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Articolo metodologico

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

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DOI:

10.3791/55795

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3 agosto 2017

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro dimostra un nuovo approccio per valutare la proliferazione, la differenziazione e il potenziale di formazione delle vascelle di cellule staminali endoteliali (VESCs) attraverso il trapianto di grassi mammarie, seguito da una preparazione del tessuto a tutto sesto per l'osservazione microscopica. Viene inoltre presentata una strategia di tracciamento delle linee per indagare il comportamento dei VESC in vivo .

Abstract

Le cellule endoteliali (ECs) costituiscono i fondamenti fondamentali dell'architettura vascolare e mediano la crescita vascolare e il rimodellamento per garantire lo sviluppo adeguato dei vasi e l'omeostasi. Tuttavia, gli studi sulla gerarchia delle linee endoteliali rimangono inafferrabili a causa della mancanza di strumenti per accedere e di valutare direttamente il loro comportamento in vivo . Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un nuovo modello di tessuto per studiare l'angiogenesi usando il tampone di grasso mammario. La ghiandola mammaria si sviluppa soprattutto nelle fasi postnatali, tra cui la pubertà e la gravidanza, durante la quale la robusta proliferazione epiteliale è accompagnata da un'ampia rimodellamento vascolare. I rilievi di grasso mammario forniscono spazio, matrice e ricchi stimoli angiogenici dal crescente epitelio mammario. Inoltre, i tamponi di grasso mammario sono situati al di fuori della cavità peritoneale, rendendoli un luogo di innesto facilmente accessibile per valutare il potenziale angiogenico delle cellule esogene. Questo lavoro descrive anche un efficeNt tracciando l'approccio utilizzando topi reporter fluorescenti per specificare in modo specifico la popolazione mirata di cellule staminali endoteliali vascolari (VESCs) in vivo . Questo metodo di tracciamento delle linee, accoppiato con la successiva microscopia integrale a tessuto, consente la visualizzazione diretta di cellule mirate e dei loro discendenti, attraverso i quali la capacità di proliferazione può essere quantificata e l'impegno di differenziazione può essere suddiviso. Utilizzando questi metodi, una popolazione di recettori Bipotenti di proteine ​​C (Procr) che esprimono VESCs è stata recentemente identificata in più sistemi vascolari. Procr + VESCs, che danno origine a nuove EC e periciti, contribuiscono attivamente all'angiogenesi durante lo sviluppo, l'omeostasi e la riparazione degli infortuni. Nel complesso, questo manoscritto descrive un nuovo trapianto di tessuto grasso mammario e tecniche di tracciamento in linea vivo che possono essere utilizzate per valutare le proprietà delle cellule staminali dei VESCs.

Introduzione

Durante lo sviluppo e l'omeostasi, la crescita vascolare e il rimodellamento si svolgono fedelmente in conformità con la crescita e la riparazione dell'organo. L'angiogenesi descrive la generazione di nuove vasi da vasi sanguigni preesistenti ed è considerata una forza importante che medierà questi cambiamenti vascolari dinamici. Ogni vaso sanguigno è interiore rivestito con uno strato di cellule endoteliali (ECs), e sembrano essere il fondamento dell'architettura dei vasi. Per lungo tempo, il meccanismo attraverso il quale è stato rifornito il pool comunitario durante l'omeostasi è rimasto chiaro e sono stati sollevati argomenti su se il fatturato vascolare sia il risultato di una proliferazione maturata della CE o il contributo delle attività delle cellule staminali vascolari / progenitori. A causa della mancanza di prove fisiologiche dirette, l'esistenza e l'identità cellulare delle cellule staminali endoteliali vascolari (VESC) restano comunque controverse.

Uno degli approcci più comuni utilizzati per verificare il comportamento delle cellule staminali è attraverso il trapiantoDelle cellule staminali presenti nei topi riceventi. Questo metodo misura il potenziale di stemma delle cellule staminali candidate in vivo. Il trapianto è stato applicato per lo studio delle cellule staminali del midollo osseo 1 , che hanno contribuito alla definizione delle caratteristiche gerarchiche del sistema ematopoietico 2 . Nel campo endoteliale, una matrice di membrana basale ( ad es., Matrigel) inserita sottocutanea sotto la pelle del fianco è stata un test standard di angiogenesi in vivo utilizzato per affrontare le capacità di formazione delle vasche di EC trapiantate. Metodi sperimentali multipli, compresa la formazione di colonie nei sistemi di coltura 3D e trapianto, hanno suggerito le potenziali popolazioni EC progenitor / VESC 3 , 4 , 5 , 6 . Tuttavia, poiché le EC incorporate nella matrice della membrana basale sono relativamente separateIl tessuto circostante, questo non fornisce l'ambiente di nicchia ottimale richiesto per esplorare pienamente il potenziale angiogenico delle cellule trapiantate. Di conseguenza, le navi formate all'interno della spina a matrice sono prevalentemente capillari e sono funzionalmente inconfondibili.

La ghiandola mammaria si sviluppa postnatale, con la crescita più robusta durante la pubertà e la gravidanza. Alla fase pubertale, l'epitelio mammario subisce un'espansione rapida, per occupare l'intero grasso di grasso mammario, accompagnato dall'efficace rimodellamento delle strutture vascolari circostanti. Pertanto, la ghiandola mammaria offre un eccellente modello per lo studio dell'angiogenesi. Fornisce spazio, matrice e ricchi stimoli angiogenici dal crescente epitelio mammario e quindi è un luogo di innesto ideale per valutare il potenziale angiogenico delle cellule esogene. Inoltre, il tampone di grasso mammario consente ai vasi esogeni formati di integrarsi con il sistema di circolazione dell'ospite, consentendo ulteriori fValutazione non unica e che rappresenta un vantaggio rispetto al trapianto sottocutaneo.

Sebbene i test di coltura in vitro e di trapianto siano un modo efficace per indagare le proprietà di rigenerazione di una popolazione cellulare, è noto che tali saggi possono stimolare la plasticità poiché le cellule vengono tolte dai loro habitat naturali e le modifiche potrebbero essere indotte quando le cellule sono scollegate da Il loro ambiente fisiologico 7 . Pertanto, ottenere l'evidenza diretta in vivo del destino cellulare è l'approccio chiave per favorire la comprensione attuale del comportamento delle popolazioni endoteliali.

La mappatura del destino genetico ( cioè il tracciamento di linee in vivo ) è indispensabile per l'identificazione dei VESC e per l'indagine delle loro proprietà nel sistema corporeo in quanto può rivelare il comportamento delle cellule staminali in vivo nel suo contesto fisiologico e l'effettivo gambo può essere valutato. Lineage traciNg fornisce una dimostrazione diretta della persistenza a lungo termine ( cioè, autoreplicazione) dei VESC candidati e della loro capacità di produrre tipi cellulari per il tessuto di origine ( cioè potenza di differenziazione).

Questo protocollo descrive una nuova tecnica di trapianto di grassi del grasso mammario e un metodo di tracciamento delle linee per osservare la capacità di generazione dei vasi di VESCs. Queste tecniche superano le carenze dei dosaggi attualmente disponibili e forniscono un nuovo modo per valutare in modo ottimale le proprietà delle cellule staminali dei VESCs. Questi approcci sono strumenti efficaci che possono essere utilizzati per valutare le proprietà di comportamento e di formazione delle navi delle popolazioni endoteliali, nonché per determinare la alterazione della potenza delle cellule vascolari all'interno di un ambiente patologico.

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Protocollo

Le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto di biologia e biologia delle cellule di Shanghai, Accademia cinese delle scienze, con il protocollo approvato SIBCB-NAF-15-002-S335-003.

1. Isolamento di VESC dalla ghiandola mammaria

  1. Raccolta delle ghiandole mammarie e digestione dei tessuti.
    1. Usa 8 settimane di età Actin-GFP mature vergini reporter topo, con pesi da 20 a 25 g, come donatori di tessuti.
      Nota: le celle originate dal donatore possono essere facilmente tracciate con l'espressione GFP.
    2. Preparare il mezzo di base della digestione tissutale costituito da 5% di siero fetale fetale (FBS), 1% pen / strep e 25 mM HEPES in RPMI1640. Filtrare la miscela attraverso un filtro da 0,22 μm per sterilizzare e pre-riscaldarlo a 37 ° C in un bagno d'acqua.
    3. Sacrificare i topi in una camera di CO 2 . Disseccare la quarta coppia di ghiandole mammarie inguinali facendo prima una pelle verticale iNcision al midline addominale inferiore utilizzando un bisturi (o forbici chirurgiche). Sbucciate delicatamente la pelle da un lato per esporre la ghiandola mammaria inguinale con pinze. Ottenere le quattro ghiandole mammarie inguinali da entrambi i lati e tagliarli in pezzi fini in un piatto di Petri da 6 cm con forbici.
      1. Misurare il peso totale del tessuto macinato e collocarlo in un tubo da 50 ml.
        Nota: Assicurarsi che il frammento di tessuto risultante sia inferiore a 1 mm 3 per ogni pezzo. Una resa tipica è di circa 5.000 VESC per animale.
    4. Preparare il substrato di base della digestione in un tubo di centrifuga a capsule da 50 ml al volume di 10 mL per 1 g di tronco di tessuto. Aggiungere la collagenasi tipo 3 alla concentrazione di 300 unità per 10 ml di mezzo di base della digestione per costituire il tampone di digestione. Mescolare in modo uniforme e aggiungerlo al mosto di tessuto.
    5. Posizionare orizzontalmente il tubo centrifuga da 50 ml su una piattaforma a dondolo e impostare la velocità a 100 giri / min e la temperatura a 37 ° C. AgitareIl tessuto mammario per 2 ore. Controllare e scuotere manualmente il tubo ogni 20 minuti per garantire una corretta digestione.
      Nota: Lo scopo della digestione tissutale prima del FACS è quello di preparare una sola cellula soluzione dal tessuto solido. Pertanto, alla fine della digestione, il contenuto dovrebbe essere una soluzione spessa senza pezzi di tessuto visibile.
  2. Preparazione di una sola cellula.
    1. Dopo la digestione, riempire il tubo centrifuga da 50 ml con PBS sterile pre-riscaldato e invertire il tubo per uniformarsi uniformemente. Centrifugare il tubo a 200 xg per 5 min per ottenere un pellet di cellule.
    2. Rimuovere il surnatante e far scorrere il fondo del tubo per allentare il pellet cellulare. Aggiungere 3 ml di tampone di lisi di globuli rossi (vedere tabella dei materiali) e incubare in un cappuccio per la cultura tissutale a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti per eliminare le cellule del sangue rosso.
    3. Aggiungere 10 ml di PBS sterile e invertire il tubo per uniformarsi uniformemente. Centrifugare il contenuto di tessuto a 200 xg per 5 minuti e il discoArd il supernatante. Aggiungere in 3 mL di trypsina pre-riscaldato di 0,05% e conservare il tubo a 37 ° C per 5 minuti per digerire ulteriormente il tessuto rimanente.
    4. Aggiungere in 3 ml di IMDM pre-riscaldato e quindi aggiungere 100 μL di soluzione DNasi I (0,25 mg di DNasi I diluiti in 1 ml di PBS). Conservare il tubo a 37 ° C per rompere i filamenti del DNA. Passare la miscela tissutale attraverso un filtro da 70 μm per ottenere la soluzione cellulare. Sciacquare due volte il filtro con 2 ml di PBS + 5% FBS per neutralizzare la digestione enzimatica.
    5. Centrifugare la miscela cellulare a 200 xg per 5 minuti per far pelliccare le cellule. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di PBS + 5% FBS per la colorazione degli anticorpi.
  3. FACS-based isolamento Procr + VESC.
    1. Soggetta la miscela cellulare ottenuta da tessuto mammario donatore alla colorazione anticorpale seguendo protocolli di routine pubblicati 8 .
      Nota: Sono stati utilizzati gli anticorpi seguenti: anti-mouseAnti-egizio CD31 (PECAM1) -PECY7, anti-mouse CD105-APC (tutti utilizzati a una concentrazione di 1 μg / mL), anti-mouse CD201 (Procr) -biotina (utilizzata ad una concentrazione di 2,5 Μg / mL) e streptavidina-v450 (utilizzata ad una concentrazione di 0,5 μg / mL).
      1. Dopo la colorazione degli anticorpi, superare le cellule con PBS + 5% FBS e poi centrifugare a 200 g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere le cellule con 1 ml di PBS + 5% di FBS. Filtra attraverso un filtro da 40 μm. Posizionare su ghiaccio fino alla classificazione FACS.
    2. Procedere per eseguire l'ordinamento basato su FACS per isolare Procr + VESCs.
      1. Analizzare il campione non colorato e ogni singolo controllo colore per determinare la tensione per ogni colore. Calcolare i parametri di compensazione per evitare la fluorescenza automatica o la colorazione di fondo. Impostare il modello per la corretta gating e l'ordinamento per le popolazioni di celle desiderate.
      2. Per stabilire la gerarchia di ordinamento FACS, prima eliminare i detriti daTutti gli eventi e poi scartare doppiette o cluster di cellule adesive attivando con larghezza. Estrarre le cellule di sangue del sangue e quindi utilizzare CD31 + e CD105 + per definire le popolazioni endoteliali.
        Nota: le cellule Procr + sono state isolate da CD31 + CD105 + ECs rispetto a un controllo FMO. Un diagramma di analisi FACS rappresentativo è mostrato in Figura 1 . Una popolazione VESC isolata da FACS dovrebbe essere sospesa in IMDM + 50% FBS e conservata sul ghiaccio fino all'ulteriore elaborazione.

2. In Vivo VESC Vessel Formation Assay Utilizzando il Mammary Fat Pad

  1. Preparare EC primarie per il trapianto.
    1. Raggiungere le cellule ordinate FACS con 10 ml di PBS + 5% FBS e centrifugare a 200 xg per 5 min per sistemare le cellule fino al fondo.
    2. Aspirare con cura il liquido, contare il numero di cellule usando un emocitometro e risospendere il pellet cellulare con la miscela di matrice a membrana basale (consi50% di matrice di membrana basale e PBS con il 20% di FBS, integrato con 100 ng / mL rmVEGF e 60 E / mL di eparina) per raggiungere una concentrazione di lavoro di 15.000 cellule / 15 μL.
      Nota: la miscela di matrice di membrana basale deve essere sempre conservata sul ghiaccio.
    3. Diluire serialmente le cellule ordinate e contate per raggiungere le concentrazioni di input richieste in un microprocessore da 1,5 ml, assicurandosi che i volumi di iniezione finali non superino di almeno 15 μL. Aggiungere 0,1% Trypan blu ad ogni tubo per una migliore visualizzazione del contenuto durante il trapianto. Pipette accuratamente per mescolare. Conservare i tubi sul ghiaccio fino all'uso.
      Nota: La generazione di navi di successo potrebbe essere raggiunta con un minimo di 100 VESC.
  2. Trascinare EC primari al tampone grasso mammario.
    1. Disinfettare gli strumenti chirurgici e il benchtop. Se si utilizzano gli stessi strumenti su più animali, è possibile utilizzare una sterilizzatrice per la disinfezione.
    2. Anestetizza il 3 settimane BALB / c nude micUtilizzando il protocollo anestetico raccomandato dal veterinario dell'istituzione e dalla IACUC. Posizionare ogni mouse in posizione supina, con la schiena sulla tabella di funzionamento. Immobilizzare le membra utilizzando un nastro adesivo.
    3. Immergere un tampone di cotone in soluzione antisettica a base di iodio. Pulire completamente l'intera zona addominale del mouse per sterilizzare la superficie della pelle prima dell'intervento.
    4. Tenere e sollevare la pelle dell'addome del topo con le pinze. Utilizzare un bisturi chirurgico per eseguire una piccola incisione verticale da 1 cm. Fate due tagli di circa 0,5-1 cm di lunghezza, ciascuno verso la gamba posteriore, per ottenere un'incisione a forma di Y a testa in giù.
      1. Usare la pinza e un tampone di cotone per separare delicatamente la pelle dall'addome e fissare la pelle lateralmente per esporre le ghiandole mammarie inguinali. Posizionare il mouse sotto un stereoscopio e impostare l'ingrandimento su 2.0X. Assicurarsi di regolare la messa a fuoco in modo che il tampone grasso mammario possa essere chiaramente visto e operato.
    5. Posizionare un ago da 27G 1/2 "E sul ghiaccio per pre-chill. Prima di iniziare una siringa da 1 ml con la matrice della membrana basale per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nella regione di attacco dell'ago. Pipettare 15 μL di soluzione mista sul tappo del tubo di microcentrifuga e aspirare l'intero volume nella siringa primerizzata.
    6. Tenere il tampone di grasso mammario davanti al linfonodo inguinale, utilizzando delle pinzette, e sollevare leggermente per una facile iniezione. Inserire delicatamente circa 1/4 dell'ago della siringa nel tampone grasso.
      1. Rilasciare le pinzette dal fodero per impugnare e stabilizzare l'ago a siringa. Iniettare lentamente la soluzione per evitare perdite di liquido. Tenere premuto per alcuni secondi per assicurarsi che la miscela cellulare sia solidificata per ridurre al minimo la perdita durante l'estrazione dell'ago.
    7. Chiudere il flap della pelle con suture assorbibili. Sutura il flap della pelle usando la sutura monofilamento non reattiva di dimensioni 5-0 e chiudi le ferite con nodi di chirurgo, ogni nodo approssimativoA distanza di 0,3 cm. In alternativa, chiudere la pelle con graffette ferite.
    8. I topi gestiti in luogo in una gabbia separata per il recupero. Mettere una lampada di riscaldamento sopra la gabbia per impedire che i topi anestetizzati soffrono di ipotermia. Mettere la carta morbida e il cotone alla base della gabbia per mantenere i topi caldo post-intervento chirurgico.
      1. Osserva attentamente i topi fino a quando tutti i destinatari sono completamente svegli. Per i prossimi giorni, applicare analgesici post-chirurgici in modo preventivo a tutti gli animali o come diretto dal veterinario dell'impianto. Applicare gli antibiotici secondo il protocollo animale approvato se si verifica un'infezione da ferita. Se la ferita chirurgica è stata chiusa con graffette ferite, rimuovere le clip della ferita 10 giorni dopo la chirurgia, quando la ferita è completamente chiusa.

3. Preparazione sintetica del tessuto per osservazione microscopica

  1. Raccolta dei tessuti
    1. A 2 - 4 settimane dopo l'impianto, anestetizza il destinatario BALB / cTopi nude con una iniezione intraperitoneale di agente anestetizzante del 2,5% ad un dosaggio di 0,12 ml per 20 g di peso corporeo, come al punto 2.2.2.
      Nota: La crescita positiva delle vasi può essere rilevata 2 - 4 settimane dopo il trapianto di cellule.
    2. Etichettare la circolazione sistemica del destinatario con una iniezione coda di erbe di colorante isolectin-647 ad un dosaggio di 50 μg / 25 g di peso corporeo, risospeso in 50 μL di PBS sterile. Consentire un periodo di riposo di 5 - 10 min. Sacrificare i topi usando CO 2 .
    3. Disseccare l'area del tessuto mammario in cui le cellule sono state inizialmente iniettate seguendo la fase 2.2.4; Utilizzare forbici chirurgiche. Utilizzando una lama chirurgica, tagliate il tessuto in circa 3 - 4 mm 3 cubi in un piatto di Petri da 6 cm.
  2. La digestione tissutale e la preparazione per la colorazione degli anticorpi.
    1. Digestare i pezzi di tessuto in un tubo di centrifuga da 15 ml riempito con 10 ml di mezzo di base di digestione pre-riscaldato (fase 1.1.2) integrato con collagenasi III(300 U per 10 mL).
    2. Posizionare orizzontalmente il tubo centrifuga da 15 ml su una piattaforma a dondolo con la velocità impostata a 100 giri / min e la temperatura impostata a 37 ° C per circa 1 h per allentare la struttura del tessuto e per eliminare i tessuti adipociti eccessivi.
      Nota: gli adipociti tendono a produrre auto-fluorescenza che potrebbe causare un rumoroso sfondo fluorescente. Alla fine della digestione, i pezzi di tessuto dovrebbero avere un aspetto morbido e nuvoloso. Il periodo di digestione ottimale dipende dalla dimensione dei pezzi di tessuto tritato e pertanto dovrebbe essere adeguato di conseguenza per ottenere i migliori risultati. Poiché la vascolarizzazione del tessuto è già stata etichettata con Isolectin a fluorescenza, tutte le procedure seguenti devono essere eseguite protette dalla luce.
    3. Lavare i pezzi di tessuto con PBS a RT per 10 min. Fissare il tessuto a tutto tondo, posizionando con cura i pezzi in un piatto di Petri da 6 cm in pieno con 4% PFA (pH 7,2 - 7,4) per preservare la fluorescenza. Posizionare il piatto di PetriSu una piattaforma a dondolo e agitare delicatamente il tessuto per 30 minuti a RT.
      Nota: il PFA è cancerogeno e deve essere manipolato con cautela.
    4. Rimuovere il restante PFA e lavare il tessuto fisso tre volte con un tampone di lavaggio interamente montato (0,1% in PBS), con un intervallo di 10 minuti tra ogni lavaggio.
  3. Colorazione anticorpale tissutale integrale.
    1. Diluire l'anticorpo primario nel tampone di colorazione degli anticorpi in un tubo da centrifuga da 2 ml. Incubare il tessuto con anticorpo primario per una notte a 4 ° C.
      Nota: gli anticorpi primari sono stati utilizzati come anticorpi anti-CD31 (concentrazione: 10 μg / mL) o anti-VE-cadherina (CD144 / Cdh5; concentrazione: 2,5 μg / mL). Sia CD31 che VE-Cadherin sono marcatori di superficie cellulare utilizzati per riconoscere l'endotelio. Viene preparato un tampone di colorazione anticorpale da 5x con 500 mM acido maleico, pH 7,5; 750 mM NaCl; E 0,5% (v / v) si dissolvono in PBS. Aggiungete solo un volume appropriato di siero (5%) durante la preparazione di una soluzione di lavoro fresca 1x9 .
    2. Rimuovere il tampone di colorazione degli anticorpi e lavare il tessuto di montaggio per tre volte con il tampone di lavaggio, con un intervallo di 10 minuti. Incubare il tessuto con anticorpo secondario (vedere la tabella dei materiali ) più DAPI a RT per 4 ore su una piattaforma a dondolo o per una notte a 4 ° C.
      Nota: Utilizzare DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) ad una concentrazione finale di 5 μg / mL per visualizzare i nuclei.
    3. Lavare il tessuto interamente montato con il tampone di lavaggio 3 volte per 10 minuti ciascuno. Incubare i tessuti in 80% di glicerolo o 80% di saccarosio durante la notte per disidratare il tessuto per una migliore conservazione.
    4. Posizionare i singoli pezzi di tessuto su uno scivolo in vetro e rimuovere l'eccessivo tampone di disidratazione. Coprire il tessuto con il supporto di montaggio, mettere un coperchio e spremere delicatamente il tessuto per impostarlo.
    5. Effettuare l'acquisizione di immagini microscopiche confocali. Per le ghiandole mammarie intere, acquisite immagini usando un 40X con NAI = 1.3 oggetti oliove. Acquisisci le scansioni di piastrelle di Z-stack a una risoluzione di sezione ottica di 1.024 x 1.024 e una separazione di strato da 1.0 a 1.2 μm.
      Nota: per catturare il segnale luminoso della luce di fluorescenza, lo splitter del filtro deve essere impostato su triplo dicroico (TD) 488/553/638, con l'impostazione di guadagno a PMT Gain 600-800. Devono essere utilizzate le seguenti fonti di eccitazione / emissione: mGFP, con massimi di eccitazione / emissione di 488/509 nm; MTomato con massimi di eccitazione / emissione di 532/588 nm; Alexa-647, con massima di eccitazione / emissione di 594/665; E DAPI, con maxi di eccitazione / emissione di 350/470.

4. Tracciatura di lineage utilizzando un modello di mouse modificato geneticamente

  1. Rileva Procr + VESC usando il modello del mouse.
    1. Utilizzare il ceppo del mouse Knock-in di Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (indicato come Procr CreERT2 ).
      Nota: In questo modello del mouse, una cassetta CreERT2-IRES-tdTomato 10 viene inserito dopo il primo codone ATG di Procr 11 .
      1. Cross Procr CreERT2 topi con il Rosa26 mTtomatomGFP (indicato come R26 mTmG ) ceppo di reporter per tracciare il destino di Procr + ECs endogeno in vivo 11 . Identificare tutti gli endogeni Procr + ECs etichettati e il loro discendente utilizzando l'espressione GFP.
    2. Somministrare soluzione tamoxifene 11 (10 mg di tamoxifene disciolto in 1 ml di olio di arachidi + 10% di etanolo per costituire una soluzione di scorta di 10 mg / ml) intraperitonealmente ad una dose di 4 mg / 25 g di peso corporeo durante la fase pubertalica (5 settimane Vecchio) per seguire il destino dello sviluppo di Procr + ECs.
    3. Analizzare l'efficienza di clonazione delle cellule etichettate mediante l'immunostaining mantenuta a monte secondo le fasi di preparazione descritte al punto 3. Ottenere i rilievi di grasso mammario da topi trattati sia dopo brevi periodi (2 giorni) e periodi prolungati (fino a 10 mesi). Vedere la Figura 3 .

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Risultati

Isolamento VESC mammarie:

Per isolare la popolazione endoteliale per il successivo saggio di trapianto, le ghiandole mammarie del mouse vergine mature (8 settimane) sono state raccolte come materiale donatore. Le cellule endoteliali sono state isolate usando una tecnica di selezione delle cellule a base di anticorpi. I diagrammi rappresentativi dell'analisi FACS della popolazione VESC in ECs di ghiandola mammaria C57BL / 6 di...

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Discussione

I dosaggi di angiogenesi rappresentano un buon approccio sperimentale per studiare la dinamica vascolare. La vasculatura retinica del mouse, che si sviluppa dopo la nascita, si è dimostrata un modello attraente per studiare l'angiogenesi 12 . Nonostante sia relativamente accessibile, la manipolazione effettiva all'interno del letto vascolare della retina è piuttosto difficile. Finora, il trapianto in vivo meglio descritto è stato il test di spina, che racchiude celle all'inte...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation della Cina (31530045 e 31371500 a YAZ, 31401245 a QCY), dal Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2014CB964800), dall'Accademia Cinese delle Scienze (XDB19000000 a YAZ) e dai cinesi Società di Biologia cellulare (Early Career Fellowship to QCY).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% Tripsina-Etilene Diammina Acido Tetraacetico (EDTA) (1x)Gibco (Life Technologies)25300-0620,05% Tripsina
0,22 &; m Unità di filtraggioMerck Millipore Ltd.SLGP033RB0,22 µ m
Filtro 2-Metilbutanolo-2, ReagentPlusSigma-Aldrich24, 048-6Tert Amyl Alcohol
222, TribromethanolSigma-AldrichT48402-25g222, Tribromethanol
4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI)InvitrogenD1306DAPI
70 &; m Filtro cellulareBD FAL35235070 µ m Filtro cellulare
Adesione Vetrini per microscopioCITOGLAS188105Vetrini
Anti-topo CD105 APCeBioscience17-1051-82, clone MJ7/18per l'uso dell'analusi FACS a 1 &; g/mL
Anti-topo CD201 BiotinaeBioscience13-2012-82per l'uso dell'analusi FACS a 2,5 &; micro; g/mL
Anti-topo CD31 PE-Cianina 7eBioscience25-0311-82, clone 390per l'uso di analusi FACS a 1 µ g/mL
BD FACSJazz Cell SorterBD Biosciences655489FACS Albumina
siero bovinoSigma100190332BSA
CentrifugaEppendorf5810R
Centrifuga Collagenasi tipo 3Worthington-Biochem#LS004183Collagenasi III
Microscopia confocaleLeicasp8Confocale
Desossiribonucleasi I da pancreas bovinoSigmaD2463-5VLDnase I
Donkey anti-Rat Cy3Jackson ImmunResearch712-165-150Anticorpo secondario, uso a 0,5 µ g/mL
Dumont ForcipeWPI500342Froceps
Dumont Forcipe - Punte micro-smussateFST11253-20
Pinze Fetale Siero bovino fetaleHycloneSH30396.03FBS
FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119BioLegend78022Cocktail di linea di sangue per analisi FACS, utilizzare a 25 & micro; L per test
GliceroloSigmaG6279Glicerolo
Iscov's Modified Dulbecco's MediumGibco (Life Technologies)12440-053IMDM
Isolectin GS-IB4 da Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora  647InvitrogenZ32450Isolectin-647
Matrigel  Matrice (fattore di crescita ridotto)BD356231Matrigel
Ceppo di topo (Actin-GFP)Jax Laboratories3773Actin-GFP
Ceppo di topo (C57BL/6)SLACC57BL/6C57BL/6
Ceppo di topo  (BALB/c nudo)SLACBALB/c nudoTopi nudi
ParaformaldeideSigmaP6148PFA
Penicilina StreptomicinaGibco (Life Technologies)5140-122Pen/Strep
Fosfato Soluzione salina tamponata (pH7.2) 1xGibco (Life Technologies)c20012500BTPBS
PRIM1640Gibco (Life Technologies)c11875500CPPRIM1640
Reagente antidissolvenza ProLong GoldLife TechnologiesP36934Mezzo di montaggio
Rat anti CD144BD Biosciences550548per analisi a montaggio intero, anti-VE-Caderina / Cdh5 antibdy per giunzione stretta endoteliale, utilizzare a 2,5 &; micro; g/mL
Rat anti CD31-biotinaBD Biosciences553371per analusis a montaggio intero, anticorpo anti-CD31/PECAM1 per molecola di adesione della superficie endoteliale, uso a 10 µ g/mL
Tampone per lisi dei globuli rossiSigmaR7767-100MLTampone per lisi dei globuli rossi
Dritto/Affilato-Blunt/10cmFST14028-10Forbici fini
Streptavidina eFluor 450eBioscience48-4317-82per l'analisi FACS utilizzare a 0,5 e micro; g/mL
TamoxifenSigma101551374TAM
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-250MLTritonX
Seta intrecciata rivestita di cera (Taglia 5-0 USP (1 metrica), 18 pollici (45 cm) NERO su ago C-1)COVIDIENS1173Sutura 
Scaplels monouso sterileSwann Morton# 10Bisturi
BetadineYifeng Medical20160101Soluzione antisettica
di

Riferimenti

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