sf9 come sistema di modello. Tuttavia, i microcristalli in vivo presentano una grande variabilità nella resistenz.......
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Gli autori non hanno niente da rivelare.
Gli autori vorrebbero riconoscere Chan-Sien Lay per fornire immagini di microcristalli purificati, Daniel Eriksson e Tom Caradoc-Davies per il supporto alla linea MX2 del Synchrotron australiano e Kathryn Flanagan e Andrew Fryga della struttura FlowCore presso la Monash University per la loro Un'assistenza inestimabile.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule Sf9 | Life Technologies | ||
| SF900-SFM medium per insetti | Life Technologies | ||
| Pallone per colture cellulari da 1 L | Thermofisher Scientific Incubatore | ||
| a scuotimento per colture cellulari di insetti | Eppendorf | ||
| 50 mL provette coniche | Falcon | ||
| Centrifuge con secchi oscillanti per 50 mL tubi | Eppendorf | ||
| Sonicator dotato di sonda da 19 mm | MSE Soniprep 150 | ||
| Vetrini | Hampton Research | ||
| Emacitometro | Sigma-Aldrich | ||
| Ioduro di propidio | Thermofisher Scientific | ||
| BD Selezionatore di cellule di afflusso | BD Biosciences | ||
| Hampton Schermi per atomi pesanti Le microcentrifughe | Hampton Research | ||
| Eppendorf | |||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 offrono una superficie più ampia. Le mesh indicizzate possono essere acquistate per studi sistematici. | |
| Stoppino di carta | Mitigen | La dimensione dello stoppino di carta può essere variata per un flusso ottimale. Ciò dipenderà in gran parte dalla natura dei cristalli e dal crioprotettore utilizzati. | |
| Glicole etilenico | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | Un elenco delle linee di luce microfocus disponibili può essere trovato in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793... 1806, doi:10.1071/CH14455. |
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